小鼠肺腺癌异种移植模型的构建及MAPK通路XY煎药效果评价

本研究表明，XY 煎剂通过调节 MAPK 通路对肺腺癌发挥治疗作用。

肺腺癌在世界范围内呈上升趋势，促使探索和开发有效的治疗方法。近年来，中医治疗肺腺癌的潜力，如小益 （XY） 汤剂，已得到越来越多的认可。中医治疗肺腺癌的作用机制仍有待阐明。本研究采用动物模型探讨 XY 煎汤治疗肺腺癌的疗效。分离 XY 煎汤在小鼠体内的进血化学成分，并使用 UHPLC-QE-MS 在正离子和负离子模式下进行分析。然后通过 体内 实验验证了这些发现，该实验表明肿瘤大小减小、病理变化改善和细胞凋亡增加。结果，鉴定出 XY 煎剂给药后吸收到血液中的 15 种成分：淀粉样子、槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖基-7-O-α-吡喃鼠李糖苷;帝王;棘松素 B;裴明;黄酮碱 + 3O、2MeO、O-Hex;Picropophyllotoxin;（2S，3R，4S，5S，6R）-2-[（2R，3R，4S，5S，6R）-4,5-二羟基-2 [[（3S，5R，8R，10R，12R，13R，14R，17S）-12-羟基-17-（2-羟基-6-甲基庚-5-烯-2-基） 4,4,8,10,14-五甲基-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-十二氢-1H环戊[a]菲-3-基]氧基]-6-（羟甲基）氧杂-6-（羟甲基）氧-6-（羟甲基）氧烷-3,4,5-三醇;三元;人参皂苷 Rg1;（20R）-人参皂苷 Rh1;枣苷 B;奥库宾;人参皂苷 Rg3;和 β-Elemonic 酸。动物实验表明，XY 煎剂抑制肿瘤生长，改善病理变化，并以剂量依赖性方式促进肿瘤细胞凋亡。所涉及的机制可能与 MAPK 通路中 p-JNK 和 p-P38 蛋白表达的上调以及 MAPK 通路中 p-ERK 蛋白表达的下调有关。综上所述，XY 煎剂具有调节 MAPK 通路的潜力，对肺腺癌发挥治疗作用。

肺癌发病率在全球范围内不断上升。它占所有恶性肿瘤的 18%，并导致大量癌症相关死亡 ^1,2。非小细胞肺癌 （NSCLC） 是一种常见的肺癌形式，腺癌是主要的³ 型病理。由于其隐匿的症状，NSCLC 通常在晚期被诊断出来，并且死亡率很高 ^4,5。IV 期 NSCLC 患者的 5 年生存率仅为 5%⁶，而即使是可手术切除的早期 NSCLC 的 5 年生存率也仅为 50%⁷。

目前，肺腺癌的治疗包括手术、放疗、化疗、免疫治疗和靶向治疗。此外，治疗肺腺癌的中医 （TCM） 越来越受到认可和重视⁸。中医历史悠久，已被用于治疗各种肿瘤疾病，并具有有效的治疗效果 ^9,10。它把人体看作一个整体，其治疗原理侧重于恢复气（气是指促进血液和体液循环的生命能量，有助于增强免疫力和减少NSCLC患者的炎症）在内部器官的运动，以恢复整体平衡并抑制癌症进展。

中医不仅治疗毒性低、靶点多、效率高的肿瘤疾病¹¹，而且还有助于修复放化疗造成的损伤，从而延长生存时间¹²。

液相色谱-质谱 （LC-MS） 技术将液相色谱与质谱相结合，以实现复杂化合物混合物中组分的分离和检测¹³.LC-MS 具有高分辨率、高灵敏度和高特异性，可用于分离和鉴定中药 （TCM） 汤剂中的各种化学成分。当与口服给药后分离和检测进入血液的活性成分的血清药物化学相结合^时 14,15，LC-MS 能够预测和分析潜在的药物作用机制。这种方法有助于了解中药汤剂的化学成分和药理成分，为深入研究其药理作用和临床应用提供重要数据，使其在中医研究中具有高度适用性^16,17。

