بناء نموذج الطعم الجيني لسرطان الغدة الدينية في الفئران وتقييم كفاءة مغلي XY من خلال مسار MAPK

توضح هذه الدراسة أن مغلي XY يمارس تأثيرات علاجية ضد سرطان الرئة الغدي من خلال تنظيم مسار MAPK.

يتزايد سرطان الرئة الغدي في جميع أنحاء العالم ، مما يدفع إلى استكشاف وتطوير طرق العلاج الفعالة. في السنوات الأخيرة ، تم التعرف بشكل متزايد على الإمكانات العلاجية للطب الصيني التقليدي لسرطان الرئة الغدي ، مثل مغلي XiaoYi (XY). لا يزال يتم توضيح آلية عمل الطب الصيني التقليدي في علاج سرطان الرئة الغدي. في هذه الدراسة ، تم استخدام النماذج الحيوانية للتحقيق في الآثار العلاجية لمغلي XY في علاج سرطان الرئة. تم فصل المكونات الكيميائية لدخول الدم في مغلي XY في الفئران وتحليلها في كل من الوضعين الأيوني الموجب والسالب باستخدام UHPLC-QE-MS. ثم تم التحقق من صحة النتائج من خلال التجارب في الجسم الحي ، والتي أظهرت انخفاض حجم الورم ، وتحسين التغيرات المرضية ، وزيادة موت الخلايا المبرمج. نتيجة لذلك ، تم تحديد خمسة عشر مكونا يتم امتصاصها في الدم بعد إعطاء مغلي XY: ستاكيوز ، كيرسيتين -3-O-بيتا جلوكوبيرانوسيل-7-O-ألفا-رامنوبيرانوسيد. إمبريالين. سبينوزين ب. بيمين. قاعدة فلافون + 3O ، 2MeO ، O-Hex ؛ بيكروبودوفيلوتوكسين. (2S ، 3R ، 4S ، 5S ، 6R) -2- [(2R ، 3R ، 4S ، 5S ، 6R) -4،5-dihydroxy-2 [[(3S ، 5R ، 8R ، 10R ، 12R ، 13R ، 14R ، 17S) -12-hydroxy-17- (2-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-yl) 4،4،8،10،14-pentamethyl-2،3،5،6،7،9،11،12،13،15،16،17-dodecahydro-1H cyclopenta [a] phenanthren-3-yl] oxy] -6- (hydroxymethyl) oxan-3-yl] oxy-6- (hydroxymethyl) oxane-3،4،5-triol; تريسين. جينسينوسيد Rg1 ؛ (20R) - جينسينوسيد Rh1 ؛ Jujuboside B; أوكوبين. جينسينوسيد Rg3 ؛ وحمض بيتا إيليمونيك. أظهرت التجارب التي أجريت على أن مغلي XY يمنع نمو الورم ، ويحسن التغيرات المرضية ، ويعزز موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية بطريقة تعتمد على الجرعة. قد تكون الآليات المعنية مرتبطة بالتنظيم المعزز لتعبير البروتين p-JNK و p-P38 في مسار MAPK وتقليل تنظيم تعبير بروتين p-ERK في مسار MAPK. في الختام ، فإن مغلي XY لديه القدرة على تنظيم مسار MAPK وممارسة تأثيرات علاجية ضد سرطان الرئة الغدي.

معدل الإصابة بسرطان الرئة آخذ في الارتفاع في جميع أنحاء العالم. وهو يمثل 18٪ من جميع الأورام الخبيثة وهو مسؤول عن عدد كبير من الوفيات المرتبطة بالسرطان^1،2. سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) هو شكل شائع من سرطان الرئة ، مع السرطان الغدي باعتباره النوع المرضي^{الرئيسي 3}. نظرا لأعراضه الخبيثة ، غالبا ما يتم تشخيص NSCLC في مرحلة متقدمة ولديه معدل وفيات مرتفع ^4,5. يعاني مرضى المرحلة الرابعة من NSCLC من معدل بقاء لمدة خمس سنوات على قيد الحياة بنسبة 5٪ ^{فقط 6} ، في حين أن معدل بقاء NSCLC في المرحلة المبكرة القابل للاستئصال جراحيا يبلغ معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات 50٪ ^{فقط 7}.

