Method Article
פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.
בזרעי ארבידופסיס , האנדוספרם, שכבה אחת של תאים חיים הממוקמת בין העובר לאשכה, ממלא תפקיד קריטי בוויסות הבשלת הזרעים, תרדמתם ונביטתם. ניתוח מיקרוסקופי של תאי אנדוספרם שלמים חיוני להבנת התפקודים הפיזיולוגיים של האנדוספרם ברמה התאית והמולקולרית. עם זאת, הכנת הדגימה הייתה מאתגרת בשל גודלם הקטן של זרעי ארבידופסיס ומיקום שכבת תאי האנדוספרם מתחת לאשכה. מאמר זה מפרט את הכנת דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות המתאימות לתצפית וניתוח מיקרוסקופי הן בזרעים מתפתחים והן בזרעים בוגרים. שיטה זו מאפשרת תצפית על שטחים גדולים ותאי אנדוספרם שלמים רבים ללא צורך בקיבוע או חתך. בנוסף, הפרוטוקול משתמש רק בציוד מעבדה סטנדרטי, כגון מחטי הזרקה, מלקחיים מדויקים ומיקרוסקופים סטריאו. גישה זו מאפשרת בהצלחה הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים של אותות פלואורסצנטיים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), בתאי אנדוספרם שלמים. שיטה זו מאפשרת התבוננות בלוקליזציה ותנועה תוך תאית של חלבונים שונים, כמו גם מורפולוגיה של אברונים, בתאי האנדוספרם של מוטציות Arabidopsis שונות. פרוטוקול זה תורם להבהרת תפקודי אנדוספרם חדשים ומרחיב את הפוטנציאל למחקרים תאיים ומולקולריים של רקמה חיונית זו.
מכיוון שצמחים הם אורגניזמים יושבים, נביטת זרעים היא אירוע מכריע הקובע את גורלם. ההחלטה לנבוט מוסדרת בקפדנות על ידי גורמים פנימיים וסביבתיים כאחד, כגון רמות תרדמת זרעים ראשוניים, טמפרטורה, עוצמת אור ואורך גל וריכוז חנקן 1,2,3,4,5,6. לזרעים מבנים מורכבים המורכבים ממספר סוגי רקמות7. בזרעים יבשים של Arabidopsis, העובר, המתפתח לשתיל, מוקף בשכבה אחת של אנדוספרם והשכבות החיצוניות ביותר, האשך. האשך מורכב משכבות מרובות של תאים מתים, בעוד שהעובר והאנדוספרם נשארים בחיים גם בזרעים יבשים. האנדוספרם נחשב בדרך כלל כרקמת אחסון המספקת חומרים מזינים לצמיחת העובר, ויחד עם האשך, מעניקה עמידות מכנית לבליטת רדיקל 8,9,10,11,12,13.
מספר מחקרים שנערכו לאחרונה הראו כי האנדוספרם ממלא תפקיד חיוני בוויסות נביטת זרעים אופטימלית 14,15,16,17. לדוגמה, קולטן האור פיטוכרום B (PHYB) בתאי אנדוספרם מזהה אור אדום (R) או אדום רחוק (FR), ומווסת את תגובות הנביטה15. האנדוספרם מתפקד גם כרקמה חישת טמפרטורה, ומדכא תגובות נביטה בטמפרטורות גבוהות16. בקרת איכות של האנדוספרם היא קריטית לנביטת זרעים אופטימלית, במיוחד בזרעים המאוחסנים לטווח ארוך17.
הדמיית תאים חיים נחוצה כעת כדי להבהיר עוד יותר את התפקודים הפיזיולוגיים של האנדוספרם. ניתוח מיקרוסקופי של תאי אנדוספרם שלמים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם האנדוספרם מווסת את נביטת הזרעים. עם זאת, הכנת תאי אנדוספרם שלמים לתצפית מיקרוסקופית היא מאתגרת, במיוחד בזרעי ארבידופסיס . קוטר הזרעים הוא כ-0.4 מ"מ, והאנדוספרם הוא שכבה חד-תאית הממוקמת בין העובר לאשכה, מה שמקשה על מניפולציה מדויקת. כתוצאה מכך, למרות תפקידיו הפיזיולוגיים החשובים, האנדוספרם נצפה לעתים רחוקות באמצעות הדמיית תאים חיים.
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנה מהירה של דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות המתאימות להדמיית תאים חיים הן בזרעים מתפתחים והן בזרעים בוגרים.
במחקר זה נקבעו שני נהלים שונים להכנת דגימות שכבת תאי אנדוספרם חיים: אחד לפיתוח זרעים ואחד לזרעים בוגרים. נדרשות גישות שונות במקצת בהתאם למוצקות האשך. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת דגימות אנדוספרם שלמות מזרעים מתפתחים
2. הכנת דגימות אנדוספרם שלמות מזרעים בוגרים
3. תצפית מיקרוסקופית
באמצעות הפרוטוקול שמוצג באיור 1, דגימות אנדוספרם הוכנו מפיתוח זרעים שנקטפו מסיליקים ב-14 DAF (בשלב זה, האשך עדיין ירוק). תאי אנדוספרם רבים על פני שטח גדול והמבנים התוך-תאיים שלהם נצפו (איור 3A). בניסוי זה נעשה שימוש בזרעים המבטאים PHYB שהתמזגו עם GFP בקצה C (PHYB-GFP). ידוע היטב ש-PHYB עובר טרנסלוקציה לגרעין עם הפעלה על ידי אור אדום ויוצר כתמים חיוביים ל-PHYB, הידועים בשם פוטו-גופים (PBs), המעורבים בנביטת זרעים 4,20,21,22. הדגימות נאספו מצמחים שגדלו בתנאי אור לבן רציף בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. כפי שמוצג באיור 3B, PBs בתוך הגרעין זוהו בתאי אנדוספרם. תוצאה זו תואמת למחקר קודם שהראה כי PHYB באנדוספרם מווסת את נביטת הזרעים האופטימלית15. בנוסף, נערכה הדמיית זמן-lapse של תאים חיים כדי לאשר שתאי האנדוספרם המבודדים שמרו על פעילות ביולוגית גם לאחר הכנת הדגימה על ידי התבוננות בפוטו-הפיכות FR/R של פיטוכרום (איור 3C). דגימות אנדוספרם הוכנו מפיתוח זרעים שנקטפו מסיליקים בסביבות 17-18 DAF. PBs התגלו בתוך הגרעין בעת הדיסקציה, בעוד שהם נעלמו לחלוטין לאחר הקרנה באור אדום רחוק. לאחר מכן, קרינת אור אדום גרמה שוב ל-PBs. הפיכות הפוטוכרום הזו זוהתה פעמיים, מה שמצביע על כך שתאי האנדוספרם שבודדו על ידי פרוטוקול זה שמרו על פעילות ביולוגית לפחות 4.5 שעות לאחר הדיסקציה (איור 3C).
לאחר מכן, הוכנו דגימות אנדוספרם מזרעים בוגרים (שבהם האשך חום), כפי שמוצג באיור 2. בניסוי זה, התנועתיות של המיטוכונדריה נצפתה באמצעות זרעים המבטאים GFP ממוקד מיטוכונדריה (mtGFP)23, שאוחסנו בחומר ייבוש בטמפרטורת החדר בחושך במשך כשנה לאחר הקטיף. דווח כי המיטוכונדריה בעובר נעים באופן פעיל ומשנים באופן דינמי את המורפולוגיה לאחר אימביביטציה והעברה לתנאי נביטה24. הדמיה פלואורסצנטית של המיטוכונדריה בתאי אנדוספרם שלמים לאחר 3 שעות של ספיגת זרעים בוצעה, וזוהתה תנועה מיטוכונדריאלית (סרטון משלים 1). המיטוכונדריה באנדוספרם נעה מיד בתוך הציטוזול לאחר תקופה קצרה של ספיגה ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר יום אחד של ספיגת זרעים ב-22 מעלות צלזיוס, נצפו מיטוכונדריה הנעים באופן דינמי יותר (איור 4 וסרטון משלים 2).