MAPK 信号通路在肺癌的发生、进展、转移和侵袭中起着至关重要的作用，其中 Erk、p38 和 JNK 是重要的亚家族。中药煎剂已被证明会影响 MAPK 通路中蛋白质的表达¹⁸。孝益 （XY） 汤来源于益关汤，在长春中医药大学第一附属医院用于治疗肺腺癌（图 1），显示出精确的临床疗效。然而，其治疗机制仍不清楚。

本研究采用超高效液相色谱-Q-Exactive Orbitrap 质谱联用技术 （UHPLC-QE-MS） 阐明 XY 煎汤治疗肺腺癌的可能治疗机制，并通过 体内 研究验证了其效果。

所有动物程序均经长春中医药大学动物伦理委员会（伦理2024008号）批准。在无特定病原体 （SPF） 条件下繁殖的 6 周龄 C57BL/6 雄性小鼠 （20 ± 2 g），在恒温恒湿的受控环境中表现出典型的身体活动模式。它们可以 随意 获取食物和水，并保持在 12 小时的光照/黑暗周期下。材料表中提供了本研究中使用的试剂和设备的详细信息 。

1. XY煎剂水提液的制备

1. 将 人参 C.A. Mey（仁参，15 克）、 Chinemys reevesii （Gray）（桂板，30 克）和 Trionyx sinensis Wiegmann（比佳，30 克）放入煎锅中。加入 1000 mL 去离子水，在室温下浸泡 30 分钟。
2. 将步骤 1.1 中的三种草药煮沸 1 小时。同时，浸泡 Rehmannia glutinosa Libosch （Dihuang， 30 g）， Trichosanthes kirilowii Maxim.（天花粉， 30 g）， Coix lacryma-jobi L. var. mayuen （Roman.）Stapf（益益人，20 克）， 芍药 Pall。（百韶，30 克）， 乳香 carterii Birdw。（如香， 7 克）， Commiphora myrrha Engl. （Moyao， 7 g）， Agrimonia pilosa Ledeb.（仙合草，20 g）， Alpinia oxyphylla Miq.（益智人，20 克）， Ziziphus jujuba Mill。 spinosa （Bunge） （Suanzaoren， 30 g）， Melia toosendan Sieb.et Zucc.（Chuanlianzi， 5 g）， Fritillaria thunbergii Miq.（Zhebeimu， 15 g）， Anemarrhena asphodeloides Bge.（芝木，10 g），桔梗 grandiflorum （Jacq.）（Jiegeng， 10 g）， Polygala tenuifolia Willd.（元植，15 克）和 Phragmites communis Trin。（Lugen，30 克）在另一个容器中放置 30 分钟。浸泡后，将它们转移到步骤 1.1 中的煎锅中。
3. 将步骤 1.1 和步骤 1.2 中的所有 18 种草药煮沸 30 分钟。倒出草药液，加入 1000 mL 去离子水，再煮 30 分钟。重复这个煮沸过程 3 次，得到三份草药液，然后混合并充分混合。
4. 通过 400 目布过滤混合草药液。减压浓缩滤液，然后将浓缩的草药液转移到冷却设备中进一步处理。
5. 将浓缩的草药液倒入冻干盘中，放入真空冻干机的预冷冻室中。预冻完成后，将托盘转移到升华干燥室以去除水分。
6. 在高温下去除任何残留的水分。使用粉碎机将冻干的草药提取物粉碎，以获得细的冻干 XY 煎剂粉末（图 2）。