حاليا ، يشمل علاج سرطان الرئة الغدي الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي والعلاج المناعي والعلاج الموجه. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعرف على الطب الصيني التقليدي (TCM) لسرطان الرئة الغدي بشكل متزايد^{وتقييمه 8}. الطب الصيني التقليدي له تاريخ طويل وقد استخدم في علاج أمراض الأورام المختلفة بنتائج علاجية فعالة^9،10. إنه ينظر إلى جسم الإنسان ككيان كامل ، مع تركيز المبدأ العلاجي على استعادة حركة Qi (يشير Qi إلى الطاقة الحيوية التي تعزز الدورة الدموية وسوائل الجسم ، مما يساهم في تعزيز المناعة وتقليل الالتهاب لدى مرضى NSCLC) في الأعضاء الداخلية لاستعادة التوازن العام وتثبيط تطور السرطان.

لا يعالج الطب الصيني التقليدي أمراض الأورام ذات السمية المنخفضة والأهداف المتعددة والكفاءة العالية¹¹ فحسب ، بل يسهل أيضا إصلاح الأضرار الناجمة عن العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، وبالتالي إطالة فترة البقاء^{على قيد الحياة 12}.

تدمج تقنية قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) الكروماتوغرافيا السائلة مع قياس الطيف الكتلي لتحقيق فصل المكونات والكشف عنها في مخاليط المركبات المعقدة¹³. يوفر LC-MS دقة عالية وحساسية عالية وخصوصية عالية ، مما يسمح بفصل وتحديد المكونات الكيميائية المختلفة في مغلي الطب الصيني التقليدي (TCM). عند دمجها مع الكيمياء الطبية في الدم ، والتي تفصل وتكتشف المكونات النشطة لدخول الدم بعد تناولها عن طريق الفم^14،15 ، يتيح LC-MS التنبؤ بآليات عمل الأدوية المحتملة وتحليلها. يساعد هذا النهج في فهم التركيب الكيميائي والمكونات الدوائية لمغلي الطب الصيني التقليدي ، وتوفير البيانات الأساسية للبحث المتعمق حول آثارها الدوائية وتطبيقاتها السريرية ، مما يجعلها قابلة للتطبيق بشكل كبير في أبحاث الطب الصيني^{التقليدي 16،17}.

يلعب مسار إشارات MAPK دورا مهما في نشأة سرطان الرئة وتطوره ورم خبيث وغزوه ، مع Erk و p38 و JNK كعائلات فرعية مهمة. لقد ثبت أن مغلي الطب الصيني التقليدي يؤثر على التعبير عن البروتينات في مسار MAPK¹⁸. مغلي XiaoYi (XY) مشتق من مغلي YiGuan ويستخدم لعلاج سرطان الرئة الغدي في المستشفى الأول التابع لجامعة تشانغتشون للطب الصيني (الشكل 1) ، مما يدل على الفعالية السريرية الدقيقة. ومع ذلك ، لا تزال آليته العلاجية غير واضحة.

في هذه الدراسة ، تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء إلى جانب قياس الطيف الكتلي Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-QE-MS) لتوضيح الآلية العلاجية المحتملة لمغلي XY ضد سرطان الرئة الغدي ، وتم التحقق من صحة آثاره من خلال دراسات في الجسم الحي .

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة تشانغتشون للطب الصيني التقليدي (الأخلاقيات رقم 2024008). أظهرت ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر ستة أسابيع (20 ± 2 جم) ، والتي تم تربيتها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، أنماطا نموذجية للنشاط البدني في بيئة خاضعة للرقابة مع درجة حرارة ورطوبة ثابتة. كان لديهم إمكانية الوصول إلى الطعام والماء وتم الاحتفاظ بهم في ظل دورة إضاءة / ظلام مدتها 12 ساعة. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير مستخلص مائي مغلي XY

