AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

지주막하 바이러스 주입을 사용하는 아데노 관련 바이러스의 광범위한 전달을 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 이 방법은 표재층에서 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장할 뿐만 아니라 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 5층 피라미드 뉴런에서 전이유전자의 선택적 발현을 초래합니다.

재조합 아데노 관련 바이러스는 실험 생물학의 많은 영역, 특히 신경 과학에서 다양한 관심 유전자의 전달 및 발현을 위한 유연하고 강력한 도구입니다. 특정 뇌 영역에서 원하는 전이유전자의 발현을 유도하는 가장 인기 있는 방법은 AAV 벡터를 뇌 실질에 직접 주입하는 것입니다. 그러나 이 방법은 일부 생체 내 실험에 필요한 광범위한 신경 세포 전달을 허용하지 않습니다. 이 기사에서는 뇌의 지주막하 공간으로의 바이러스 주입을 기반으로 마우스 신피질에서 광범위한 유전자 발현을 위한 새로운 기술을 제시합니다. 이 뉴런 라벨링 방법은 성체 마우스의 표재성 신피질층에서 뉴런의 광범위한 transduction을 보장할 뿐만 아니라 CAG와 같은 강력한 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 높은 특이성을 가진 높은 특이성을 가진 많은 5층 피라미드 뉴런 집단에서 transgene의 발현을 초래합니다. 더욱이, 세포 형질도입은 주사 부위로부터 상당한 거리에서 이루어지기 때문에, 이 방법은 뉴런 활동의 차후 광학적 또는 전기생리학적 기록을 위해 뇌 조직을 보존하는 데 도움이 될 수 있습니다.

포유류의 뇌는 수조 개의 시냅스에 의해 회로로 상호 연결된 많은 억제 세포, 흥분성 세포, 조절 세포로 구성되어 있습니다¹. 신경과학의 핵심 과제 중 하나는 뇌 회로와 행동의 조직과 기능에서 뚜렷한 세포 유형의 역할을 해독하는 것입니다. 뇌 내에서 유전적으로 정의된 세포를 조작하려면 전이유전자를 도입하고 발현하는 방법이 필요합니다. 바이러스 기반 유전자 전달 시스템은 중추 신경계로 유전자를 전달하는 가장 효과적이고 간단한 방법입니다². 바이러스 전달 시스템은 유전 정보를 숙주 세포에 전달할 수 있는 능력을 가진 복제 바이러스(아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 및 레트로바이러스)를 기반으로 합니다 ^2,3.

AAV 기반 벡터는 이제 기초 신경과학 연구 목적과 신경 질환에 대한 유전자 요법을 개발하기 위해 뇌 내 세포에 원하는 전이유전자를 전달하는 데 가장 널리 사용되는 도구 중 하나가 되었습니다. 다른 바이러스와 비교할 때, 복제 결함 AAV는 이러한 목적에 이상적인 벡터가 되는 많은 기능을 가지고 있습니다. 특히 AAV vector는 뉴런 및 신경교세포와 같은 비분열(말단 분화) 세포를 효율적으로 transduction하여 in vivo²에서 높은 수준의 transgene 발현을 제공합니다. 벡터는 in vivo 사용 ^3,4,5에 적합한 고기능성 역가에서 쉽게 생산할 수 있습니다. 중요한 것은 아데노 관련 바이러스 매개 유전자 in vivo 전달이 조직병리학적 변화 및 벡터 관련 독성을 일으키지 않는다는 것입니다⁶. 아데노바이러스 벡터와 달리, 동물 모델에서 AAV 벡터의 생체 내 투여는 일반적으로 형질도입된 세포에 대한 숙주 면역 반응을 유도하지 못하므로 장기간 동안 뇌 실질 내에서 안정적인 전이유전자 발현이 가능합니다 ^2,7,8.

AAV 벡터가 인기 있는 또 다른 이유는 고유한 조직 및 세포형 tropisms 9,10,11,12,13,14를 가진 광범위한 AAV serotype입니다. 서로 다른 AAV serotype에 의해 발현되는 뚜렷한 capsid 단백질은 세포 진입을 위해 서로 다른 세포 표면 수용체를 사용하게 되며, 따라서 특이적 tropisms^10,14를 생성합니다.

AAV tropism은 capsid proteins뿐만 아니라 다른 많은 요인에 의해 결정된다¹⁴. AAV 혈청형 1, 2, 6, 7, 8 및 9는 1차 배양에서 뉴런과 성상세포를 모두 형질도입했지만^(15,16), 실질내 뇌 주입 후 강한 뉴런 트로피즘을 나타냈습니다 ^17,18. AAV 벡터 준비에 사용되는 방법은 동일한 혈청형에 대해서도 신경 세포 영양성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, CsCl-purified AAV8은 뇌실실내 주사 후 강력한 성상아교세포(astroglial tropism)를 가졌던 반면, 동일한 조건에서 주입된 iodixanol-purified AAV8은 뉴런만 transduction했다¹⁹. AAV tropism은 또한 주입 된 용량과 볼륨¹⁴의 영향을받을 수 있습니다. 예를 들어, 높은 역가 rAAV2/1은 대뇌피질 흥분성 뉴런과 억제성 뉴런 모두를 효율적으로 형질전환시켰지만, 낮은 역가의 사용은 피질 억제 뉴런의 형질도입에 대한 강한 선호를 드러냈다²⁰.