2. 含药血清制剂

1. 将 6 周龄 C57BL/6 雄性小鼠 （20 ± 2 g） 随机分配到小益 （XY） 组或对照组。
   注：小鼠剂量是使用人与小鼠的转换因子计算的：
   小鼠的等效实验剂量 （g/kg） = {人剂量 （g/kg） / 体重 （70 kg）} x 9.1
   根据此计算，确定小鼠的剂量为 2.6 g/kg。
2. 称取 0.9152 g 冻干 XY 煎剂粉，将其溶于 3.2 mL 蒸馏水中，制备药物溶液。
   注意：小鼠在口服给药前禁食 12 小时。
3. 通过强饲法将 XY 煎剂给予 XY 组中的小鼠，同时用等体积的去离子水给予对照组。
4. 口服给药后 2 小时，用戊巴比妥钠麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。使用镊子摘除眼球以收集血液样本，然后按照伦理准则¹⁹ 通过 CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位。
5. 让血液样品在室温下稳定 90 分钟。在 3450 x g （4 °C） 下离心 15 分钟以收集上清液。

3. UHPLC-QE-MS 分析

1. 将 100 mg XY 煎剂冻干粉添加到 500 μL 提取溶液（甲醇：水 = 4：1）中。充分混合，超声处理，并在冰水浴中孵育 1 小时。
2. 将混合物在 -40 °C 下保持 1 小时，然后在 13,800 x g （4 °C） 下离心 15 分钟。通过 0.22 μm 滤膜过滤上清液，然后混合 100 μL 每种上清液以制备质量控制 （QC） 样品。
3. 解冻血浆样品后，取 400 μL 对照组血浆样品和 400 μL XY 组血浆样品。向每个样品中加入 40 μL 盐酸 （2 mol/L）。涡旋 1 分钟，让混合物在 4 °C 下静置 15 分钟。重复此步骤四次。
4. 加入 1.6 mL 乙腈并涡旋 5 分钟。在 4 °C 下以 13,800 x g 离心 5 分钟。 对 1,800 μL 上清液进行氮气干燥。
5. 涡旋 5 分钟，在 150 μL 含 10 μg/mL 内标的 80% 甲醇中复溶干燥的样品。在 4 °C 下以 13,800 × g 离心 5 分钟，然后将 120 μL 上清液转移到新鲜玻璃样品瓶中进行 LC-MS 分析（图 3）。

4. 细胞培养和动物制备

1. 将 1 mL Lewis 肺癌细胞接种在含有补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的培养皿中。在 37 °C 和 5% CO₂ 的受控条件下孵育细胞。
2. 当细胞达到 80% 汇合时，使用 0.25% 胰蛋白酶传代它们。继续传代直至细胞状态稳定，然后将细胞浓度调节至 3 x 10⁶ 个细胞/mL。
3. 将 0.1 mL 制备的细胞悬液皮下注射到雄性 C57BL/6 小鼠的右腋窝中，以建立肺腺癌模型。
   注：接种后 5 天可在小鼠的腋窝中触诊肿瘤组织。
4. 5 天后，将小鼠随机分为五组（每组 n = 6）：模型组 （M） - 无治疗;XY煎剂低剂量组（XY-L） - 1.3g / kg;XY煎汤中剂量组（XY-Z） - 2.6g / kg;XY煎汤高剂量组（XY-H） - 5.2g / kg;顺铂组 （DDP） - 用顺铂²⁰ 治疗。
5. 将 XY 煎剂粉末以相应剂量溶解在 200 μL 蒸馏水中， 并通过管饲 法给药。M 和 DDP 组 通过 管饲法接受等体积的蒸馏水。
6. 通过腹膜内注射 （3 mg/kg） 每 3 天一次给 DDP 组施用顺铂。将相同体积的生理盐水注射到其他组中。

5. 肿瘤组织的病理分析

1. 21 天后，使用 CO₂ 窒息对所有小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位（遵循伦理指南）并切除肿瘤组织²¹。测量肿瘤体积和重量（图 4）。
2. 将切除的肿瘤组织在 4% 多聚甲醛中固定 24 小时）。使用分级乙醇溶液使组织脱水。
3. 使用二甲苯清除脱水的组织块，然后将它们包埋在融化的石蜡中。让蜡凝固成石蜡块。使用切片机将组织块切成 5 μm 厚的切片。
4. 在二甲苯中对组织切片脱蜡，然后在分级乙醇溶液中再水化。用苏木精对切片染色 5 分钟，然后用去离子水冲洗。
5. 用 0.5% 伊红溶液对切片进行复染 1 分钟。在光学显微镜下观察染色切片并捕获图像进行分析。

6. 肿瘤组织的免疫组化分析

1. 按照步骤 5.2-5.4 中描述的程序执行脱蜡和再水化。
2. 将切片在内源性过氧化物酶阻滞剂中在室温下孵育 15 分钟。通过将切片与山羊血清一起孵育来阻断非特异性结合。
3. 应用一抗：Ki-67 （1：600） 和 Caspase-3 （1：100）。将切片在 4 °C 下孵育过夜。 用 PBS 缓冲液洗涤），然后应用通用二抗 （1：500） 并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
4. 通过添加 DAB 溶液来显色反应。用苏木精溶液对切片进行复染。
5. 对染色切片进行脱水、透明化和密封。在光学显微镜下观察蛋白质表达并捕获图像进行分析。

7. 蛋白质印迹分析

1. 使用组织裂解剂匀浆肿瘤组织。提取总蛋白并使用二辛可宁酸 （BCA） 测定试剂盒测定其浓度（参见 材料表）。
2. 进行蛋白质定量，然后进行 SDS-PAGE 电泳和蛋白质转印到膜上。
3. 将膜在4°C下与一抗孵育过夜：P38 （1：2000）、p-P38 （1：1000）、ERK （1：20000）、p-ERK （1：500）、JNK （1：2000）、p-JNK （1：5000）、β-肌动蛋白 （1：200）（参见 材料表）。
4. 第二天，将膜与辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗在室温下孵育 1.5 小时。使用增强型化学发光 （ECL） 系统检测蛋白质条带。
   注意：使用 ImageJ 软件量化蛋白质条带强度。

使用 UHPLC-QE-MS 分析 XY 粉末溶液和对照组和 XY 组的血清样品，发现峰分离良好。正离子和负离子模式的总电离图如图 3 所示。根据保留时间、采集模式和质谱碎片离子确定 XY 煎剂的组成。通过将空白和 XY 煎剂口服组的血清与 XY 粉溶液的成分进行比较，鉴定出 15 种入血成分（表 1）。

肿瘤体积线图表明，用 XY 煎剂灌胃 21 天后，与 M 组相比，小鼠的肿瘤体积减少，并表现出剂量依赖性效应（图 4）。使用 H&E 染色观察肿瘤组织病理学 （图5）。在 M 组中，肿瘤细胞排列密集，表现出活跃的增殖，伴有丰富的病理性有丝分裂。随着 XY 煎剂剂量的增加，肿瘤细胞的排列逐渐变得稀疏，细胞间隙增加。在肿瘤组织中观察到不同程度的坏死，病理性有丝分裂罕见²¹。

为验证 XY 煎药对小鼠肿瘤组织增殖和凋亡的影响，进行了免疫组化 （IHC） 实验。用 Ki-67 和 Caspase 3 抗体染色后，在肿瘤组织切片中观察到散在的棕黄色颗粒。与 M 组相比，XY 和 DDP 组肿瘤组织中的 Ki-67 水平依次下降，而 Caspase 3 水平升高（图 6）。

为确定 XY 煎剂是否通过 MAPK 通路对肺腺癌产生治疗作用，对小鼠肿瘤组织进行 Western blot 分析。如图 7 所示，XY 煎剂处理导致 p-ERK 表达降低，XY-H 组与 M 组相比表现出显着差异 （p < 0.001）。与 M 组相比，XY-H 组的 p-JNK 和 p-P38 水平升高，与 M 组相比，XY-H 组 （p < 0.01） 和 DDP 组 （p < 0.05） 观察到统计学显着差异。此外，DDP 组和 XY-H 组之间的差异具有统计学意义。

图 1：XY 煎剂的成分。 该图显示了 XY 煎剂中所含的单个药物。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：XY 煎剂水提取物的制备。 该图说明了 XY 煎剂水提取物的制备过程。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：XY 煎剂水提取物的分析。 （A） 含药物血清的提取过程。（B） 正离子模式下的质谱分析。（C） 负离子模式下的质谱分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：XY 煎剂对小鼠肿瘤体积和形态的影响。 （A） 细胞培养、肿瘤植入和取样程序。（B） 描述肿瘤体积随时间变化的折线图。（C） 管饲法治疗 21 天后的肿瘤形态。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：小鼠肿瘤组织的组织学分析。 （A） 随着 XY 煎剂剂量的增加，肿瘤组织排列变得更加稀疏，具有剂量依赖性坏死迹象。（B） 肿瘤组织中的病理性有丝分裂，显示病理性有丝分裂随着 XY 煎剂剂量的增加而减少。比例尺：200 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 6：Ki-67 和 Caspase-3 表达水平。 （A） Ki-67 表达水平。（B） Caspase-3 表达水平。比例尺：400 μm。（C） Ki-67 阳性区域的定量，显示随着 XY 煎剂剂量的增加而减少。（D） Caspase-3 阳性区域的定量，显示随着 XY 煎剂剂量的增加而增加。p < 0.001， ******p < 0.0001;ns，不显著。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7：MAPK 通路中的蛋白质表达水平。 （A） 蛋白质表达的 Western blot 分析。（B） ERK 表达水平。（C） p-ERK 表达水平。（D） JNK 表达水平。（E） p-JNK 表达水平。（F） P38 表达水平。（G） p-P38 表达水平。XY 煎剂上调 p-JNK 和 p-P38 蛋白的表达，同时下调 p-ERK 的表达。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：XY 煎剂给药后吸收到血液中的成分。下表列出了 XY 煎剂给药后在血液中检测到的活性成分：A： 地 黄 （Dihuang），B： 贝母 （Fritillaria thunbergii Miq）。（Zhebeimu）， C： Trichosanthes kirilowii Maxim.（天花粉）， D： 人参 C.A. Mey （Renshen）， E： 乳香 Birdw .（如香）， F： Ziziphus jujuba Mill.var. spinosa （Bunge） （Suanzaoren）， G： 芦苇 Trin.（卢根）。

癌症的发病率每年都在上升，引起了临床和研究的浓厚兴趣^22,23。最近的研究表明，中医 （TCM） 治疗肺癌的有效性 24,25,26。例如，麦门冬汤已被证明可以提高 NK 细胞的数量和活性，从而抑制肺癌转移²⁷。同样，麻黄复子西心汤通过影响多种信号通路对肺癌达到治疗效果²⁸。本研究利用 LC-MS 分析和体内实验来预测 XY 煎剂对肺腺癌产生治疗作用的可能机制。

LC-MS 分析鉴定了 15 种血液进入成分。其中，tricin 和 picropophyllotoxin 已被证明可以抑制耐药性并降低 p-PRKCA、SPHK1、SPHK2 和 EGFR 的表达水平，从而抑制肺癌细胞活性^29,30。人参皂苷 Rg1 和人参皂甙 Rg3 是人参 C.A. Meyer 的成分，可以阻断细胞有丝分裂，抑制 mTOR 通路信号传导，发挥抗血管生成作用，增强免疫功能，最终抑制肿瘤生长和转移，同时降低耐药性 31,32,33,34。淀粉样子糖可通过调节促凋亡蛋白的表达来诱导肠癌细胞凋亡³⁵。Imperialine 是一种具有抗炎和抗增殖特性的生物碱，具有作为早期抗肿瘤剂的潜力³⁶。Peimine 可以通过诱导细胞凋亡来阻止细胞周期，通过内质网应激抑制细胞迁移，并调节 NF-κB 通路相关蛋白表达以抑制乳腺癌和胃癌细胞的生长^37,38。据报道，Aucubin 和 Jujuboside B 可促进肿瘤细胞自噬和凋亡，同时抑制血管生成，从而发挥抗肿瘤作用 39,40,41。