1. ضع Panax ginseng C.A. Mey (Renshen ، 15 جم) ، Chinemys reevesii (رمادي) (Guiban ، 30 جم) ، و Trionyx sinensis Wiegmann (Biejia ، 30 جم) في وعاء مغلي. أضف 1000 مل من الماء منزوع الأيونات وانقعه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. اسلقي الأعشاب الثلاثة من الخطوة 1.1 لمدة ساعة. في نفس الوقت ، نقع Rehmannia glutinosa Libosch (ديهوانغ ، 30 جم) ، Trichosanthes kirilowii Maxim. (تيانهوافن ، 30 جم) ، Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (روماني.) ستابف (Yiyiren ، 20 جم) ، Paeonia lactiflora Pall. (بايشاو ، 30 جم) ، Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang ، 7 جم) ، Commiphora myrrha Engl. (Moyao ، 7 جم) ، Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao ، 20 جم) ، Alpinia oxyphylla Miq. (Yizhiren ، 20 جم) ، مطحنة Ziziphus jujuba . var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren ، 30 جم) ، Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Chuanlianzi ، 5 جم) ، Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu ، 15 جم) ، Anemarrhena asphodeloides Bge. (Zhimu ، 10 جم) ، Platycodon grandiflorum (Jacq.) (جيجينغ ، 10 جم) ، بوليجالا تينويفوليا ويلد. (Yuanzhi ، 15 جم) ، و Phragmites communis Trin. (لوجين ، 30 جم) في وعاء آخر لمدة 30 دقيقة. بعد النقع ، انقلها إلى وعاء ديكوتيون من الخطوة 1.1.
3. اسلقي جميع الأعشاب ال 18 من الخطوتين 1.1 والخطوة 1.2 لمدة 30 دقيقة. يسكب السائل العشبي ويضاف 1000 مل من الماء منزوع الأيونات ويغلى لمدة 30 دقيقة أخرى. كرر عملية الغليان هذه ثلاث مرات للحصول على ثلاثة أجزاء من السائل العشبي ، ثم امزجها واخلطها جيدا.
4. قم بتصفية السائل العشبي المختلط من خلال قطعة قماش 400 شبكة. قم بتركيز المرشح تحت ضغط منخفض ، ثم انقل السائل العشبي المركز إلى معدات التبريد لمزيد من المعالجة.
5. صب السائل العشبي المركز في صينية تجميد التجفيد وضعه في غرفة التجميد المسبق لجهاز التجميد بالفراغ. بمجرد اكتمال التجميد المسبق ، انقل الدرج إلى غرفة تجفيف التسامي لإزالة الماء.
6. قم بإزالة أي رطوبة متبقية عند درجة حرارة عالية. قم بسحق المستخلص العشبي المجفف بالتجميد باستخدام مطحن للحصول على مسحوق مغلي XY مجفف بالتجميد (الشكل 2).

2. تحضير المصل المحتوي على الأدوية

1. قم بتعيين ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر ستة أسابيع (20 ± 2 جم) بشكل عشوائي إما في مجموعة XiaoYi (XY) أو المجموعة الضابطة.
   ملاحظة: تم حساب جرعة الماوس باستخدام عامل التحويل من إنسان إلى فأر:
   الجرعة التجريبية المكافئة للفئران (جم / كجم) = {جرعة بشرية (جم / كجم) / وزن الجسم (70 كجم)} × 9.1
   بناء على هذا الحساب ، تم تحديد جرعة الفئران لتكون 2.6 جم / كجم.
2. قم بوزن 0.9152 جم من مسحوق مغلي XY المجفف بالتجميد وقم بإذابه في 3.2 مل من الماء المقطر لتحضير محلول الدواء.
   ملاحظة: تم صيام الفئران لمدة 12 ساعة قبل تناوله عن طريق الفم.
3. قم بإدارة مغلي XY للفئران في مجموعة XY عن طريق التزقيم ، أثناء إدارة المجموعة الضابطة بحجم مكافئ من الماء منزوع الأيونات.
4. بعد 2 ساعة من تناوله عن طريق الفم ، قم بتخدير الفئران باستخدام الصوديوم البنتوباربيتال (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). قم باستئصال مقل العيون باستخدام ملاقط لجمع عينات الدم ، ثم قتل الفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم باتباع الإرشادات الأخلاقية¹⁹.
5. اترك عينات الدم تستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 3450 × جم (4 درجات مئوية) لمدة 15 دقيقة لجمع المادة الطافية.

3. تحليل UHPLC-QE-MS

1. أضف 100 مجم من مسحوق مغلي XY المجفف بالتجميد إلى 500 ميكرولتر من محلول الاستخراج (الميثانول: الماء = 4: 1). تخلط جيدا ، وصوتنة ، وتحتضن في حمام ماء مثلج لمدة 1 ساعة.
2. يحفظ الخليط عند -40 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,800 × جم (4 درجات مئوية) لمدة 15 دقيقة. قم بتصفية المادة الطافية من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر ، ثم اجمع 100 ميكرولتر من كل مادة طافية لإنشاء عينات مراقبة الجودة (QC).
3. بعد إذابة عينات البلازما ، خذ 400 ميكرولتر من عينة بلازما المجموعة الضابطة و 400 ميكرولتر من عينات البلازما من المجموعة XY. أضف 40 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك (2 مول / لتر) لكل عينة. دوامة لمدة 1 دقيقة واترك الخليط يقف عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة أربع مرات.
4. أضف 1.6 مل من الأسيتونيتريل والدوامة لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 13,800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. يخضع 1,800 ميكرولتر من المادة الطافية لتجفيف النيتروجين.
5. أعد تكوين العينات المجففة في 150 ميكرولتر من 80٪ ميثانول تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من المعيار الداخلي عن طريق الدوامة لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 13،800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم انقل 120 ميكرولتر من المادة الطافية إلى قارورة زجاجية جديدة لتحليل LC-MS (الشكل 3).

4. زراعة الخلايا وإعداد

1. بذرة 1 مل من خلايا سرطان الرئة لويس في طبق استزراع يحتوي على Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. احتضان الخلايا في ظل ظروف خاضعة للرقابة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، قم بتمريرها باستخدام 0.25٪ تربسين. استمر في المرور حتى تستقر حالة الخلية ، ثم اضبط تركيز الخلية على 3 × 10⁶ خلايا / مل.
3. حقن 0.1 مل من معلق الخلية المحضر تحت الجلد في الإبط الأيمن لذكور الفئران C57BL / 6 لإنشاء نموذج سرطان الرئة.
   ملاحظة: يمكن تحسس أنسجة الورم في إبط الفئران بعد 5 أيام من التلقيح.
4. بعد 5 أيام ، قسم الفئران بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات (ن = 6 لكل مجموعة): المجموعة النموذجية (M) - لا علاج ؛ مجموعة الجرعة المنخفضة من مغلي XY (XY-L) - 1.3 جم / كجم ؛ مجموعة الجرعة المتوسطة من مغلي XY (XY-Z) - 2.6 جم / كجم ؛ مجموعة الجرعة العالية من مغلي XY (XY-H) - 5.2 جم / كجم ؛ مجموعة سيسبلاتين (DDP) - تعامل بالسيسبلاتين²⁰.
5. قم بإذابة مسحوق مغلي XY في 200 ميكرولتر من الماء المقطر بالجرعة المقابلة وقم بإعطائه عن طريق التزقيم. تتلقى مجموعتا M و DDP كمية متساوية من الماء المقطر عن طريق التزقيم.
6. يعطى سيسبلاتين لمجموعة DDP عن طريق الحقن داخل الصفاق (3 ملغ/كغ) مرة كل 3 أيام. حقن نفس الحجم من المحلول الملحي الفسيولوجي في المجموعات الأخرى.

5. التحليل المرضي لأنسجة الورم

1. بعد 21 يوما ، قم بالقتل الرحيم لجميع الفئران باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون 2 متبوعا بخلع عنق الرحم (باتباع الإرشادات الأخلاقية) واستئصال أنسجة الورم²¹. قياس حجم الورم ووزنه (الشكل 4).
2. إصلاح أنسجة الورم المستأصلة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة). تجفيف الأنسجة باستخدام محاليل الإيثانول المتدرجة.
3. قم بإزالة كتل الأنسجة المجففة باستخدام الزيلين ، ثم قم بتضمينها في شمع البارافين المذاب. اسمح للشمع بالتصلب في كتلة البارافين. قسم كتلة الأنسجة إلى شرائح بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
4. قم بإزالة الشمع من أقسام الأنسجة في الزيلين ، متبوعا بالجفاف في محاليل الإيثانول المتدرجة. تلطخ الأقسام بالهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات.
5. قم بإزالة بقع الأقسام بمحلول يوزين 0.5٪ لمدة 1 دقيقة. راقب الأقسام الملطخة تحت المجهر البصري والتقط الصور لتحليلها.

6. التحليل الكيميائي المناعي لأنسجة الورم

1. قم بإزالة الشمع وإعادة الجفاف باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوات 5.2-5.4.
2. احتضان الأقسام في مانع بيروكسيداز داخلي المنشأ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. امنع الارتباط غير المحدد عن طريق احتضان الأقسام بمصل الماعز.
3. استخدم الأجسام المضادة الأولية: Ki-67 (1: 600) و Caspase-3 (1: 100). احتضان الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل باستخدام المخزن المؤقت PBS) ، ثم ضع جسما مضادا ثانويا للأغراض العامة (1: 500) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. قم بتطوير تفاعل اللون عن طريق إضافة محلول DAB. تلاعب بالأقسام بمحلول الهيماتوكسيلين.
5. قم بإجراء الجفاف والتطهير وختم الأجزاء الملطخة. راقب تعبير البروتين تحت المجهر البصري والتقط الصور للتحليل.

7. تحليل اللطخة الغربية

1. تجانس أنسجة الورم باستخدام محلل الأنسجة. استخرج البروتين الكلي وحدد تركيزه باستخدام مجموعة مقايسة حمض البيسنشونيك (BCA) (انظر جدول المواد).
2. قم بإجراء القياس الكمي للبروتين ، متبوعا بالرحلان الكهربائي SDS-PAGE ونقل البروتين إلى الغشاء.
3. احتضان الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية: P38 (1: 2000) ، p-P38 (1: 1000) ، ERK (1: 20000) ، p-ERK (1: 500) ، JNK (1: 2000) ، p-JNK (1: 5000) ، β-actin (1: 200) (انظر جدول المواد).
4. في اليوم التالي ، احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مترافق ببيروكسيداز الفجل الحار (HRP) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة. الكشف عن نطاقات البروتين باستخدام نظام التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL).
   ملاحظة: تم قياس كثافة نطاق البروتين باستخدام برنامج ImageJ.

تم تحليل محلول مسحوق XY وعينات المصل من المجموعة الضابطة ومجموعة XY باستخدام UHPLC-QE-MS ، مما كشف عن قمم منفصلة جيدا. يتم عرض مخططات التأين الإجمالية لأوضاع الأيونات الموجبة والسالبة في الشكل 3. تم تحديد تكوين مغلي XY بناء على وقت الاستبقاء ووضع الاستحواذ وشظايا الطيف الكتلي. تم تحديد خمسة عشر مكونا لدخول الدم من خلال مقارنة مصل مجموعات الإعطاء الفموي الفارغة و XY مع مكونات محلول مسحوق XY (الجدول 1).

يشير الرسم البياني لخط حجم الورم إلى أنه بعد 21 يوما من التزقيم باستخدام مغلي XY ، انخفض حجم الورم في الفئران مقارنة بالمجموعة M وأظهر تأثيرا يعتمد على الجرعة (الشكل 4). لوحظ علم الأنسجة المرضي للورم باستخدام تلطيخ H & E (الشكل 5). في المجموعة M ، تم ترتيب الخلايا السرطانية بكثافة وأظهرت انتشارا نشطا ، مع وفرة الانقسام المرضي. مع زيادة جرعة مغلي XY ، أصبح ترتيب الخلايا السرطانية متناثرا تدريجيا ، وزاد الفضاء بين الخلايا. لوحظت درجات مختلفة من النخر في أنسجة الورم ، وكان الانقسام المرضي نادرا²¹.

للتحقق من تأثيرات مغلي XY على تكاثر وموت الخلايا المبرمج للأنسجة السرطانية في الفئران ، تم إجراء تجارب الكيمياء المناعية (IHC). بعد تلطيخ الأجسام المضادة Ki-67 و Caspase 3 ، لوحظت جزيئات بنية صفراء متناثرة في أقسام أنسجة الورم. بالمقارنة مع مجموعة M ، انخفضت مستويات Ki-67 في الأنسجة السرطانية لمجموعتي XY و DDP بالتتابع ، بينما زادت مستويات Caspase 3 (الشكل 6).

لتحديد ما إذا كان مغلي XY يمارس تأثيرات علاجية على سرطان الرئة الغدي من خلال مسار MAPK ، تم إجراء تحليل اللطخة الغربية على أنسجة الورم من الفئران. كما هو موضح في الشكل 7 ، أدى العلاج باستخدام مغلي XY إلى انخفاض في تعبير p-ERK ، حيث أظهرت مجموعة XY-H فرقا كبيرا مقارنة بالمجموعة M (ص < 0.001). زادت مستويات p-JNK و p-P38 في مجموعة XY-H مقارنة بالمجموعة M ، مع وجود فروق ذات دلالة إحصائية في مجموعة XY-H (p < 0.01) ومجموعة DDP (p < 0.05) مقارنة بالمجموعة M. بالإضافة إلى ذلك ، كان الفرق بين مجموعتي DDP و XY-H ذا دلالة إحصائية.

الشكل 1: مكونات مغلي XY. يعرض هذا الشكل الأدوية الفردية الموجودة في مغلي XY. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحضير مستخلص مائي مغلي XY. يوضح هذا الشكل عملية تحضير المستخلص المائي من مغلي XY. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل المستخلص المائي XY ديكوتيون. (أ) عملية استخراج المصل المحتوي على المخدرات. (ب) تحليل قياس الطيف الكتلي في وضع الأيونات الموجبة. (ج) تحليل قياس الطيف الكتلي في وضع الأيونات السالبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تأثيرات مغلي XY على حجم ورم الفأر ومورفولوجيته. (أ) زراعة الخلايا وزرع الورم وإجراءات أخذ العينات. (ب) الرسم البياني الخطي الذي يصور حجم الورم بمرور الوقت. (ج) مورفولوجيا الورم بعد 21 يوما من علاج التزقيم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحليل النسيجي لأنسجة ورم الفئران. (أ) يصبح ترتيب أنسجة الورم أكثر تناثرا مع زيادة جرعات مغلي XY ، مع وجود علامات نخر بطريقة تعتمد على الجرعة. (ب) الانقسام المرضي في أنسجة الورم ، مما يظهر انخفاضا في الانقسام المرضي مع زيادة جرعات مغلي XY. أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: مستويات تعبير Ki-67 و Caspase-3. (أ) مستويات التعبير Ki-67. (ب) مستويات تعبير Caspase-3. قضبان المقياس: 400 ميكرومتر. (ج) القياس الكمي للمناطق الإيجابية Ki-67 ، مما يدل على انخفاض مع زيادة جرعات مغلي XY. (د) القياس الكمي للمناطق الإيجابية ل Caspase-3 ، مما يدل على زيادة الجرعات من مغلي XY. ص < 0.001 ، **** ص < 0.0001 ؛ ns ، ليست مهمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: مستويات تعبير البروتين في مسار MAPK. (أ) تحليل اللطخة الغربية لتعبير البروتين. (ب) مستويات تعبير ERK. (ج) مستويات التعبير p-ERK. (د) مستويات تعبير JNK. (ه) مستويات التعبير p-JNK. (F) مستويات التعبير P38. (ز) مستويات التعبير p-P38. قام مغلي XY بتنظيم التعبير عن بروتينات p-JNK و p-P38 مع تقليل تنظيم تعبير p-ERK. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01 ، *** ص < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المكونات التي يتم امتصاصها في الدم بعد إعطاء مغلي XY. يسرد الجدول المكونات النشطة المكتشفة في الدم بعد إعطاء مغلي XY: أ: Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang) ، B: Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu) ، C: Trichosanthes kirilowii Maxim. (Tianhuafen) ، D: باناكس الجينسنغ C.A. مي (Renshen) ، E: Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang) ، F: مطحنة Ziziphus jujuba . var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren) ، G: Phragmites communis Trin. (لوجين).

يرتفع معدل الإصابة بالسرطان سنويا ، ويجذب اهتماما سريريا وبحثيا^{كبيرا 22،23}. أظهرت الدراسات الحديثة فعالية الطب الصيني التقليدي (TCM) في علاج سرطان الرئة^24،25،26. على سبيل المثال ، ثبت أن مغلي Maimendong يعزز عدد ونشاط الخلايا القاتلة الطبيعية ، وبالتالي تثبيط ورم خبيث لسرطان الرئة²⁷. وبالمثل ، حقق مغلي Mahuang Fuzi Xixin تأثيرات علاجية على سرطان الرئة من خلال التأثير على مسارات إشارات متعددة²⁸. تستخدم هذه الدراسة تحليل LC-MS والتجارب في الجسم الحي للتنبؤ بالآليات المحتملة التي يمارس بها مغلي XY تأثيرات علاجية على سرطان الرئة.

حدد تحليل LC-MS 15 مكونا لدخول الدم. من بين هؤلاء ، ثبت أن التريكسين وبيكروبودوفيلوتوكسين يثبطان مقاومة الأدوية ويقلل من مستويات التعبير عن p-PRKCA و SPHK1 و SPHK2 و EGFR ، وبالتالي قمع نشاط خلايا سرطان الرئة^29،30. جينسينوسيد Rg1 و Ginsenoside Rg3 ، مكونات باناكس الجينسنغ CA Meyer ، يمكن أن تمنع الانقسام الخلوي ، وتثبيط إشارات مسار mTOR ، وتمارس تأثيرات مضادة للأوعية ، وتعزز وظيفة المناعة ، وفي النهاية تمنع نمو الورم ورم خبيث مع تقليل مقاومة الأدوية^{31،32،33،34}. يمكن أن يؤدي الفستاكوز إلى موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الأمعاء عن طريق تعديل التعبير عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا^{المبرمج 35}. الإمبريالين ، قلويد ذو خصائص مضادة للالتهابات ومضادة للتكاثر ، لديه القدرة على أن يكون عاملا مضادا للأورام في مرحلة مبكرة³⁶. يمكن أن يوقف Peimine دورة الخلية عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج ، ويمنع هجرة الخلايا من خلال إجهاد الشبكة الإندوبلازمية ، وينظم تعبير البروتين المرتبط بمسار NF-κB لقمع نمو خلايا سرطان الثدي^{والمعدة 37،38}. تم الإبلاغ عن أن Aucubin و Jujuboside B يعززان الالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية مع تثبيط تكوين الأوعية الدموية ، وبالتالي ممارسة تأثيرات مضادة^{للأورام 39،40،41}.

يعد مسار MAPK ضروريا لمختلف العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تنشيط الخلايا ، والتكاثر ، والالتهام الذاتي ، وموت الخلايا المبرمج. العديد من المركبات المكتشفة في مكونات دخول الدم في مغلي XY ، مثل Ginsenoside Rg1 و Ginsenoside Rg3 و Peimine و Jujuboside B ، قد تمارس تأثيرات مضادة للأورام من خلال مسار MAPK^{42،43،44،45}. يتضمن مسار MAPK شلالات إشارات ERK و JNK و P38 ويتم دراسته على نطاق واسع في أبحاث السرطان نظرا لدوره في تنظيم العمليات الفسيولوجية من خلال تنشيط سلسلة البروتين ل MAP3K-MAP2K-MAPK^46،47.

يحفز تنشيط مسار ERK تكاثر الخلايا ويمنع موت الخلايا المبرمج عن طريق تنظيم نشاط وتعبير البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج والمضادة لموت الخلايا المبرمج على مستويات النسخ والترجمة^48،49. تمت دراسة مثبطات البروتين التي تستهدف مسار ERK على نطاق واسع وتستخدم في علاج السرطان^50،51،52. كما ثبت أن مونومرات وتركيبات الطب الصيني التقليدي (TCM) تمارس تأثيرات مضادة للأورام عن طريق تعديل مسار ERK. على سبيل المثال ، تمنع صيغة QYHJ تكاثر خلايا سرطان الغدة الأقنية البنكرياسية وتعزز موت الخلايا المبرمج عن طريق تنظيم التعبير عن p-P38 و p-ERK1 / 2⁵³. تمنع مشتقات حمض الفيروليك التكاثر ، وتوقف دورة الخلية ، وتحفز موت الخلايا المبرمج في خط خلايا سرطان الرئة البشري A549⁵⁴.

يلعب مسار JNK / P38 أدوارا مميزة من خلال تنظيم بروتينات المستجيب النهائية المختلفة من خلال الفسفرة ، وبالتالي التأثير على دورة الخلية ، وتكاثر الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج^55،56. أظهرت الدراسات أن التريبتوليد يعدل التعبير عن p-P38 و p-JNK ويمنع تكاثر خلايا A549 ، مما يمارس تأثيرات مضادة^{للأورام 57}. بالإضافة إلى ذلك ، يحفز البيكالين موت الخلايا المبرمج في خلايا HeLa من خلال التأثير على تعبير p-P38 و p-JNK⁵⁸. أظهرت الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر أن حقن Aidi يؤثر على التعبير عن p-JNK و p-P38 في خلايا HepG2 ونماذج الفئران السرطانية الكبدية ، وبالتالي تثبيط تكاثر الورم⁵⁹.

Ki-67 و Caspase 3 هما مؤشران رئيسيان لتكاثر الورم وموت الخلايا المبرمج. Ki-67 هو بروتين نووي يتم التعبير عنه بشكل كبير أثناء تكاثر الخلايا وهو غائب في الخلايا الهادئة (مرحلة G0)⁶⁰. نظرا لأن تطور الورم يرتبط ارتباطا وثيقا بتكاثر الخلايا ، فقد اكتسبت الأبحاث حول العلاقة بين Ki-67 وتكوين الأورام اهتماما كبيرا. يرتبط تعبير Ki-67 ارتباطا إيجابيا بالورم الخبيث والعدوانية والتشخيص^61،62 ، مما يجعله مؤشرا حيويا مستخدما على نطاق واسع لانتشار السرطان⁶³. تمت دراسته على نطاق واسع في التسبب في سرطان الجهاز الهضمي والرئة والثدي وعنق الرحم^{والتشخيص 64،65،66،67}.

تتكون عائلة الكاسباز من إنزيمات محللة للبروتين تنظم موت الخلايا المبرمج والالتهابات. Caspase 3 ، الموجود بشكل أساسي في السيتوبلازم ، هو مؤثر رئيسي لموت الخلايا المبرمج. يسهل موت الخلايا عن طريق شق بروتينات الهيكل الخلوي ، وتعطيل البروتينات المثبطة لموت الخلايا المبرمج ، وتحطيم إنزيمات إصلاح الحمض النووي^68،69،70. يمكن أن تؤثر التعديلات في تعبير Caspase 3 على حساسية الخلايا السرطانية للعلاج الكيميائي ، مما يؤثر على الغزو والورم الخبيث وتطور السرطانات المختلفة^{71،72،73،74}.

أظهرت هذه الدراسة أن مغلي XY يمنع تكاثر الورم في الفئران الحاملة للورم LLC بطريقة تعتمد على الجرعة. كشف التحليل المرضي للأنسجة السرطانية من مجموعات العلاج XY و DDP عن ترتيبات خلايا أكثر مرونة مقارنة بالمجموعة M ، إلى جانب انخفاض الانقسام المرضي. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ نخر ونزيف في أنسجة الورم في مجموعات العلاج. أكدت نتائج الكيمياء المناعية (IHC) أيضا أن مغلي XY يمنع تكاثر الخلايا السرطانية ويعزز موت الخلايا المبرمج بطريقة تعتمد على الجرعة. أشار تحليل اللطخة الغربية لأنسجة الورم إلى تغييرات كبيرة في مستويات التعبير عن البروتينات الرئيسية في مسار MAPK. بشكل عام ، تشير النتائج المرضية و IHC إلى أن مغلي XY يمارس تأثيرات علاجية ضد سرطان الرئة الغدي عن طريق تعديل التعبير عن البروتينات في مسار إشارات MAPK.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

وحظي هذا العمل بدعم من البند (YDZJ202301ZYTS459) من خطة تطوير العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيلين.