Построение модели ксенотрансплантата аденокарциномы легкого у мышей и оценка эффективности отвара XY через путь MAPK

Это исследование демонстрирует, что отвар XY оказывает терапевтическое действие против аденокарциномы легкого, регулируя путь MAPK.

Аденокарцинома легкого растет во всем мире, что побуждает к исследованию и разработке эффективных методов лечения. В последние годы все больше признается терапевтический потенциал традиционной китайской медицины для лечения аденокарциномы легкого, такой как отвар СяоИ (XY). Механизм действия традиционной китайской медицины в лечении аденокарциномы легкого продолжает выясняться. В этом исследовании использовались животные модели для изучения терапевтических эффектов отвара XY в лечении аденокарциномы легкого. Входящие в кровь химические компоненты отвара XY у мышей разделяли и анализировали как в положительном, так и в отрицательном ионном режимах с использованием UHPLC-QE-MS. Затем результаты были подтверждены с помощью экспериментов in vivo , которые продемонстрировали уменьшение размера опухоли, улучшение патологических изменений и увеличение апоптоза. В результате были идентифицированы пятнадцать компонентов, всасывающихся в кровь после приема XY-отвара: Стахиоза, Кверцетин-3-О-бета-глюкопиранозил-7-О-альфа-рамнопиранозид; Империалин; Спинозин В; Пеймин; Флавоновая основа + 3O, 2MeO, O-Hex; Пикроподофиллотоксин; (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-дигидрокси-2 [[(3S,5R,8R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-гидрокси-17-(2-гидрокси-6-метилгепт-5-ен-2-ил) 4,4,8,10,14-пентаметил-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-додекагидро-1H циклопента[a]фенантрен-3-ил]окси]-6-(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-6-(гидроксиметил)оксан-3,4,5-триол; Трицин; Гинзенозид Rg1; (20R)-гинзенозид Rh1; Джуджубозид В; Аукубин; гинзенозид Rg3; и бета-элемоновая кислота. Эксперименты на животных показали, что отвар XY подавляет рост опухоли, улучшает патологические изменения и способствует апоптозу опухолевых клеток дозозависимым образом. Задействованные механизмы могут быть связаны с повышением экспрессии белков p-JNK и p-P38 в пути MAPK и подавлением экспрессии белка p-ERK в пути MAPK. В заключение следует отметить, что XY-отвар обладает потенциалом для регулирования пути MAPK и оказания терапевтического эффекта против аденокарциномы легкого.

Заболеваемость раком легких растет во всем мире. На его долю приходится 18% всех злокачественных новообразований и он является причиной значительного^{числа смертей}, связанных с раком1,2. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является распространенной формой рака легких, при этом аденокарцинома является основным патологическим типом³. Из-за своей коварной симптоматики НМРЛ часто диагностируется на поздней стадии и имеет высокий уровень летальности ^4,5. Пациенты с НМРЛ IV стадии имеют пятилетнюю выживаемость всего 5%⁶, в то время как даже хирургически резектабельная ранняя стадия НМРЛ имеет пятилетнюю выживаемость всего 50%⁷.

В настоящее время лечение аденокарциномы легкого включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, иммунотерапию и таргетную терапию. Кроме того, традиционная китайская медицина (ТКМ) для лечения аденокарциномы легкого получает все большее признание и ценится⁸. ТКМ имеет долгую историю и применяется в лечении различных онкологических заболеваний с эффективными терапевтическими результатами ^9,10. Он рассматривает человеческое тело как единое целое, с терапевтическим принципом, направленным на восстановление движения Ци (Ци относится к жизненной энергии, которая способствует циркуляции крови и жидкостей организма, способствуя повышению иммунитета и уменьшению воспаления у пациентов с НМРЛ) во внутренних органах для восстановления общего баланса и замедления прогрессирования рака.

ТКМ не только лечит онкологические заболевания с низкой токсичностью, множественностью мишеней и высокой^{эффективностью11}, но также облегчает восстановление повреждений, вызванных лучевой терапией и химиотерапией, тем самым продлевая выживаемость¹².

Технология жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС) объединяет жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией для достижения разделения и обнаружения компонентов в сложных смесях соединений¹³. LC-MS обладает высоким разрешением, высокой чувствительностью и высокой специфичностью, что позволяет разделять и идентифицировать различные химические компоненты в отварах традиционной китайской медицины (ТКМ). В сочетании с химическими веществами сыворотки, которые отделяют и обнаруживают активные компоненты, поступающие в кровь после перорального приема^14,15, LC-MS позволяет прогнозировать и анализировать потенциальные механизмы действия лекарственных средств. Этот подход помогает понять химический состав и фармакологические компоненты отваров ТКМ, предоставляя важные данные для углубленных исследований их фармакологических эффектов и клинического применения, что делает его очень применимым в исследованиях ТКМ^16,17.

Сигнальный путь MAPK играет решающую роль в генезе, прогрессировании, метастазировании и инвазии рака легких, при этом важными подсемействами являются Erk, p38 и JNK. Было показано, что отвары ТКМ влияют на экспрессию белков в пути MAPK¹⁸. Отвар XiaoYi (XY) получен из отвара YiGuan и используется для лечения аденокарциномы легкого в Первой аффилированной больнице Чанчуньского университета китайской медицины (Рисунок 1), демонстрируя точную клиническую эффективность. Однако его терапевтический механизм остается неясным.

В этом исследовании была использована ультравысокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-QE-MS) для выяснения возможного терапевтического механизма применения отвара XY против аденокарциномы легкого, и его эффекты были подтверждены в ходе исследований in vivo .

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Чанчуньского университета традиционной китайской медицины (Этика No 2024008). Шестинедельные самцы мышей C57BL/6 (20 ± 2 г), выведенные в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF), демонстрировали типичные модели физической активности в контролируемой среде с постоянной температурой и влажностью. Они имели свободный доступ к пище и воде и поддерживались в течение 12-часового цикла свет/темнота. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Приготовление XY отвара водного экстракта

1. Положите в баночку для отвара женьшень Panax C.A. Mey (Renshen, 15 г), Chinemys reevesii (Gray) (Guiban, 30 г) и Trionyx sinensis Wiegmann (Biejia, 30 г). Добавьте 1000 мл деионизированной воды и замочите на 30 минут при комнатной температуре.
2. Отварите три травы с шага 1.1 в течение 1 ч. Одновременно замочите Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang, 30 г), Trichosanthes kirilowii Maxim. (Тяньхуафэнь, 30 г), Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Штапф (Yiyiren, 20 г), Paeonia lactiflora Pall. (Байшао, 30 г), Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang, 7 г), Commiphora myrrha Engl. (Moyao, 7 г), Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao, 20 г), Alpinia oxyphylla Miq. (Yizhiren, 20 г), Ziziphus jujuba Mill. spinosa (Bunge) (Suanzaoren, 30 г), Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Чуаньлянцзы, 5 г), Fritillaria thunbergii Miq. (Жебейму, 15 г), Anemarrhena asphodeloides Bge. (Жиму, 10 г), Platycodon grandiflorum (Jacq.) (Jiegeng, 10 г), Polygala tenuifolia Willd. (Юаньчжи, 15 г) и Phragmites communis Trin. (Люген, 30 г) в другую емкость на 30 мин. После замачивания переложите их в кастрюлю с отваром с шага 1.1.
3. Отварите все 18 трав из шагов 1.1 и шага 1.2 в течение 30 минут. Вылейте травяную жидкость, добавьте 1000 мл деионизированной воды и кипятите еще 30 минут. Повторите этот процесс кипячения три раза, чтобы получить три порции травяной жидкости, затем соедините и тщательно перемешайте их.
4. Перемешанную травяную жидкость процедите через ткань с плотностью 400 меш. Концентрируйте фильтрат под пониженным давлением, затем передайте концентрированную травяную жидкость в охлаждающее оборудование для дальнейшей обработки.
5. Перелейте концентрированную травяную жидкость в лоток для лиофилизации и поместите его в камеру предварительного замораживания вакуумного лиофилизатора. После завершения предварительного замораживания перенесите лоток в сублимационную сушильную камеру для удаления воды.
6. Удалите остатки влаги при высокой температуре. Измельчите лиофилизированный растительный экстракт с помощью пульверизатора, чтобы получить мелкодисперсный лиофилизированный порошок отвара XY (Рисунок 2).

2. Препарат из содержащей сыворотки

1. Случайным образом распределите шестинедельных мышей-самцов C57BL/6 (20 ± 2 г) либо в группу XiaoYi (XY), либо в контрольную группу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиная доза была рассчитана с использованием коэффициента пересчета человека в мышь:
   Эквивалентная экспериментальная доза для мышей (г/кг) = {Доза для человека (г/кг) / Масса тела (70 кг)} x 9,1
   На основании этого расчета была определена дозировка для мышей в размере 2,6 г/кг.
2. Взвесьте 0,9152 г лиофилизированного порошка отвара XY и растворите его в 3,2 мл дистиллированной воды для приготовления раствора препарата.
   Примечание: Мышей голодали в течение 12 ч перед пероральным введением.
3. Вводите отвар XY мышам в группе XY через зонд, в то время как контрольной группе вводите эквивалентный объем деионизированной воды.
4. Через 2 ч после перорального приема обезболить мышей пентобарбиталом натрия (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Энуклеация глазных яблок с помощью пинцета для сбора образцов крови, затем эвтаназия мышей с помощью удушения_CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с этическими^{принципами}.
5. Дайте образцам крови стабилизироваться при комнатной температуре в течение 90 минут. Центрифугируйте при 3450 x g (4 °C) в течение 15 минут для сбора надосадочной жидкости.

3. Анализ ВЭЖХЛХ-КЭ-МС

1. Добавьте 100 мг лиофилизированного порошка отвара XY в 500 μл экстракционного раствора (метанол: вода = 4:1). Тщательно перемешать, обработать ультразвуком и выдерживать на ледяной водяной бане в течение 1 ч.
2. Выдерживайте смесь при температуре -40 °C в течение 1 часа, затем центрифугируйте при 13 800 x g (4 °C) в течение 15 минут. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтрующую мембрану толщиной 0,22 мкм, затем смешайте по 100 мкл каждой надосадочной жидкости для создания образцов для контроля качества (QC).
3. После размораживания образцов плазмы отберите 400 мкл образца плазмы контрольной группы и 400 мкл образца плазмы группы XY. Добавьте 40 μL соляной кислоты (2 моль/л) в каждый образец. Вдохните в течение 1 минуты и дайте смеси настояться при температуре 4 °C в течение 15 минут. Повторите этот шаг четыре раза.
4. Добавьте 1,6 мл ацетонитрила и вортекс на 5 минут. Центрифуга при 13 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Подвергнуть 1 800 мкл надосадочной жидкости азотной сушке.
5. Восстановите высушенные образцы в 150 мкл 80% метанола, содержащего 10 мкг/мл внутреннего стандарта, путем вортексирования в течение 5 минут. Центрифугируйте при 13 800 × г в течение 5 мин при 4 °C, затем перенесите 120 мкл надосадочной жидкости в свежий стеклянный флакон для анализа LC-MS (рис. 3).

4. Клеточная культура и подготовка животных

1. Засейте 1 мл клеток карциномы легкого Льюиса в чашке для культивирования, содержащей модифицированную орлиную среду Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки в контролируемых условиях при 37 °C с 5%_CO2.
2. Когда клетки достигнут 80% слияния, пропустите их с помощью 0,25% трипсина. Продолжайте процеживание до тех пор, пока состояние клеток не стабилизируется, затем отрегулируйте концентрацию клеток до 3 x 10⁶ клеток/мл.
3. Введите 0,1 мл приготовленной клеточной суспензии подкожно в правую подмышечную впадину самцов мышей C57BL/6 для установления модели аденокарциномы легкого.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевая ткань может быть пальпирована в подмышечной впадине мышей через 5 дней после инокуляции.
4. Через 5 дней случайным образом разделите мышей на пять групп (n = 6 в группе): Модельная группа (M) - Без лечения; XY отвар низкодозированной группы (XY-L) - 1,3 г/кг; XY отвар средней дозы группы (XY-Z) - 2,6 г/кг; XY отвар высокодозированной группы (XY-H) - 5,2 г/кг; Группа цисплатина (ДДП) - обрабатывается цисплатином²⁰.
5. Растворите порошок отвара XY в 200 μл дистиллированной воды в соответствующей дозе и вводите через зонд. Группы M и DDP получают равный объем дистиллированной воды через зонд.
6. Вводите цисплатин в группу ДДП путем внутрибрюшинной инъекции (3 мг/кг) один раз в 3 дня. Введите такой же объем физиологического раствора в другие группы.

5. Патологоанатомический анализ опухолевой ткани

1. Через 21 день усыпить всех мышей с помощью удушения CO₂ с последующим вывихом шейки матки (в соответствии с этическими нормами) и иссечь опухолевую ткань²¹. Измерьте объем и вес опухоли (рисунок 4).
2. Зафиксировать иссеченные опухолевые ткани в 4% параформальдегиде на 24 ч). Обезвоживайте ткани с помощью градуированных растворов этанола.
3. Очистите обезвоженные блоки ткани с помощью ксилола, затем погрузите их в расплавленный парафин. Дайте воску застыть в парафиновый блок. Разрежьте тканевый блок на срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома.
4. Депарафинизация срезов тканей в ксилоле с последующей регидратацией в дифференцированных растворах этанола. Срезы окрашивать гематоксилином в течение 5 минут, затем промыть деионизированной водой.
5. Срезы закрасить 0,5% раствором эозина в течение 1 мин. Наблюдайте за окрашенными срезами под оптическим микроскопом и делайте снимки для анализа.

6. Иммуногистохимический анализ опухолевой ткани

1. Выполните депарафинизацию и регидратацию в соответствии с процедурами, описанными в шагах 5.2-5.4.
2. Инкубировать срезы в эндогенном блокаторе пероксидазы при комнатной температуре в течение 15 мин. Блокируйте неспецифическое связывание путем инкубации участков с козьей сывороткой.
3. Применяют первичные антитела: Ki-67 (1:600) и Каспазу-3 (1:100). Инкубируйте секции в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте буфером PBS), затем нанесите вторичное антитело общего назначения (1:500) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
4. Развивайте цветовую реакцию, добавляя раствор DAB. Срезы закрасьте раствором гематоксилина.
5. Проведите обезвоживание, очистку и герметизацию испачканных участков. Наблюдайте за экспрессией белков под оптическим микроскопом и получайте изображения для анализа.

7. Вестерн-блоттинг

1. Гомогенизируйте опухолевую ткань с помощью тканевого лизера. Извлеките общий белок и определите его концентрацию с помощью набора для анализа бицинхониловой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов).
2. Выполните количественное определение белка с последующим электрофорезом SDS-PAGE и переносом белка на мембрану.
3. Инкубировать мембрану в течение ночи при 4 °C с первичными антителами: P38 (1:2000), p-P38 (1:1000), ERK (1:20000), p-ERK (1:500), JNK (1:2000), p-JNK (1:5000), β-актином (1:200) (см. Таблицу материалов).
4. На следующий день инкубируйте мембрану с конъюгированным вторичным антителом к пероксидазе хрена (HRP) при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Обнаружение белковых полос с помощью системы усиленной хемилюминесценции (ECL).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность белковой полосы была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ.

Порошковый раствор XY и образцы сыворотки из контрольной группы и группы XY были проанализированы с помощью UHPLC-QE-MS, выявив хорошо разделенные пики. Диаграммы суммарной ионизации для мод положительных и отрицательных ионов показаны на рисунке 3. Состав отвара XY был идентифицирован на основе времени удержания, режима получения и фрагментов масс-спектра. Пятнадцать компонентов кровотока были идентифицированы путем сравнения сыворотки группы холостого и XY отвара для перорального применения с компонентами порошкового раствора XY (табл. 1).

Линейный график объема опухоли показывает, что после 21 дня зондирования отваром XY объем опухоли у мышей уменьшился по сравнению с группой М и проявил дозозависимый эффект (рис. 4). Гистопатология опухоли наблюдалась с помощью H&E окрашивания (рис. 5). В группе М опухолевые клетки были плотно расположены и проявляли активную пролиферацию, с обильным патологическим митозом. По мере увеличения дозы XY-отвара расположение опухолевых клеток постепенно становилось разреженным, а межклеточное пространство увеличивалось. В опухолевых тканях наблюдались различные степени некроза, а патологический митоз был редким²¹.

Для проверки влияния отвара XY на пролиферацию и апоптоз опухолевых тканей у мышей были проведены иммуногистохимические эксперименты (ИГХ). После окрашивания антителами к Ki-67 и каспазе 3 в срезах опухолевой ткани наблюдались рассеянные коричневато-желтые частицы. По сравнению с М-группой, уровни Ki-67 в опухолевых тканях групп XY и DDP последовательно снижались, тогда как уровни каспазы 3 повышались (рис. 6).

Чтобы определить, оказывает ли XY отвар терапевтическое действие на аденокарциному легкого через путь MAPK, был проведен вестерн-блоттинг опухолевых тканей мышей. Как показано на рисунке 7, лечение отваром XY привело к снижению экспрессии p-ERK, при этом в группе XY-H наблюдалась значительная разница по сравнению с группой M (p < 0,001). Уровни p-JNK и p-P38 повысились в группе XY-H по сравнению с группой M, при этом статистически значимые различия наблюдались в группе XY-H (p < 0,01) и группе DDP (p < 0,05) по сравнению с группой M. Кроме того, разница между группами DDP и XY-H была статистически значимой.

Рисунок 1: Компоненты отвара XY. На этом рисунке представлены отдельные препараты, содержащиеся в отваре XY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Приготовление XY отвара водного экстракта. На этом рисунке показан процесс приготовления водного экстракта отвара XY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ XY отвара водного экстракта. (А) Процесс экстракции лекарственно-содержащей сыворотки. (B) Масс-спектрометрический анализ в режиме положительных ионов. (В) Масс-спектрометрический анализ в режиме отрицательных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Влияние отвара XY на объем и морфологию опухоли мыши. (A) Культивирование клеток, имплантация опухоли и процедуры забора образцов. (B) Линейный график, отображающий объем опухоли с течением времени. (C) Морфология опухоли после 21 дня лечения зондовой зондацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Гистологический анализ тканей опухоли мыши. (А) Расположение опухолевой ткани становится более редким с увеличением дозы отвара XY, с признаками некроза в зависимости от дозы. (Б) Патологический митоз в опухолевых тканях, демонстрирующий уменьшение патологического митоза с увеличением доз XY-отвара. Масштабные линейки: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Уровни экспрессии Ki-67 и каспазы-3. (А) Уровни экспрессии Ki-67. (В) Уровни экспрессии каспазы-3. Масштабные линейки: 400 мкм. (C) Количественная оценка Ki-67-положительных областей, показывающая уменьшение с увеличением доз XY-отвара. (D) Количественная оценка каспазы-3-положительных областей, показывающая увеличение с увеличением доз XY-отвара. p < 0,001, ****p < 0,0001; ns, не существенно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Уровни экспрессии белка в пути MAPK. (A) Вестерн-блоттинг экспрессии белка. (B) Уровни экспрессии ERK. (C) уровни экспрессии p-ERK. (D) Уровни экспрессии JNK. (E) уровни экспрессии p-JNK. (F) Уровни экспрессии P38. (G) уровни экспрессии p-P38. Отвар XY повышал экспрессию белков p-JNK и p-P38 при одновременном подавлении экспрессии p-ERK. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Компоненты, всасывающиеся в кровь после приема отвара XY. В таблице перечислены активные компоненты, обнаруженные в крови после приема XY отвара: А: Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang), В: Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu), C: Trichosanthes kirilowii Maxim. (Тяньхуафэнь), D: Panax ginseng C.A. Mey (Renshen), E: Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang), F: Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren), G: Phragmites communis Trin. (Люген).

Заболеваемость раком ежегодно растет, привлекая значительный клинический и исследовательский интерес^22,23. Недавние исследования продемонстрировали эффективность традиционной китайской медицины (ТКМ) в лечении рака легких 24,25,26. Например, было показано, что отвар маймендонга увеличивает количество и активность NK-клеток, тем самым подавляя метастазирование рака легких²⁷. Аналогичным образом, отвар Махуан Фуцзы Сисинь достиг терапевтического эффекта при раке легких, воздействуя на множественные сигнальные пути²⁸. В этом исследовании используется анализ LC-MS и эксперименты in vivo для прогнозирования возможных механизмов, с помощью которых отвар XY оказывает терапевтическое воздействие на аденокарциному легкого.

Анализ ЖХ-МС выявил 15 компонентов крови. Среди них было показано, что трицин и пикроподофиллотоксин подавляют лекарственную устойчивость и снижают уровни экспрессии p-PRKCA, SPHK1, SPHK2 и EGFR, тем самым подавляя активность клеток рака легкого^29,30. Гинзенозид Rg1 и гинзенозид Rg3, компоненты женьшеня обыкновенного C.A. Meyer, могут блокировать митоз клеток, ингибировать передачу сигналов mTOR, оказывать антиангиогенное действие, усиливать иммунную функцию и, в конечном итоге, подавлять рост опухоли и метастазирование при одновременном снижении лекарственной устойчивости 31,32,33,34. Стахиоза может индуцировать апоптоз в клетках рака кишечника путем модуляции экспрессии проапоптотических белков³⁵. Империалин, алкалоид с противовоспалительными и антипролиферативными свойствами, обладает потенциалом в качестве противоопухолевого агента на ранних стадиях³⁶. Пеймин может останавливать клеточный цикл, вызывая апоптоз, ингибировать миграцию клеток через стресс эндоплазматического ретикулума и регулировать экспрессию белка, связанного с NF-κB путем, для подавления роста клеток рака молочной железы и желудка ^37,38. Сообщалось, что аукубин и джуджубозид В способствуют аутофагии и апоптозу в опухолевых клетках, ингибируя ангиогенез, тем самым оказывая противоопухолевое действие 39,40,41.

Путь MAPK необходим для различных биологических процессов, включая активацию клеток, пролиферацию, аутофагию и апоптоз. Некоторые соединения, обнаруженные в входящих в кровь компонентах отвара XY, такие как гинзенозид Rg1, гинзенозид Rg3, пеймин и джуджубозид В, могут оказывать противоопухолевое действие через путь MAPK 42,43,44,45. Путь MAPK включает в себя сигнальные каскады ERK, JNK и P38 и широко изучается в исследованиях рака из-за его роли в регулировании физиологических процессов через активацию белкового каскада MAP3K-MAP2K-MAPK^46,47.

Активация пути ERK стимулирует пролиферацию клеток и ингибирует апоптоз путем регуляции активности и экспрессии проапоптотических и антиапоптотических белков на транскрипционном и трансляционном уровнях ^48,49. Белковые ингибиторы, нацеленные на путь ERK, были широко изучены и используются в лечении рака 50,51,52. Также было показано, что мономеры и составы традиционной китайской медицины (ТКМ) оказывают противоопухолевое действие, модулируя путь ERK. Например, формула QYHJ ингибирует пролиферацию и способствует апоптозу клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, регулируя экспрессию p-P38 и p-ERK1/2⁵³. Производные феруловой кислоты подавляют пролиферацию, останавливают клеточный цикл и индуцируют апоптоз в клеточной линии⁵⁴ рака легких человека A549.

Путь JNK/P38 играет различные роли, регулируя различные нижестоящие эффекторные белки посредством фосфорилирования, тем самым влияя на клеточный цикл, пролиферацию клеток и апоптоз^55,56. Исследования показали, что триптолид модулирует экспрессию p-P38 и p-JNK и ингибирует пролиферацию клеток A549, оказывая противоопухолевое действие⁵⁷. Кроме того, байкалеин индуцирует апоптоз в клетках HeLa, влияя на экспрессию p-P38 и p-JNK⁵⁸. Исследования in vivo и in vitro показали, что инъекция Aidi влияет на экспрессию p-JNK и p-P38 в клетках HepG2 и моделях мышей с гепатоцеллюлярной карциномой, тем самым ингибируя пролиферацию опухоли⁵⁹.

Ki-67 и Каспаза 3 являются ключевыми индикаторами пролиферации и апоптоза опухолей. Ki-67 представляет собой ядерный белок, который высоко экспрессируется во время пролиферации клеток и отсутствует в покоящихся клетках (фаза G0)⁶⁰. Поскольку развитие опухоли тесно связано с пролиферацией клеток, исследования корреляции между Ki-67 и онкогенезом привлекли значительное внимание. Экспрессия Ki-67 положительно коррелирует со злокачественностью опухоли, агрессивностью и прогнозом^61,62, что делает его широко используемым биомаркером пролиферации рака⁶³. Он был широко изучен в патогенезе и прогнозе рака желудочно-кишечного тракта, легких, молочной железы и шейки матки 64,65,66,67.

Семейство каспаз состоит из протеолитических ферментов, которые регулируют апоптоз и воспаление. Каспаза 3, в основном обнаруженная в цитоплазме, является ключевым эффектором апоптоза. Он способствует гибели клеток, расщепляя белки цитоскелета, инактивируя белки, ингибирующие апоптоз, и разрушая ферменты репарации ДНК 68,69,70. Изменения в экспрессии каспазы 3 могут влиять на чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, тем самым влияя на инвазию, метастазирование и прогрессирование различных видов рака 71,72,73,74.

Это исследование показало, что отвар XY ингибирует пролиферацию опухолей у мышей с опухолями LLC дозозависимым образом. Патологический анализ опухолевых тканей в группах лечения XY и DDP выявил более рыхлое расположение клеток по сравнению с М-группой, а также снижение патологического митоза. Кроме того, в опухолевых тканях групп лечения наблюдались некроз и кровоизлияния. Результаты иммуногистохимии (ИГХ) также подтвердили, что отвар XY ингибирует пролиферацию опухолевых клеток и способствует апоптозу дозозависимым образом. Вестерн-блоттинг опухолевых тканей показал значительные изменения в уровнях экспрессии ключевых белков в пути MAPK. В целом, патологические данные и данные ИГХ свидетельствуют о том, что отвар XY оказывает терапевтическое действие против аденокарциномы легкого, модулируя экспрессию белков в сигнальном пути MAPK.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана пунктом (YDZJ202301ZYTS459) Плана развития науки и технологий провинции Цзилинь.