MAPK 通路对于各种生物过程至关重要，包括细胞活化、增殖、自噬和细胞凋亡。在 XY 煎剂的入血成分中检测到的几种化合物，如人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rg3、培胺和大枣苷 B，可能通过 MAPK 途径发挥抗肿瘤作用 42,43,44,45。MAPK 通路涉及 ERK、JNK 和 P38 信号转导级联反应，由于其通过 MAP3K-MAP2K-MAPK 的蛋白级联激活在调节生理过程中的作用，因此在癌症研究中被广泛研究^46,47。

ERK 通路的激活通过在转录和翻译水平调节促凋亡和抗凋亡蛋白的活性和表达来刺激细胞增殖并抑制细胞凋亡^48,49。靶向 ERK 通路的蛋白质抑制剂已得到广泛研究，并用于癌症治疗 50,51,52。中药 （TCM） 单体和制剂也被证明通过调节 ERK 通路发挥抗肿瘤作用。例如，QYHJ 配方通过调节 p-P38 和 p-ERK1/2 的表达来抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖并促进细胞凋亡⁵³。阿魏酸衍生物抑制增殖，阻止细胞周期，并诱导 A549 人肺癌细胞系凋亡⁵⁴。

JNK/P38 通路通过磷酸化调节不同的下游效应蛋白，从而影响细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡，从而发挥不同的作用^55,56。研究表明，雷公藤甲素可调节 p-P38 和 p-JNK 的表达并抑制 A549 细胞的增殖，发挥抗肿瘤作用⁵⁷。此外，黄芩素通过影响 p-P38 和 p-JNK 表达诱导 HeLa 细胞凋亡⁵⁸。体内和体外研究表明，Aidi 注射液会影响 HepG2 细胞和肝细胞癌小鼠模型中 p-JNK 和 p-P38 的表达，从而抑制肿瘤增殖⁵⁹。

Ki-67 和 Caspase 3 是肿瘤增殖和细胞凋亡的关键指标。Ki-67 是一种核蛋白，在细胞增殖过程中高度表达，在静止细胞（G0 期）中不存在⁶⁰。由于肿瘤发展与细胞增殖密切相关，因此关于 Ki-67 与肿瘤发生之间相关性的研究受到了极大的关注。Ki-67 表达与肿瘤恶性、侵袭性和预后呈正相关^61,62，使其成为广泛使用的癌症增殖生物标志物⁶³。它在胃肠道癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌的发病机制和预后中得到了广泛的研究 64,65,66,67。

caspase 家族由调节细胞凋亡和炎症的蛋白水解酶组成。Caspase 3 主要存在于细胞质中，是细胞凋亡的关键效应子。它通过裂解细胞骨架蛋白、灭活凋亡抑制蛋白和降解 DNA 修复酶来促进细胞死亡 68,69,70。Caspase 3 表达的改变会影响肿瘤细胞对化疗的敏感性，从而影响各种癌症的侵袭、转移和进展 71,72,73,74。

本研究表明，XY 煎剂以剂量依赖性方式抑制 LLC 荷瘤小鼠的肿瘤增殖。XY 和 DDP 治疗组肿瘤组织的病理分析显示，与 M 组相比，细胞排列更松散，病理性有丝分裂减少。此外，在治疗组的肿瘤组织中观察到坏死和出血。免疫组化 （IHC） 结果进一步证实 XY 煎剂抑制肿瘤细胞增殖，以剂量依赖性方式促进细胞凋亡。肿瘤组织的 Western blot 分析表明 MAPK 通路中关键蛋白的表达水平发生显着变化。总体而言，病理和 IHC 结果表明，XY 煎剂通过调节 MAPK 信号通路中蛋白质的表达对肺腺癌发挥治疗作用。

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了吉林省科技发展计划项目 （YDZJ202301ZYTS459） 的支持。