따라서 capsid serotype만을 기반으로 강력한 세포 유형 특이성을 달성할 수 없습니다. 세포 유형 특이적 프로모터는 AAV 캡시드의 광범위한 자연 영양성을 극복하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 인간 synapsin I은 뉴런을 표적으로 하는 데 사용된다²¹, CaMKII promoter는 높은 특이성²⁰으로 glutamatergic excitatory neuron에서 전이유전자 발현을 유도할 수 있다 20, ppHcrt promoter는 외측 시상하부(lateral hypothalamus²²)에서 하이포크레틴(HCRT)을 발현하는 뉴런을 표적으로 하고, PRSx8 promoter는 도파민 베타-하이드록실라제(dopamine beta-hydroxylase)²³를 발현하는 노르아드레날린성 뉴런 및 아드레날린성 뉴런을 표적으로 하며, GFAP promoter는 성상세포 특이적 발현을 유도할 수 있다²⁴. 그러나 일부 세포 특이적 promoter는 전사 활성이 약하고 충분한 수준의 전이유전자 발현을 유도할 수 없습니다²⁵. 또한, AAV 바이러스 벡터에 맞는 short promoter는 종종 세포 유형 특이성을 유지하지 않습니다 ^1,26. 예를 들어, CaMKII 구조체는 또한 억제성 뉴런¹²을 형질전환한 것으로 나타났습니다.

세포 유형 특이성(tropism) 외에도 AAV의 또 다른 중요한 특징은 transduction efficiency입니다. 다양한 AAV serotype은 서로 다른 확산 특성을 가지고 있습니다. AAV2 및 4개의 바이러스 벡터는 뇌 실질(brain parenchyma)을 통해 쉽게 확산되지 않기 때문에 더 작은 영역에 걸쳐 transduction을 매개합니다^17,27. 가장 널리 퍼진 신경세포 형질도입은 AAV 혈청형 1, 9 및 rh.10 11,17,18,19,28에서 관찰됩니다.

특정 뇌 영역에서 원하는 전이유전자의 발현을 유도하는 가장 인기 있는 방법은 AAV 벡터를 관심 뇌 영역(실질)에 직접 주입하는 것입니다³. 실질내 주사 후, 뇌를 통한 보다 효과적인 확산을 가진 AAV 혈청형조차도 일반적으로 주사 부위 주변의 국소 영역만 형질전환을 합니다 ¹². 더욱이, 실질내 주사는 침습적 시술이며 관심 부위에 인접한 조직 손상을 유발합니다. 따라서 이 바이러스 주입 방법은 일부 실험 작업에 적합하지 않습니다. 예를 들어, 세포의 광범위한 라벨링은 1 광자 또는 2 광자 현미경의 사용을 포함하여 자유롭게 움직이는 동물의 피질 뉴런 기능을 연구하는 것을 목표로 하는 실험에서 매우 바람직합니다 29,30,31,32.

여기에서는 지주막하 바이러스 주입을 사용하여 성체 마우스의 신피질 뉴런에 대한 광범위한 전달을 제공하고 뉴런 활동의 후속 광학 또는 전기 생리학적 기록을 위해 뇌 조직을 보존하는 새로운 아데노 관련 바이러스 주입 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 표재성 신피질층에서 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장했을 뿐만 아니라 CAG와 같은 강력한 비선택적 프로모터를 사용할 때에도 높은 특이성을 가진 5층 피라미드 뉴런의 대규모 집단에서 전이유전자의 발현을 초래했습니다.

실험은 암수 2-4개월의 성체 C57Black/6 마우스에서 수행되었습니다(Pushchino Breeding Center, RAS의 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry 분과). 생쥐는 온도 조절이 가능한 사육장(22°C ± 2°C, 12시간 라이트/다크 사이클, 08:00시에 점등)에 음식과 물을 자유롭게 수용했습니다. 모든 실험 절차는 동물 실험에 대한 ARRIVE 지침 및 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 IHNA RAS의 윤리 위원회(2022년 2월 1일부터 프로토콜 N1)의 승인을 받았습니다. 동물의 고통을 최소화하고 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 수술 준비

1. 수술을 시작하기 전에 모든 수술 기구를 소독하십시오. 70% 에탄올을 사용하여 수술 부위를 청소합니다.
2. 마취 시스템의 이소플루란 수치를 확인하고 필요한 경우 채웁니다. 인덕션 챔버 바닥에 깨끗한 종이 타월을 놓습니다.
3. 입체성 프레임에 가열 패드를 놓습니다. 깨끗한 종이 타월로 패드를 덮습니다.
4. 2% 표백제가 든 병을 준비하여 마이크로피펫 팁, 튜브, 면봉 및 바이러스와 접촉하는 기타 품목을 수집합니다.
5. -80 °C 냉동고에서 AAV 분취액을 꺼내 얼음 위에 올려 해동합니다.

2. 주사기 준비

1. 5μL Hamilton 마이크로주사기를 33G 뭉툭한 RN 바늘로 세척합니다. 흡입 후 70% 에탄올을 분주합니다. 신선한 에탄올로 3번 반복합니다. 주사기를 증류수로 헹구어 과도한 에탄올을 제거합니다. 3회 반복합니다.
2. 플런저를 꺼내 인슐린 주사기를 사용하여 플랜지를 통해 배럴에 바셀린 오일을 채웁니다. 마이크로 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.
   참고: 갇힌 공기는 압축할 수 있으며 주사기의 정확도와 정밀도에 영향을 미칩니다.
3. 플런저를 마이크로 주사기에 다시 넣고 오일 한 방울을 분배합니다. 주사기를 입체택시 주입기에 넣어 분주된 용액의 양을 모니터링하기 위해 스케일이 보이도록 합니다.

3. 수술용 마우스 준비

1. 마우스의 무게를 잰다. 마우스를 이소플루란에 연결된 마취 유도실에 넣습니다. 5%로 설정된 이소플루란 기화기를 켜고 유속을 250mL/분으로 조정합니다. 적절한 마취 깊이는 5-7분 이내에 이루어집니다.
2. 수술 마취 수준을 확인하려면 뒷발이 고통스럽게 꼬집는 동안 휘젓는 것과 금단 반사가 없는지, 눈을 마주쳤을 때 눈을 깜박이지 않는지 확인하십시오.
3. 기화기 유출 밸브를 유도 챔버에서 입위 마스크로 전환합니다. 이소플루란을 1.8%-2.0%로 낮추고 마우스 무게에 따라 유속을 설정합니다(체중이 25-35g 사이인 마우스의 경우 70-90mL/분).
4. 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 가열 패드(37°C) 상단의 정위 장치에 올려 놓고 외과적 마취 중 저체온증을 예방합니다. 앞니를 치아 막대에 놓고 동물 마스크를 장착합니다.
5. 동물을 이어바에 조심스럽게 놓습니다. 정위 장치에서 올바른 머리 위치는 머리의 수직 이동을 허용하지만 측면 이동은 허용하지 않습니다. 동물의 위치가 고통을 유발하지 않는지 확인하십시오. 수술 내내 마취 깊이, 동물 호흡 및 체온을 주의 깊게 모니터링하십시오.
6. 눈에서 귀 뒤까지 머리를 면도합니다. 면도한 머리 표면을 70% 에탄올로 닦은 다음 5% 알코올 요오드 용액으로 닦습니다.
7. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안과용 젤을 바르십시오. 4% 리도카인 용액을 국소적으로 바르고 덱사메타손(4mg/mL에서 0.02mL)을 피하주사하여 수술 관련 통증을 예방하고 가능한 염증 반응을 줄입니다.
8. 멸균 메스 날과 가위로 머리 정중선을 따라 4-5mm 길이의 절개를 만들어 두피를 엽니다. 귀 사이를 작게 절개한 다음 두개골 손상을 방지하기 위해 가위를 사용하여 확대합니다.
9. 소량의 3% 과산화수소로 두개골 표면을 닦아 입체택시 랜드마크인 브레그마(bregma)와 람다(lambda)를 시각화합니다. 즉시 0.9% NaCl 식염수로 반응을 중지하십시오. 뼈 스크레이퍼로 두개골 위의 조직을 긁어냅니다.
10. 미리 준비된 전동 인젝터를 Hamilton 주사기와 함께 입체 암에 장착합니다. 수술용 광원을 노출된 두개골에 집중시키고 현미경을 브레그마에 초점을 맞춥니다.
11. 현미경을 통해 정위 장치의 암을 조작하여 바늘 상단이 브레그마 바로 위의 중앙에 오도록 합니다.
12. 바늘 끝을 사용하여 브레그마와 람다를 수평으로 정렬한 다음 팔을 다시 브레그마로 이동하고 좌표를 기록합니다. 이러한 브레그마 좌표와 관심 영역의 아틀라스 좌표를 사용하여 대상 영역의 상대 좌표를 계산합니다.
13. 바늘을 대상 부위로 이동합니다. 새 좌표에서 바늘을 내리고 이 위치를 표시합니다. 바이러스의 확산을 고려하여 대상 부위에 가까운 바이러스 미세주입 부위를 선택합니다.
    알림: 이렇게 하면 관심 영역의 조직이 손상되는 것을 방지할 수 있습니다. 관심 영역에 대해 AP-3.4, ML -2.0 및 바이러스 미세주입에 대해 AP-2.0, ML -1.4 좌표를 사용했습니다. 위의 좌표는 1차 시각 피질 뉴런이 감염되는 경우 최적입니다.
14. 가능하면 혈관이 큰 부위를 피하십시오. 수술용 현미경, 밝고 차가운 빛 조명, 0.9% NaCl 식염수 침지 아래에서 두개골과 뇌 표면의 큰 혈관이 뚜렷해야 합니다.

4. 바이러스 주입

1. 멸균 치과 버 (직경 0.5-0.8mm)를 가져 가십시오. 수술용 현미경을 통해 두개골 표면을 보고 수동으로(손으로) 또는 마이크로 드릴을 사용하여 작은 개두술을 뚫습니다. 두개골에 과도한 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
2. 개두술(구멍)을 뚫는 동안 마이크로 주사기 바늘의 손상을 방지하기 위해 팔을 방해가 되지 않도록 움직입니다. 0.9% NaCl 식염수를 담그고 간헐적으로 일시 중지하여 뼈가 가열되고 경막이 손상되지 않도록 합니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 가루를 날려 버리십시오.
   참고: 다음 유형의 카바이드 치과 버가 적합합니다: 배 모양(바람직하게는), 둥근 실린더 및 원형.
   1. 버로 뼈를 얇게 할 때 얇아짐이 전체 둘레에 걸쳐 균일하게 이루어져야 합니다. 이렇게 하면 경막을 손상시키지 않고 뼈를 더 쉽게 제거할 수 있습니다. 이렇게하려면 처음에는 둥근 끝이있는 버를 사용한 다음 평평한 팁이있는 버를 사용하십시오. 버를 뼈에 수직으로 유지하십시오. 그렇지 않으면 한쪽이 다른 쪽보다 얇아집니다.
      참고: 또한 버의 크기가 작을수록 수행된 개두술이 작을수록 조작이 더 복잡해집니다. 생체 내 작업을 위해 동물을 더 사용할 때 더 작은 직경(0.5-0.6mm)의 개두술을 수행하는 것이 좋습니다. 생체 외 작업을 위해 동물의 뇌를 사용할 계획이라면 절차를 단순화하기 위해 더 큰 개두술 직경이 허용됩니다.
3. 얇아진 뼈가 부드럽고 투명해지면 드릴링을 중지하십시오. 뼈에 충분히 큰 움푹 들어간 곳이 형성되면 자주 회전을 중지하고 뼈의 두께를 모니터링합니다. 뼈에 균열이 나타나는 것은 얇아지는 것으로 충분하다는 것을 나타냅니다.
4. 멸균 식염수로 구멍을 닦은 다음 면봉으로 여분의 식염수를 제거하십시오. 끝이 갈고리 모양인 27G 바늘 및/또는 끝이 가는 핀셋을 사용하여 뼈의 나머지 층을 제거합니다. 경막이 손상되지 않도록 하십시오.
5. 식염수를 적신 멸균 종이 타월로 두개골 표면을 덮으십시오. 종이 위의 마우스 두개골 표면에 깨끗하고 투명한 필름 조각을 놓습니다.
6. 입체식 암을 뒤로 움직이고 마이크로 주사기 바늘을 필름 바로 위에 놓습니다. 2 μL의 부피에 도달할 때까지 여분의 오일을 분배합니다.
   알림: 오일의 최종 부피는 마이크로 주사기의 부피에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 5 μL 75-RN Hamilton 마이크로 주사기를 사용했습니다.
7. 주입된 부피와 동일한 부피의 바이러스 + 2 μL를 투명 필름 조각에 피펫팅합니다.
8. 수술용 현미경을 통해 바늘 끝이 바이러스 방울의 중앙에 올 때까지 팔을 내립니다. 전동 주입기를 사용하여 바이러스를 마이크로 주사기에 로드합니다. 마이크로피펫의 끝과 투명 필름을 2% 표백제를 탄 병에 버립니다.
9. 두개골 표면에서 식염수가 적신 종이를 제거하고 면봉으로 두개골을 말리십시오. 입체 암을 사용하여 삽입 부위 위에 바늘을 놓습니다.
10. 바늘이 막히지 않았는지 확인하기 위해 바이러스 한 방울을 떨어뜨립니다. 팁이 갈고리 모양의 30G 바늘을 사용하여 경막에 작은 슬릿을 만듭니다.
    참고: 경막에 가능한 한 가장 작은 슬릿을 만들어 바늘과 경막 사이에 바이러스가 누출될 수 있는 틈을 남기지 않고 바늘이 들어갈 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
11. 주사기의 바늘을 경막까지 내리고 깊이를 적절하게 계산합니다. 바늘이 피질 표면에 처음 닿은 지점을 기준으로 삽입의 피질 깊이를 추정합니다.
12. 바늘 끝을 300μm 깊이까지 피질에 천천히 삽입합니다. 경막이 바늘에 부착될 때까지 2-3분 정도 기다린 다음 바늘을 200μm 깊이까지 천천히 집어넣습니다. 뇌 조직이 안정될 때까지 2-3분 더 기다립니다. 그 결과 바늘이 경막을 위로 당겨 바이러스가 퍼질 수 있는 경막하 공간을 만듭니다.
    알림: 피질 손상을 최소화하려면 33G 바늘 또는 아래쪽 G 바늘을 사용하십시오. 팁의 내경이 작을수록 조직 역류가 막힐 가능성이 높아진다는 점을 명심하십시오. 뭉툭한 바늘은 더 통제된 바이러스 용액을 한 방울 떨어뜨리기 때문에 비스듬한 바늘 대신 뭉툭한 바늘을 사용하는 것이 중요합니다.
    1. 바늘을 150-200 μm로 낮췄을 때 경막을 통과하지 못하고 대신 구부리면 낮추기를 중지하십시오. 바늘을 들어 올려 경막을 약간 크게 절개한 다음 다시 바늘을 내려 보십시오.
    2. 바늘을 내리는 동안 절개 부위에서 뇌척수액이 활발하게 누출되기 시작하면 누출이 멈출 때까지 기다립니다. 그렇지 않으면 경막을 통과하는 바늘을 제어하기 어렵습니다. 과도한 뇌척수액을 티슈 끝으로 닦아냅니다. 액체의 흐름이 멈추면 바늘을 들어 올리고 다시 시도하십시오.
13. 0.06μL/분의 속도로 바이러스 현탁액을 주입하면서 분주된 부피를 모니터링합니다. 1μL의 바이러스를 주입합니다. 바늘과 피질 조직 사이의 밀봉이 깨지지 않도록 단일 깊이에서 바이러스를 주입합니다.
    1. 문제 해결: 주사 초기에 뇌 표면으로의 바이러스 역류가 발생할 수 있습니다. 주입을 중지하고 2-3분 정도 기다린 다음 바이러스 주입을 계속합니다. 바이러스 역류가 중지될 때까지 이러한 작업(단계)을 반복합니다. 바이러스와 뇌척수액이 바늘에 달라붙어 역류를 방지합니다.
    2. 바이러스 역류를 막는 또 다른 방법은 피질 표면에 소량의 아가로스를 바르는 것입니다. 그것은 피질의 맥동을 억제하고 바늘을 밀봉하는 데 도움이 될 것입니다. 그러나 피펫이 아가로스에 의해 막히지 않았는지 확인하십시오.
    3. 바늘을 내리면 바늘이 경막을 완전히 통과하지 못하고 부분적으로만 통과할 수 있기 때문에 바늘의 한쪽 면이 경막에 단단히 맞지 않을 수 있으며, 이로 인해 바이러스가 역류할 수 있습니다. 이 경우 조직에서 바늘을 천천히 빼낸 후 다시 내려보세요.
14. 주입이 완료되면 바늘을 목표 위치에 10분 더 유지합니다. 이렇게 하면 바이러스가 주사 부위에서 멀리 퍼질 수 있습니다. 바이러스가 주삿바늘 밖으로 다시 쏟아져 나오는 것을 방지하기 위해 뇌에서 바늘을 천천히 빼냅니다.
15. 바늘 빼기가 완료되면 소량의 바이러스를 분사하여 막히지 않았는지 확인하십시오. 5-0 흡수성 또는 비흡수성 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.

5. 수술 후 관리

1. 절개 부위를 봉합한 후 항균 연고를 국소적으로 바릅니다. 식염수(5mL/kg)와 포도당 5%(5mL/kg)를 혼합하여 피하주사하여 탈수를 방지하고 마취 후 회복을 용이하게 합니다. 케토프로펜을 근육 주사(2.5mg/kg)하여 통증을 줄입니다.
2. 동물을 발열 패드 위에 있는 새 케이지에 넣고 마취에서 회복될 때까지 모니터링합니다. 쥐가 반응하면 동물을 집 우리에 넣습니다.

6. 조직학

1. 바이러스 주입 후 21일 이내에 3단계에서 설명한 대로 이소플루란으로 마우스를 심층 마취합니다.
2. 흉부를 따라 좁은 가위를 이용하여 정중선(10-15mm)을 절개하여 흉강을 노출시킵니다. 조심스럽게 횡격막을 분리하고 가위를 사용하여 가슴을 엽니다.
3. 좌심실에 22G 1 1/2 바늘을 삽입하고 가위로 우심방을 절개합니다. 50mL의 사전 냉각된 100mM 인산염 완충 식염수(PBS)와 사전 냉각된 10% 완충 포르말린 100mL를 관류합니다.
4. 쥐의 뇌 전체를 조심스럽게 추출합니다. 이렇게하려면 가위를 사용하여 두피 중앙을 따라 시상 절개를 만드십시오. 다음으로, 시상과 양봉 봉합사의 교차점에서 시작하여 코뼈까지 앞으로 나아가는 평평한 끝이 있는 뼈 플라이어를 사용하여 두개골 뼈를 하나씩 제거합니다. 뇌가 노출되면 후각구를 잘라내고 구부러진 주걱으로 뇌를 풀어낸 다음 10% 완충 포르말린이 들어 있는 50mL 튜브에 떨어뜨립니다.
5. 하룻밤 사이에 뇌를 고치십시오. 조직 접착제를 사용하여 Vibratome의 금속 플랫폼에 뇌 조직을 장착합니다. 탄소강 블레이드를 사용하여 50μm 두께로 정면 부분을 절단합니다.

7. 면역 염색

1. 1일차
   1. 0.3% Triton X-100(PBS-T)이 함유된 PBS 1개로 뇌 절편을 각각 5분씩 3회 세척합니다. PBS-T의 절편을 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
   2. 1x PBS에서 5% Normal Goat Serum(NGS)과 0.3% Triton X-100으로 구성된 차단 버퍼를 사용하여 RT에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단합니다.
   3. 차단 완충액에서 1:500으로 희석된 파브알부민 또는 칼빈딘에 대한 1차 항체를 사용하여 4°C에서 밤새 절편을 배양합니다(1x PBS에서 5% NGS 및 0.3% Triton X-100).
2. 2일차
   1. PBS-T에서 3분 동안 섹션을 10번 세척합니다. 차단 버퍼(1x PBS에서 5% NGS 및 0.3% Triton X-100)에 1:500으로 희석된 2차 항체(Goat anti-Rabbit IgG(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546)를 RT에서 2시간 동안 암흑 속에서 배양합니다.
   2. 3x PBS에서 각각 5분 동안 섹션을 1회 세척합니다. 부드러운 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드로 옮깁니다.
   3. 즉시 0.1mL의 페이드 방지 마운팅 매체를 각 섹션에 추가합니다. 22mm x 50mm 커버슬립으로 슬라이스를 덮습니다.
   4. 컨포칼 현미경을 20x 또는 60x(A/1.4, 오일)의 배율로 구성합니다. 488nm 및 594nm 파장 레이저를 사용하여 관심 뇌 영역의 다중 채널 이미지를 획득합니다.

일련의 파일럿 실험에서 우리는 CaMKII 프로모터 아래에서 EGFP 형광 단백질과 융합된 빠른 채널로돕신(oChIEF) 유전자를 운반하는 AAV2에 의해 마우스 신피질의 5층 피라미드 뉴런을 형질전환하기 위해 전통적인 피질내 주입 방법을 사용했습니다. AAV2¹²의 특징과 일치하게, 우리는 너비가 1mm를 초과하지 않는 비교적 작은 감염 영역을 얻었습니다(그림 1A). 그러나 일부 실험에서는 AAV2가 비정상적으로 크게 퍼지는 것을 관찰했으며, 일부 사례에서는 뇌 반구의 절반 이상의 신피질을 덮고 있었습니다(그림 1B). 우리는 바이러스가 지주막하 공간으로 들어가고 뇌척수액(CSF) 흐름이 바이러스 벡터를 뇌 표면 전체에 퍼뜨릴 때 이러한 광범위한 바이러스 분포가 발생할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 우리는 주사 바늘 삽입 깊이가 작고(<200μm) 경막 소재의 구멍 크기가 바늘의 직경과 정확히 일치하여 바이러스 입자의 현탁액이 역류하는 것을 방지할 때 이러한 현상이 발생한다는 점에 주목했습니다. 이 과정을 시각화하기 위해 주입된 바이러스 입자(n = 3 마우스)의 현탁액에 적색 형광 나노 입자를 추가했습니다. 주사 후 3주가 지난 시점에, 생쥐에게 10% 완충된 포르말린을 심 경으로 관류하고, 경막을 손상시키지 않고 두개골에서 뇌를 조심스럽게 제거하였다. epifluorescence 쌍안 현미경으로 전체 뇌를 검사한 결과, 녹색 형광 채널에서 볼 수 있는 신경 감염 영역을 약간 초과하는 적색 형광 입자가 널리 분포되어 있는 것으로 나타났습니다(그림 2). 이 쥐의 뇌에서 채취한 시상절편을 분석한 결과, 형광 입자는 뇌 실질 깊숙이 침투하지 않고 모체를 따라 얇은 층에 위치한 반면, 이전 실험에서와 같이 금성 발현 뉴런은 2/3 및 5 층에서 많은 수로 발견되었습니다.

AAV2_CaMKII_oChIEF EGFP 바이러스(1.49 x 10¹² vg/mL 농도에서 사용) 외에도 AAV2_CaMKII_Venus(7.31 x 10¹² vg/mL) 및 AAV2_CAG_GCamp6s(7.3 x 10¹³ vg/ml) 바이러스의 지주막하 투여를 수행하여 유사한 결과를 얻었습니다. 이는 나타난 바와 같이, 동일한 혈청형의 바이러스가 사용된 promoter 및 target gene에 따라 다른 크기의 transduction area를 제공할 수 있기 때문에 중요하다¹².

바이러스의 기존 및 지주막하 투여 후 형질도입 부위를 체계적으로 비교하기 위해 50μm 두께의 뇌 절편에서 내측 및 배변꼬리 방향의 감염 부위 크기를 계산했습니다. 바이러스의 지주막하 투여는 실질 내 투여 (1.7 ± 0.52 mm (n = 15 마우스) 대 0.46 ± 0.22 mm (n = 6 마우스), p < .00001, 중간 방향의 t-test 및 2.35 ± 0.8 mm (n = 14 마우스) 대 0.84 ± 0.29 mm (n = 6 마우스) p < .0003, rostrocaudal 방향의 t-테스트; 그림 3A).

지주막하 바이러스 주입에 의해 형질도입된 마우스의 뇌 절편을 현미경으로 관찰한 결과, 2/3 및 5층에서는 매우 광범위한 형질도입이 밝혀진 반면, 4층과 6층에는 사실상 형질도입된 세포가 없었습니다(그림 3B). 층 4에서는 층 5 피라미드의 형광 수상돌기만 명확하게 볼 수 있었습니다(그림 3B). 형광 축삭돌기는 층 6과 백질에서 추적되었습니다(그림 3C). 지주막하 주사 후 이러한 형질도입 패턴은 지주막하 공간에서 피질의 1층(아마도 더 깊숙)으로 바이러스가 확산되어 뉴런 수상돌기가 이를 포착하기 때문일 수 있습니다. 따라서 상층에서 활발하게 분기하는 뉴런만 감염됩니다. GABAergic interneuron은 주로 국소적으로 분기하는 것으로 알려져 있습니다. 우리의 가설이 옳다면, 바이러스의 지주막하 투여는 초입상층에서 중간뉴런의 전달로 이어져야 하지만 입상층에서는 그렇지 않습니다. 가설을 테스트하기 위해 AAV2_CaMKII_Venus 바이러스의 지주막하 주입 후 쥐의 뇌 단면에 대한 면역화학적 염색을 수행하여 GABAergic 중간뉴런의 두 가지 다른 기능적 클래스인 파브알부민과 칼빈딘의 마커에 대한 항체를 주입했습니다.

바이러스의 지주막하 주입에 의해 transduction된 interneuron의 수를 결정하기 위해 750 x 750 μm 섹션(50 μm 섹션 두께)에서 transduction된 세포의 총 수(녹색 염색), 면역 양성 뉴런 수(빨간색 염색) 및 이중 표지된 세포의 수를 계수하는 형태 측정 분석을 수행했습니다.

파브알부민에 대한 항체로 염색된 뇌 절편에서 초과립층에서 녹색 표지를 가진 뉴런의 수는 평균 57.4± 9.8, 적색 표지를 가진 파브알부민 양성 중간뉴런± 9.6 3.8, 그 중 4.1± 2.4(42.7%)가 이중 표지되었습니다(n = 10 제제). 대조적으로, 신피질의 5층에서 14± 4.8 바이러스 형질 도입 뉴런과 19.1 ± 4.5 파브알부민 양성 뉴런을 세었고 이중 표지된 세포(n = 10 제제)는 검출되지 않았습니다.

칼빈딘에 대해 면역화학적으로 염색된 단면을 조사했을 때, 초과립층에는 평균 21.1± 4.5개의 바이러스 형질도입 뉴런과 6.1± 2.6개의 칼빈딘 양성 세포가 있으며, 그 중 4.2± 1.9개의 세포가 두 표지를 모두 가지고 있음을 발견했습니다(69.1%; n = 10 제제). 레이어 5에서는 19개 ± 2.1개의 형질도입 뉴런, 15.9개 ± 5.7개의 칼빈딘 중간뉴런을 세었으며, 그 중 1.1개 ± 1.5개(6.9%)가 이중 염색을 보였습니다. 그러나, 레이어 5에서 이중 표지된 뉴런의 100%가 명확하게 보이는 피라미드 모양을 가지고 있다는 점에 유의해야 하며, 이는 칼빈딘 양성 피라미드 뉴런의 존재 또는 항체의 일부 비특이성을 나타낼 수 있습니다. 따라서, 바이러스의 지주막하 주입에 의해 transduction된 진정한 calbindin interneuron은 층 5에서 관찰되지 않았습니다.

그러므로, parvalbumin 및 calbindin-positive cells는 실제로 layer 2/3의 transducted neuron 사이에 존재했지만(그림 4A, C), layer 5에서는 transducted interneuron이 검출되지 않았으며, 모든 EGFP 발현 세포는 육안으로 pyramidal neuron으로 식별되었습니다(그림 4B, D).

그림 1: 기존의 피질내 및 지주막하 바이러스 주사 후 AAV2 형질도입 면적의 비교. (A) 뇌 실질에 주입 후 21일 후 500 - 600 μm 깊이까지 CaMKII_oChieff_EGFP 구조체의 확산.(B) 지주막하 투여 후 동일한 동물의 다른 반구에서 CaMKII_oChieff_EGFP의 확산. 주사 부위에서 꼬리 방향으로 200-300μm 거리의 정면 단면이 표시됩니다. 스케일 바 - 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 경막 물질이 손상되지 않은 전체 뇌 사진으로, 지주막하 바이러스와 적색 FluoSpheres가 퍼져 있는 것을 볼 수 AAV2_CaMKII_Venus .(A) 주사된 바이러스 현탁액에 첨가된 적색 나노입자의 형광은 지주막하 공간에서 주입된 부피의 물리적 확산을 보여줍니다. (B) 녹색 형광 채널의 동일한 뇌 반구는 금성 발현 영역을 보여줍니다. 주입 부위는 화살표로 표시됩니다. 또한 람다의 위치가 표시됩니다. 스케일 바 - 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 바이러스의 지주막하 주입은 신피질의 2/3 및 5층 뉴런에 광범위한 감염을 초래합니다. (A) 피질내(I) 및 지주막하(S) 바이러스 주입 후 형질도입 영역(내측(m/l) 및 주측(r/c) 방향)의 비교. 막대는 평균을 나타냅니다. 수염은 표준 편차를 나타냅니다(**** - p < 0.0001; *** - p < 0.001; t-검정). (B) AAV2_CaMKII_Venus 바이러스의 지주막하 주입 후 마우스 신피질에서 금성 발현을 보여주는 컨포칼 현미경 사진. 레이어 경계는 개략적으로(L1 - L6) 표시됩니다. (C) 이미지 (B)의 일부로, 레이어 6과 백질(WM)을 가로질러 이동하는 형광 축삭을 보여주기 위해 다른 밝기 및 대비 설정으로 표시됩니다. 눈금 막대는 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 지주막하 바이러스 주입은 상부(supra-)에서 중간뉴런의 형질전환을 초래하지만 신피질의 입상층에서는 그렇지 않음. (가, 나) 지주막하 주사막하에서 파브알부민(Alexa594 접합 2차 항체)에 대한 항체와 함께 AAV2_CaMKII_Venus 바이러스를 주입하여 주입한 마우스의 뇌 단면에 대한 면역화학적 염색. 녹색 레이블과 빨간색 레이블을 모두 가진 뉴런은 주황색으로 표시됩니다(화살표로 표시). (C, D) 칼빈딘에 대한 항체로 염색된 AAV2_CaMKII_Venus의 지주막하 주사 후 마우스의 뇌 단면의 현미경 사진. L5에 이중 표지된 뉴런이 없다는 점에 주목하십시오. 눈금 막대는 50μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 AAV2 바이러스 입자의 현탁액을 뇌의 지주막하 공간에 주입하여 마우스 신피질 뉴런을 transduction하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이는 광범위한 바이러스 분포를 제공하며, 동일한 양의 바이러스가 뇌 실질에 직접 주입될 때 감염된 조직 부피보다 거의 4배 더 많습니다.

다양한 경로(예: 뇌내, 척수강내 또는 시수탄내)를 통해 바이러스 벡터를 뇌척수액(CSF)에 직접 주입하는 것은 중추신경계 전체에 걸쳐 광범위한 유전자 전달을 위한 인기 있는 전략입니다 33,34,35. 그러나 성인 뇌에서 AAV2 벡터의 뇌내 또는 척추 내 투여는 뇌실막 세포 ^28,33,36,37에 대한 높은 친화력으로 인해 제한된 뇌 전달을 초래합니다. 뇌실막세포(ependymal cell)는 제3심실과 제4심실과 척수의 중심관을 둘러싸고 있는 단층(monolayer)으로 발견된다³⁸. 심실의 뇌실막세포 사이에 밀접한 연접(tight junctions)이 존재한다는 것은 일부 AAV 혈청형(serotype)에 대한 중요한 장벽이며, 이는 뇌실질에서 이러한 세포를 통과해야 실질내 퍼짐(intraparenchymal spreading)을 가져야 한다³⁹.

우리의 연구에서, AAV2 바이러스 벡터를 뇌 표면을 통해 지주막하 공간으로 주입하면 성체 마우스에서 신피질 뉴런이 광범위하게 전달되었습니다. 피아 물질이 중추신경계의 다른 영역에서 다른 구조를 가지고 있다는 증거가 있습니다. 척수를 둘러싸고 있는 척추 피아(spinal pia mater)의 막은 피아막(pia membrane)의 2층 특성으로 인해 두개골 피아모터(뇌를 둘러싸고 있음)보다 훨씬 두껍다(⁴⁰). 또한 심실뇌척수액(ventricular CSF)은 뇌실질(brain parenchyma)로 최소한으로 진입하는 반면, 지주막하뇌종수(subarachnoid CSF)는 혈관주위공간(paravascular space)을 따라 뇌실질(brain parenchyma)로 빠르게 진입하는 것으로 나타났다⁴¹. 따라서 바이러스 벡터가 CSF로 전달되는 경로가 다르면 다른 결과가 나타날 수 있습니다.

일부 AAV 변이체의 CSF 내 주사는 특정 부작용과 관련이 있다는 점에 유의해야 합니다. AAV9의 척수강내 또는 뇌내방실 분만은 중추신경계뿐만 아니라 말초 장기에서도 유전자 발현을 유발하는 것으로 나타났습니다^42,43. 뇌 전체의 뉴런을 보다 효율적으로 전달하기 위해서는 높은 벡터 용량이 필요합니다. 예를 들어, 성체 Sprague-Dawley 쥐는 3.1 μL, 15.5 μL 및 77.5 μL⁴²의 세 가지 용량으로 AAV9를 측심실에 일방적으로 주사했습니다. 마우스는 수조 magna⁴³에서 총 10μL의 AAV9를 투여받았습니다. 당사의 바이러스 주입 방법의 이점은 AAV의 척수강 내 또는 뇌내 방실 전달에 사용된 것보다 더 낮은 벡터 부피(1 μL)를 사용했다는 것입니다. 바이러스의 양이 적으면 뇌 외부에서의 바이러스 발현 위험과 독성도 크게 줄어듭니다.

뇌 밖에서의 바이러스 발현을 조사하지는 않았지만, 뇌 표면을 통한 지주막하 AAV2 투여는 뇌(특히 신피질)에서만 바이러스 발현을 초래했을 가능성이 매우 높습니다. 우리의 가정은 다음과 같은 이유를 기반으로 합니다. AAV9는 혈액뇌장벽(BBB)을 통과할 수 있는 재조합 아데노 관련 바이러스이며 글로벌 CNS 전달에 일반적으로 사용됩니다^37,44. 그러나 뇌 조직의 BBB 침투 및 전달은 AAV2⁴⁵로 제한됩니다. 또한, 바이러스의 지주막하 주입 후 쥐의 뇌 절편을 분석한 결과, 형질도입된 세포는 동측(주입된) 반구의 신피질에만 독점적으로 위치하는 것으로 나타났습니다. 반대쪽 신피질이나 다른 뇌 구조에서 형질도입된 세포가 발견되지 않았으며, 이는 이러한 주입 방법에 의한 말초 장기의 형질도입 가능성이 매우 낮다는 것을 시사합니다.

감염 영역이 넓을 뿐만 아니라, 지주막하 바이러스 주입 방법은 CAG와 같은 강력한 비선택적 프로모터를 사용하더라도 5층 피라미드 뉴런의 선택적 전달을 가능하게 합니다. 특정 promoter에 대해서도 선택적 발현을 보장하는 것이 매우 어렵다는 것은 잘 알려져 있습니다 ^1,26. 예를 들어, 우리가 사용한 CaMKII 프로모터는 이론적으로 글루타메이터성 뉴런을 우선적으로 감염시켜야 합니다. 그러나, 본 연구 결과와 다른 연구에서 나타난 바와 같이, 이를 사용할 때 다른 유형의 세포, 특히 GABAergic interneurons⁴⁶의 형질도입도 발생합니다. 더욱이, 지주막하 주사를 사용하면 세포 형질전환이 주사 부위에서 상당한 거리에서 이루어지기 때문에 이 방법은 신경 활동의 후속 광학 또는 전기 생리학적 기록을 위해 뇌 조직을 보존하는 데 도움이 됩니다. 우리는 생체 내 마우스 시각 피질의 L5 피라미드 뉴런의 활동에 대한 광유전학적 자극 및 세포 외 기록 실험에서 지주막하 바이러스 주사를 성공적으로 사용했습니다 ³².

이 연구는 시각 피질의 가소성 메커니즘에 대한 대규모 연구의 스핀오프로, AAV2를 사용하여 마우스 시각 피질³²의 피라미드 뉴런에서 채널 로돕신을 발현했습니다. 이 혈청형을 통해 우리는 많은 통계를 얻었고 실제로 지주막하 주사 방법을 개발했습니다. 파일럿 실험에서는 혈청형 2/9를 가진 바이러스의 지주막하 주입도 시도했으며 이 경우 상세한 형태 분석을 수행하지 않았지만 유사한 결과를 얻었습니다. 불행히도, 지주막하 투여 후 다른 혈청형이 어떻게 작용할지, 그리고 어떤 바이러스 혈청형이 가장 큰 형질도입 영역을 제공할지 예측하는 것은 불가능합니다. 이는 경험적으로만 결정할 수 있으며, 이를 위해서는 상당한 작업이 필요합니다. 이 연구에서 우리는 AAV2가 성체 쥐 뇌의 지주막하 공간에 주입될 수 있음을 설득력 있게 보여주었으며, 그 결과 신피질의 5층 피라미드 뉴런에서 표적 유전자의 선택적 발현과 초과립층에서 비선택적 발현으로 광범위한 형질도입이 가능합니다.

이 지주막하 바이러스 주사 방법을 사용하는 데 있어 가장 중요한 단계는 주사 바늘의 직경과 정확히 일치해야 하는 경막 물질의 구멍의 최적 크기를 확인하는 것입니다. 경막은 주사 바늘을 단단히 둘러싸야 하므로 주사 중 바이러스의 역류를 방지해야 합니다. 우리는 이 방법을 지주막하 주사라고 불렀지만, 지주막하 공간 외에 바이러스가 경막하 공간(지주막과 경막 사이의 공간)에도 들어가 퍼졌는지는 명확하지 않습니다. 또한 이 방법이 다른 동물, 특히 쥐 또는 다른 AAV 혈청형에서 효과가 있는지 여부도 명확하지 않습니다.

이전에 Xinjian Li와 동료들은 피질 표면에서 바이러스 주입을 기반으로 한 신경 전달 방법을 설명했습니다. 그들은 바이러스 칼슘 리포터 AAV-GCaMP6를 피질에 주입하기 위해 피질 표면에 넓은 직경의 유리 피펫을 사용했습니다. 이 방법을 사용하면 바이러스 입자는 아마도 이 경우와 유사하게 신피질의 상층으로 들어가 뉴런에 의해 포획됩니다. 저자들은 피질 표면 바이러스 주입이 심층의 뉴런을 피하면서 표재층의 뉴런을 효율적으로 표지한다는 것을 발견했다⁴⁷. 인용된 연구가 우리 연구에서 관찰한 것과 유사한 5층 피라미드 뉴런의 형질도입을 보여주지 않은 이유는 완전히 명확하지 않습니다.

지주막하 투여 후 바이러스가 초입상층에서 분기하는 뉴런의 수상돌기에 포획된다는 가설에는 한 가지 눈에 띄는 약점이 있습니다. 5층의 큰 피라미드 외에도 4층의 피라미드 뉴런(⁴⁸ )과 마우스의 시각 피질에 있는 밀실 돌출 L6 피라미드 세포⁽⁴⁹ )는 1층에 도달하는 수상돌기를 가지고 있다. 그러므로, 왜 이러한 세포가 지주막하 바이러스 주입으로 형질주입되지 않는지는 명확하지 않습니다. 한 가지 가능한 설명은 바이러스 입자를 세포체로 운반할 수 있을 만큼 두꺼운 수상돌기를 가진 세포, 즉 L5 피라미드만 감염된다는 것입니다. 생쥐의 시각 피질에서 4층 피라미드 뉴런은 단 하나의 얇은 수상돌기만을 신피질⁴⁸의 1층으로 보내는 것으로 나타났다. 그러나 지주막하 바이러스 주입 후 관찰된 감염 패턴의 원인을 파악하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 작업은 러시아 과학 재단 (보조금 20-15-00398P)의 재정 지원으로 수행되었습니다.