איור 1: הכנת דגימת אנדוספרם מפיתוח זרעים. שלב 1: שסתום מפוצל מהשזיף. שלב 2: הזרעים המתפתחים נאספים. שלב 3: נוצרת צלקת על האשך והאנדוספרם באמצעות מחט הזרקה. שלב 4: מסירים את העובר על ידי צביטת הזרע בעזרת מלקחיים. שלב 5: מחט ההזרקה מוחדרת דרך מעטפת הזרע הריקה מבפנים כלפי חוץ. שלב 6: משטח האשך נשרט באמצעות מלקחיים. שלב 7: מעטפת הזרעים הריקה נפתחת לצורת גיליון באמצעות מלקחיים. שלב 8: דגימת גיליון האנדוספרם הסופית מוכנה לתצפית מיקרוסקופית. כל השלבים מבוצעים על נייר סינון רטוב תחת מיקרוסקופ סטריאו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת דגימת אנדוספרם מזרעים בוגרים. שלב 1: זרעים יבשים נספגים במים במשך יותר מ -40 דקות בצינור של 1.5 מ"ל. שלב 2: נוצרת צלקת על האשך והאנדוספרם באמצעות מחט הזרקה. שלב 3: מסירים את העובר על ידי צביטת הזרע בעזרת מלקחיים. שלב 4: הצדדים העליונים והתחתונים של מעטפת הזרעים הריקה נחתכים כדי לעצב אותה לגליל. שלב 5: מעטפת הזרעים הריקה בצורת גליל נחתכת לאורך הציר המרכזי שלה. שלב 6: דגימת גיליון האנדוספרם הסופית מוכנה לתצפית מיקרוסקופית. כל השלבים מבוצעים על נייר סינון רטוב תחת מיקרוסקופ סטריאו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה פלואורסצנטית של שכבת תאי אנדוספרם שלמה באמצעות זרעים מתפתחים. דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות הוכנו מפיתוח זרעים של סיליקיות 14 יום לאחר הפריחה (DAF) (A,B) ו-17-18 סיליקיות DAF (C). הדמיה מיקרוסקופית בוצעה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשת אובייקטיבית לטבילה בשמן Plan-Apochromat 63× ולייזר אור לבן. (A) תמונה קונפוקלית של האנדוספרם תחת ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) מראה אזורים גדולים עם מספר רב של תאי אנדוספרם שלמים. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) מוצגות תמונות קונפוקליות של האנדוספרם המבטא PHYB-GFP, עם PHYB-GFP בירוק ואוטופלואורסצנטי כלורופיל בציאן. גופי פוטו (PBs) בגרעין מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר; סרגל קנה מידה מוגדל: 2.5 מיקרומטר. אות ה-GFP הופרד מהאוטופלואורסצנציה של ואקואולים לאחסון חלבונים (PSVs) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי-לכל החיים (FLIM). תקופות חיים פלואורסצנטיות הושגו באמצעות TauScan והופרדו באמצעות פונקציית TauSeparation. אורך החיים הממוצע של הקרינה עבור GFP היה 2.2 ns. הקרינה של GFP התעוררה ב-488 ננומטר ונאספה בין 500-530 ננומטר, בעוד שאוטופלואורסצנציה של כלורופיל התעוררה ב-405 ננומטר ונאספה בין 688-729 ננומטר. (C) מוצגות תמונות קונפוקליות של האנדוספרם המבטא PHYB-GFP תחת אור לבן רציף (cWL), אור אדום רחוק מתמשך (cFR) או אור אדום מתמשך (cR). PHYB-GFP מוצג בירוק, ואוטופלואורסצנטיות PSV מוצגת במג'נטה. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר; סרגל קנה מידה מוגדל: 2.5 מיקרומטר. עוצמות אור: WL, 46.5 מיקרומול/מ"ר 2/s; FR, 35.2 מיקרומול/מ"ר לשנייה; R, 18.6 מיקרומול/מ"ר 2/s. אוטופלואורסצנציה של PSV נרגשה ב-561 ננומטר ונאספה בין 565-621 ננומטר. אות ה-GFP הופרד באותה שיטה שתוארה לעיל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של שכבת תאי אנדוספרם שלמה באמצעות זרעים בוגרים. הדמיה מיקרוסקופית בוצעה באותה שיטה המתוארת באיור 3. (A) מוצגת תמונה קונפוקלית של כל שכבת תאי האנדוספרם השלמה, שהתקבלה מסרט משלים 2. מיטוכונדריה מסומנת בירוק, ואוטופלואורסצנטיות PSV מסומנת במג'נטה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (B) סדרה של תמונות מוגדלות מהאזור הריבועי של הקו המקווקו בלוח (A) מציגה את התנועה של מיטוכונדריון, המסומנת על ידי ראשי חץ לבנים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
סרט משלים 1: מוצג סרטון זמן-lapse של mtGFP בשכבת תאי האנדוספרם של זרע בוגר 3 שעות לאחר ההטמעה. פריים אחד צולם כל 10 שניות, וקצב הפריימים של הסרטון הוא 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
סרט משלים 2: מוצג סרטון זמן-lapse של mtGFP בשכבת תאי האנדוספרם של זרע בוגר יום אחד לאחר ההטמעה. פריים אחד צולם כל 10 שניות, וקצב הפריימים של הסרטון הוא 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
תפקידי האנדוספרם בנביטת הזרעים התגלו באמצעות ניתוחים גנטיים וביוכימיים באמצעות רקמות זרעים מופרדות, כגון ניתוח ביטוי גנים וכימות של ליפידים ופיטוהורמונים 9,14,25,26,27. בדיקת מצע מעיל זרעים במבחנה, המשלבת את מעטפת הזרעים הריקה (אנדוספרם וטסטה) עם עובר מבודד ממוטציות שונות של Arabidopsis, חשפה מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס תהליכי נביטה 14,15,16,28. עם זאת, הכנת הדגימה לתצפית מיקרוסקופית הייתה מאתגרת בשל גודלם הקטן של זרעי ארבידופסיס ומיקום שכבת תאי האנדוספרם מתחת לאשכה. בפרט, תצפית על שכבת תאי האנדוספרם במהלך התפתחות הזרע נערכה לעתים רחוקות ללא קיבוע וחתך כימי.
במהלך הכנת הדגימה, מעטפת הזרעים הריקה מהתפתחות הזרעים שבירה מכיוון שהאשך חי ולכן רך. כאן, נקבעו שני פרוטוקולים להכנה מהירה של דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות המתאימות לתצפית וניתוח מיקרוסקופי בפיתוח זרעים ללא צורך בקיבוע או חתך. במקרה של הכנת דגימה מזרעים בוגרים, האשך מת ויציב, מה שגורם למעטפת הזרעים הריקה לשמור על עקמומיות כאשר היא מותקנת על זכוכית שקופית. עקמומיות זו מקשה על התבוננות בשכבת תאי האנדוספרם בבירור על פני טווח רחב של מיקוד. לכן, שיטת הנתיחה לפיתוח זרעים שונתה מעט כדי לקצץ כראוי את מעטפת הזרעים הריקה. על ידי הפרדתו לשני חלקים בשיטה זו, הושגה תצפית ברורה על תאי אנדוספרם רבים תוך שמירה על מיקוד.
פותחו ריאגנטים שונים להדמיה (לצביעת DNA, מיני חמצן תגובתיים, תאים חומציים וכו'), וחלקם יושמו על צמחי Arabidopsis 29,30,31,32. דגימות שכבת תאי אנדוספרם שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה כבר שימשו לתצפית מיקרוסקופית עם צביעת LysoTracker ו-Propidium Iodide, מה שתורם להערכת תפקוד האנדוספרם17. מאז גילוי ה-GFP ב-196233, חלבונים המתויגים ב-GFP הפכו לכלים חיוניים להבהרת הדינמיקה של מבנים תוך-תאיים 23,24,34,35,36,37,38. על ידי הכנת דגימות אנדוספרם על פי פרוטוקול זה ושימוש בשיטות הנ"ל, ניתן לבצע הדמיה של תאים חיים של האנדוספרם במהלך התפתחות הזרעים ונביטתם, כפי שמוצג באיור 3 ובאיור 4, ובכך להבהיר אירועים תוך-תאיים ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים. יתר על כן, יישום של מעכבים ספציפיים (כגון מעכבי פרוטאז, מעכבי אנזים לשינוי חלבון ומעכבי דינמיקה תאית)39,40,41,42 על תאי אנדוספרם חיים באמצעות פרוטוקול זה צפוי לספק תובנות עמוקות יותר לגבי האירועים התוך תאיים והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקוד האנדוספרם במהלך התפתחות הזרעים והנביטה.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא שלא ניתן להכין שכבות של תאי אנדוספרם מזרעים מיובשים לחלוטין מכיוון שקשה להפריד את הזרעים לעובר ולמעטפת הזרעים הריקה. כפי שמוצג באיור 2, זמן שתייה של לפחות 40 דקות נחוץ כדי להפריד זרעים בוגרים. חשוב לציין כי מספר אירועים תאיים בתוך תאי האנדוספרם עשויים להיגרם בעת ספיגה. מגבלה נוספת היא שפרוטוקול זה אינו מאפשר תצפית על רקמת אנדוספרם בשלבים המוקדמים של התפתחות הזרע, במיוחד לפני 10 DAF, מכיוון שהוא תוכנן במיוחד לתצפית על שכבת האנדוספרם של תא בודד. בשלבים מוקדמים אלה, הרקמה הקודמת להיווצרות שכבת האנדוספרם החד-תאית - אנדוספרם לא שכבתי - ממלאת את החלק הפנימי של הזרעים המתפתחים43, מה שמקשה על הכנת דגימות אנדוספרם.
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
אנו מודים לד"ר מטסושיטה ולד"ר אוקה מאוניברסיטת קיוטו על שסיפקו את מוטנט ה-phyB המבטא PHYB-GFP המונע על ידי מקדם 35S. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים, מחקר באזור מחקר מוצע (19H05713 עד K.Y.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Watoson Bio Lab | 131-815C | |
Coverslip (18 x 18 mm) | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
DDW | Water for mountting | ||
Filter Paper No.526 (400 x 400 mm) | ADVANTEC VIETNAM CO., LTD. | 02453400 | |
Genki-kun Seru Senyo yodo kopu N-150 (55 L) | Katakura & Co-op Agri Corporation | Soils for Plant Growth | |
Glass slide (26mm x 76 mm) | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | S1215 | |
Grodan AO 36 x 36 x 40 mm Cubes | Grodan | Rockwools for Plant Growth | |
Iris Scissors | Premium Plus Japan Co.,Ltd. | FC-0212 | |
Jewelers forceps, Dumont No. 5 (4 1/4 in.) | Dumont | F6521 | Forceps for Tearing |
Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Software for Sterallis 8 | |
Leica Microsystems Immersion Oil for Microscopes | Very Low Autofluorescence Immersion Oil | THMOIL-10LF | |
LIOR precision forceps 110mm SL-14 | KENIS Ltd. | KN33450438 | Forceps for Holding |
NAIL HOLIC | KOSE | Nail polish | |
Needls 27G 3/4 (19 mm) RB | Misawa Medical Industry Co., Ltd. | A Ingection Needle for Cutting | |
Nichipet Air 1000 uL | Nichiryo | 00-NAR-1000 | A 1000 µL Micropipette |
Perfluorodecalin | APOLLO SCIENTIFIC | PC5960 | Reagents for mounting |
Red light/far-red light LED panel | TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD. | 10147599 | |
Schappe Spun #60 | Fujix Co., Ltd. | Thread | |
SPINKOTE Lubricant 2 oz | BECKMAN COULTER | 306812 | Grease |
Sterallis 8 | Leica | Confocal Laser Scanning Microscopy | |
Stereomicroscope Stemi 305 cam W | Carl Zeiss NTS Ltd. | 491903-0017-000 | |
White light LED | PANASONIC | FL40SSW/37 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved