בניית מודל Xenograft של אדנוקרצינומה ריאתית בעכברים והערכת היעילות של מרתח XY באמצעות מסלול MAPK

מחקר זה מדגים כי מרתח XY מפעיל השפעות טיפוליות נגד אדנוקרצינומה של הריאות על ידי ויסות מסלול MAPK.

אדנוקרצינומה של הריאות הולכת וגוברת ברחבי העולם, מה שמעודד חקירה ופיתוח של שיטות טיפול יעילות. בשנים האחרונות הוכר יותר ויותר הפוטנציאל הטיפולי של הרפואה הסינית המסורתית לאדנוקרצינומה של הריאות, כמו מרתח XiaoYi (XY). מנגנון הפעולה של הרפואה הסינית המסורתית בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות ממשיך להתבהר. במחקר זה, נעשה שימוש במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של מרתח XY בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות. המרכיבים הכימיים הנכנסים לדם של מרתח XY בעכברים הופרדו ונותחו במצבי יונים חיוביים ושליליים באמצעות UHPLC-QE-MS. הממצאים אומתו לאחר מכן באמצעות ניסויים in vivo , שהראו גודל גידול מופחת, שינויים פתולוגיים משופרים ואפופטוזיס מוגבר. כתוצאה מכך זוהו חמישה עשר רכיבים שנספגו בדם לאחר מתן מרתח XY: סטכיוז, קוורצטין-3-O-בטא-גלוקופירנוזיל-7-O-אלפא-רמנופירנוזיד; אימפריאלין; ספינוזין B; פיימין; בסיס פלבון + 3O, 2MeO, O-Hex; Picropodophyllotoxin; (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-דיהידרוקסי-2 [[(3S,5R,8R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-הידרוקסי-17-(2-הידרוקסי-6-מתיל-הפט-5-en-2-yl) 4,4,8,10,14-פנטמתיל-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H ציקלופנטה[a]פננתרן-3-yl]אוקסי]-6-(הידרוקסימתיל)אוקסן-3-יל]אוקסי-6-(הידרוקסימתיל)אוקסן-3,4,5-טריול; טריצין; ג'ינסנוסיד Rg1; (20R)-Ginsenoside Rh1; Jujuboside B; אוקובין; ג'ינסנוסיד Rg3; וחומצה בטא-אלמונית. ניסויים בבעלי חיים הראו כי מרתח XY עיכב את צמיחת הגידול, שיפר שינויים פתולוגיים וקידם אפופטוזיס של תאי גידול באופן תלוי מינון. המנגנונים המעורבים עשויים להיות קשורים לוויסות מוגבר של ביטוי חלבון p-JNK ו-p-P38 במסלול MAPK ולהפחתת ויסות ביטוי חלבון p-ERK במסלול MAPK. לסיכום, למרתח XY יש פוטנציאל לווסת את מסלול ה-MAPK ולהפעיל השפעות טיפוליות נגד אדנוקרצינומה של הריאות.

שכיחות סרטן הריאות עולה ברחבי העולם. הוא מהווה 18% מכלל הגידולים הממאירים ואחראי למספר משמעותי של מקרי מוות הקשורים לסרטן ^1,2. סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) הוא צורה נפוצה של סרטן ריאות, כאשר אדנוקרצינומה היא סוג³ הפתולוגי העיקרי. בשל התסמינים הערמומיים שלו, NSCLC מאובחן לרוב בשלב מתקדם ויש לו שיעור תמותה גבוה ^4,5. לחולי NSCLC בשלב IV יש שיעור הישרדות של חמש שנים של 5% ^בלבד6, בעוד שאפילו ל-NSCLC בשלב מוקדם הניתן לכריתה בניתוח יש שיעור הישרדות של חמש שנים של 50% ^בלבד7.

נכון לעכשיו, הטיפול באדנוקרצינומה של הריאות כולל ניתוח, הקרנות, כימותרפיה, אימונותרפיה וטיפול ממוקד. בנוסף, הרפואה הסינית המסורתית (TCM) לאדנוקרצינומה של הריאות זוכה להכרה ומוערכת יותר ויותר⁸. לרפואה הסינית המסורתית יש היסטוריה ארוכה והיא שימשה לטיפול במחלות אונקולוגיות שונות עם תוצאות טיפוליות יעילות ^9,10. הוא מתייחס לגוף האדם כישות שלמה, כאשר העיקרון הטיפולי מתמקד בשיקום תנועת הצ'י (צ'י מתייחס לאנרגיה החיונית המקדמת את זרימת הדם ונוזלי הגוף, תורמת לשיפור החסינות ולהפחתת דלקת בחולי NSCLC) באיברים פנימיים כדי להחזיר את האיזון הכללי ולעכב את התקדמות הסרטן.

הרפואה הסינית המסורתית לא רק מטפלת במחלות אונקולוגיות בעלות רעילות נמוכה, מטרות מרובות ויעילות גבוהה¹¹, אלא היא גם מסייעת בתיקון נזקים שנגרמו על ידי הקרנות וכימותרפיה, ובכך מאריכה את ההישרדות¹².

טכנולוגיית כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) משלבת כרומטוגרפיה נוזלית עם ספקטרומטריית מסה כדי להשיג הפרדה וזיהוי של רכיבים בתערובות מורכבות¹³. LC-MS מציע רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה וסגוליות גבוהה, המאפשרים הפרדה וזיהוי של רכיבים כימיים שונים במרתחים של הרפואה הסינית המסורתית (TCM). בשילוב עם כימיה רפואית בסרום, המפרידה ומזהה רכיבים פעילים הנכנסים לדם לאחר מתן דרך הפה^14,15, LC-MS מאפשר חיזוי וניתוח של מנגנוני פעולה פוטנציאליים של תרופות. גישה זו מסייעת בהבנת ההרכב הכימי והמרכיבים הפרמקולוגיים של מרתחי הרפואה הסינית המסורתית, ומספקת נתונים חיוניים למחקר מעמיק על ההשפעות הפרמקולוגיות והיישומים הקליניים שלהם, מה שהופך אותה לשימושית ביותר במחקר הרפואה הסינית^{המסורתית 16,17}.

מסלול האיתות MAPK ממלא תפקיד מכריע בהתהוות, התקדמות, גרורות ופלישה לסרטן הריאות, כאשר Erk, p38 ו-JNK הן תת-משפחות חשובות. מרתחי TCM הוכחו כמשפיעים על ביטוי החלבונים במסלול MAPK¹⁸. מרתח XiaoYi (XY) נגזר ממרתח YiGuan ומשמש לטיפול באדנוקרצינומה של הריאות בבית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (איור 1), מה שמדגים יעילות קלינית מדויקת. עם זאת, המנגנון הטיפולי שלו נותר לא ברור.

במחקר זה, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-QE-MS) כדי להבהיר את המנגנון הטיפולי האפשרי של מרתח XY נגד אדנוקרצינומה של הריאות, והשפעותיו אומתו באמצעות מחקרי in vivo .

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית מסורתית (אתיקה מס' 2024008). עכברים זכרים בני שישה שבועות C57BL/6 (20 ± 2 גרם), שגודלו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים (SPF), הפגינו דפוסי פעילות גופנית אופייניים בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה ולחות קבועים. הייתה להם גישה חופשית למזון ומים והם נשמרו במחזור אור/חושך של 12 שעות. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנת תמצית מימית מרתח XY

1. מניחים ג'ינסנג קוריאני C.A. Mey (רנשן, 15 גרם), Chinemys reevesii (אפור) (Guiban, 30 גרם) ו-Trionyx sinensis Wiegmann (Biejia, 30 גרם) לסיר מרתח. מוסיפים 1000 מ"ל מים נטולי יונים ומשרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. מרתיחים את שלושת עשבי התיבול משלב 1.1 למשך שעה. במקביל, יש להשרות את Rehmannia glutinosa Libosch (דיהואנג, 30 גרם), Trichosanthes kirilowii Maxim. (Tianhuafen, 30 גרם), Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (רומית.) Stapf (Yiyiren, 20 גרם), Paeonia lactiflora Pall. (Baishao, 30 גרם), Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang, 7 גרם), Commiphora myrrha Engl. (Moyao, 7 גרם), Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao, 20 גרם), Alpinia oxyphylla Miq. (יז'ירן, 20 גרם), טחנת Ziziphus jujuba . var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren, 30 גרם), Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Chuanlianzi, 5 גרם), Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu, 15 גרם), Anemarrhena asphodeloides Bge. (ז'ימו, 10 גרם), Platycodon grandiflorum (Jacq.) (Jiegeng, 10 גרם), Polygala tenuifolia Willd. (Yuanzhi, 15 g), ו-Phragmites communis Trin. (לוגן, 30 גרם) במיכל אחר למשך 30 דקות. לאחר ההשריה, העבירו אותם לסיר המרתח משלב 1.1.
3. מרתיחים את כל 18 עשבי התיבול משלב 1.1 ושלב 1.2 למשך 30 דקות. שופכים את נוזל הצמחים, מוסיפים 1000 מ"ל מים נטולי יונים ומרתיחים עוד 30 דקות. חזור על תהליך הרתיחה הזה שלוש פעמים כדי לקבל שלוש מנות של נוזל צמחי, ואז שלב וערבב אותם היטב.
4. מסננים את נוזל הצמחים המעורבב דרך מטלית של 400 רשת. רכזו את המסנן בלחץ מופחת, ולאחר מכן העבירו את נוזל הצמחים המרוכז לציוד קירור להמשך עיבוד.
5. יוצקים את נוזל הצמחים המרוכז למגש ליופיליזציה ומניחים אותו בתא ההקפאה מראש של ליופילייזר ואקום. לאחר השלמת ההקפאה המוקדמת, העבירו את המגש לתא ייבוש הסובלימציה כדי להסיר מים.
6. הסר כל לחות שנותרה בטמפרטורה גבוהה. מרסקים את תמצית הצמחים המיובשת בהקפאה באמצעות מועך לקבלת אבקת מרתח XY עדינה (איור 2).

2. הכנת סרום המכיל תרופות

1. הקצה באופן אקראי עכברים זכרים בני שישה שבועות C57BL/6 (20 ± 2 גרם) לקבוצת XiaoYi (XY) או לקבוצת הביקורת.
   הערה: מינון העכבר חושב באמצעות מקדם ההמרה מאדם לעכבר:
   מינון ניסיוני שווה ערך לעכברים (גרם/ק"ג) = {מינון אנושי (גרם/ק"ג) / משקל גוף (70 ק"ג)} x 9.1
   על סמך חישוב זה, המינון לעכברים נקבע כ-2.6 גרם/ק"ג.
2. שוקלים 0.9152 גרם אבקת מרתח XY ליופיליזציה וממיסים אותה ב -3.2 מ"ל מים מזוקקים להכנת תמיסת התרופה.
   הערה: עכברים צמו במשך 12 שעות לפני מתן דרך הפה.
3. מתן מרתח XY לעכברים בקבוצת XY באמצעות gavage, תוך מתן קבוצת הביקורת בנפח שווה ערך של מים נטולי יונים.
4. שעתיים לאחר מתן דרך הפה, יש להרדים את העכברים עם נתרן פנטוברביטל (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). הסר את גלגלי העיניים באמצעות פינצטה לאיסוף דגימות דם, ולאחר מכן המתת חסד של העכברים באמצעות חנק CO₂ ואחריו פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות אתיות¹⁹.
5. אפשר לדגימות הדם להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3450 x גרם (4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות לאיסוף הסופרנטנט.

3. ניתוח UHPLC-QE-MS

1. הוסף 100 מ"ג של אבקת ליופיליזציה מרתח XY ל-500 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי (מתנול: מים = 4:1). מערבבים היטב, סוניקט ודוגרים באמבט מי קרח למשך שעה.
2. שמרו על התערובת בטמפרטורה של -40 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 13,800 x גרם (4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות. סננו את הסופרנטנט דרך ממברנת מסנן של 0.22 מיקרומטר, ואז שלבו 100 מיקרוליטר מכל סופרנטנט כדי ליצור דגימות בקרת איכות (QC).
3. לאחר הפשרת דגימות הפלזמה, קח 400 מיקרוליטר מדגימת הפלזמה של קבוצת הביקורת ו-400 מיקרוליטר מדגימות הפלזמה של קבוצת XY. הוסף 40 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית (2 מול/ליטר) לכל דגימה. מערבולת למשך דקה אחת ונותנים לתערובת לעמוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. חזור על שלב זה ארבע פעמים.
4. הוסף 1.6 מ"ל אצטוניטריל ומערבולת למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-13,800 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. נושא 1,800 מיקרוליטר של הסופרנטנט לייבוש חנקן.
5. להרכיב מחדש את הדגימות המיובשות ב-150 מיקרוליטר של 80% מתנול המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל מהתקן הפנימי על ידי מערבולת למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-13,800 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ואז להעביר 120 מיקרוליטר של הסופרנטנט לבקבוקון זכוכית טרי עבור ניתוח LC-MS (איור 3).

4. תרבית תאים והכנת בעלי חיים

1. זרע של 1 מ"ל של תאי קרצינומה של ריאות לואיס בצלחת תרבית המכילה את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה על התאים בתנאים מבוקרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, העבירו אותם באמצעות 0.25% טריפסין. המשך במעבר עד שמצב התא מתייצב, ולאחר מכן התאם את ריכוז התאים ל-3 x 10⁶ תאים/מ"ל.
3. הזרקו 0.1 מ"ל מתרחיף התא המוכן תת עורי לתוך בית השחי הימני של עכברי C57BL/6 זכרים כדי לבסס את מודל אדנוקרצינומה של הריאות.
   הערה: ניתן למשש רקמת גידול בבית השחי של עכברים 5 ימים לאחר החיסון.
4. לאחר 5 ימים, חלקו את העכברים באופן אקראי לחמש קבוצות (n = 6 לקבוצה): קבוצת מודל (M) - ללא טיפול; קבוצת מרתח XY במינון נמוך (XY-L) - 1.3 גרם/ק"ג; קבוצת מינון בינוני מרתח XY (XY-Z) - 2.6 גרם לק"ג; קבוצת מינון גבוה של מרתח XY (XY-H) - 5.2 גרם/ק"ג; קבוצת ציספלטין (DDP) - מטופלת בציספלטין²⁰.
5. ממיסים את אבקת המרתח XY ב -200 מיקרוליטר מים מזוקקים במינון המתאים ונותנים אותה באמצעות gavage. קבוצות M ו-DDP מקבלות נפח שווה של מים מזוקקים באמצעות גבאז'.
6. יש לתת ציספלטין לקבוצת ה-DDP באמצעות הזרקה תוך-צפקית (3 מ"ג/ק"ג) אחת ל-3 ימים. הזריק את אותו נפח של מי מלח פיזיולוגיים לקבוצות האחרות.

5. ניתוח פתולוגי של רקמת הגידול

1. לאחר 21 יום, המתת חסד של כל העכברים באמצעות חנק CO₂ ואחריו פריקת צוואר הרחם (בהתאם להנחיות אתיות) וכריתת רקמת הגידול²¹. מדוד את נפח הגידול ומשקלו (איור 4).
2. תקן את רקמות הגידול שנכרתו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות). יבש את הרקמה באמצעות תמיסות אתנול מדורגות.
3. נקה את גושי הרקמה המיובשים באמצעות קסילן, ולאחר מכן הטמיע אותם בשעוות פרפין מומסת. הניחו לשעווה להתמצק לגוש פרפין. חתכו את גוש הרקמה לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום.
4. הסרת שעווה מקטעי הרקמה בקסילן, ואחריה החזרת נוזלים בתמיסות אתנול מדורגות. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5 דקות, ואז שוטפים במים נטולי יונים.
5. מכתים את החלקים בתמיסת אאוזין של 0.5% למשך דקה. התבונן בחלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אופטי וצלם תמונות לניתוח.

6. ניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמת הגידול

1. בצע הסרת שעווה והחזרת נוזלים בהתאם להליכים המתוארים בשלבים 5.2-5.4.
2. דגרו את החלקים בחוסם פרוקסידאז אנדוגני בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. חסום כריכה לא ספציפית על ידי דגירה של החלקים בסרום עיזים.
3. יש למרוח את הנוגדנים העיקריים: Ki-67 (1:600) ו-Caspase-3 (1:100). דוגרים את החלקים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף עם מאגר PBS), ולאחר מכן למרוח נוגדן משני לשימוש כללי (1:500) ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. פתח את תגובת הצבע על ידי הוספת תמיסת DAB. מכתים את החלקים בתמיסת המטוקסילין.
5. בצע ייבוש, ניקוי ואיטום של החלקים המוכתמים. התבונן בביטוי החלבון תחת מיקרוסקופ אופטי וצלם תמונות לניתוח.

7. ניתוח כתמים מערביים

1. הומוגניזציה של רקמות הגידול באמצעות לייזר רקמות. חלץ את החלבון הכולל וקבע את ריכוזו באמצעות ערכת בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) (ראה טבלת חומרים).
2. בצע כימות חלבון, ואחריו אלקטרופורזה SDS-PAGE והעברת חלבון לממברנה.
3. דגרו את הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים: P38 (1:2000), p-P38 (1:1000), ERK (1:20000), p-ERK (1:500), JNK (1:2000), p-JNK (1:5000), β-אקטין (1:200) (ראו טבלת חומרים).
4. למחרת, דגרו על הממברנה עם נוגדן משני מצומד חזרת פרוקסידאז (HRP) בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות. זיהוי רצועות חלבון באמצעות מערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL).
   הערה: עוצמות פס החלבון כומתו באמצעות תוכנת ImageJ.

תמיסת אבקת XY ודגימות סרום מקבוצת הביקורת וקבוצת ה-XY נותחו באמצעות UHPLC-QE-MS, וחשפו פסגות מופרדות היטב. דיאגרמות היינון הכוללות עבור מצבי היונים החיוביים והשליליים מוצגות באיור 3. הרכב מרתח ה-XY זוהה על סמך זמן שמירה, מצב רכישה ושברי ספקטרום מסה. חמישה עשר מרכיבי כניסת דם זוהו על ידי השוואת הסרום של קבוצות המתן האוראלי של מרתח ריק ומרתח XY עם מרכיבי תמיסת אבקת XY (טבלה 1).

גרף קו נפח הגידול מצביע על כך שלאחר 21 ימים של גבאז' עם מרתח XY, נפח הגידול בעכברים ירד בהשוואה לקבוצת M והראה השפעה תלוית מינון (איור 4). היסטופתולוגיה של הגידול נצפתה באמצעות צביעת H&E (איור 5). בקבוצת M, תאי הגידול היו מסודרים בצפיפות והפגינו התפשטות פעילה, עם מיטוזה פתולוגית בשפע. ככל שמינון המרתח XY גדל, סידור תאי הגידול הפך דליל בהדרגה, והחלל הבין-תאי גדל. דרגות שונות של נמק נצפו ברקמות הגידול, ומיטוזה פתולוגית הייתה נדירה²¹.

כדי לאמת את ההשפעות של מרתח XY על התפשטות ואפופטוזיס של רקמות גידול בעכברים, נערכו ניסויים אימונוהיסטוכימיים (IHC). לאחר צביעה בנוגדנים Ki-67 ו-Caspase 3, נצפו חלקיקים חומים-צהובים מפוזרים בקטעי רקמת הגידול. בהשוואה לקבוצת M, רמות Ki-67 ברקמות הגידול בקבוצות XY ו-DDP ירדו ברצף, בעוד שרמות Caspase 3 עלו (איור 6).

כדי לקבוע אם מרתח XY מפעיל השפעות טיפוליות על אדנוקרצינומה של הריאות דרך מסלול MAPK, בוצע ניתוח כתמים מערביים על רקמות גידול מעכברים. כפי שמוצג באיור 7, טיפול במרתח XY הוביל לירידה בביטוי p-ERK, כאשר קבוצת XY-H הראתה הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת M (p < 0.001). רמות p-JNK ו-p-P38 עלו בקבוצת XY-H בהשוואה לקבוצת M, עם הבדלים מובהקים סטטיסטית שנצפו בקבוצת XY-H (p < 0.01) ובקבוצת DDP (p < 0.05) בהשוואה לקבוצת M. בנוסף, ההבדל בין קבוצות DDP ו-XY-H היה מובהק סטטיסטית.

איור 1: רכיבים של מרתח XY. איור זה מציג את התרופות הבודדות הכלולות במרתח XY. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הכנת תמצית מימית מרתח XY. איור זה ממחיש את תהליך ההכנה של התמצית המימית של מרתח XY. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח של תמצית מימית מרתח XY. (A) תהליך המיצוי של סרום המכיל תרופה. (B) ניתוח ספקטרומטריית מסה במצב יונים חיוביים. (C) ניתוח ספקטרומטריית מסה במצב יונים שליליים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השפעות מרתח XY על נפח הגידול והמורפולוגיה של העכבר. (A) תרבית תאים, השתלת גידול והליכי דגימה. (B) גרף קו שמתאר את נפח הגידול לאורך זמן. (ג) מורפולוגיה של הגידול לאחר 21 יום של טיפול בגבאז'. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח היסטולוגי של רקמות גידול בעכברים. (A) סידור רקמת הגידול נעשה דליל יותר עם מינונים הולכים וגדלים של מרתח XY, עם סימני נמק באופן תלוי מינון. (B) מיטוזה פתולוגית ברקמות הגידול, המראה ירידה במיטוזה הפתולוגית עם מינונים הולכים וגדלים של מרתח XY. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: רמות ביטוי Ki-67 ו-Caspase-3. (A) רמות ביטוי Ki-67. (B) רמות ביטוי Caspase-3. פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר. (C) כימות של אזורים חיוביים ל-Ki-67, המראה ירידה עם מינונים הולכים וגדלים של מרתח XY. (D) כימות של אזורים חיוביים ל-Caspase-3, המראה עלייה עם מינונים הולכים וגדלים של מרתח XY. p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, לא משמעותי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: רמות ביטוי חלבון במסלול MAPK. (A) ניתוח כתמים מערביים של ביטוי חלבון. (B) רמות ביטוי ERK. (C) רמות ביטוי p-ERK. (ד) רמות ביטוי JNK. (E) רמות ביטוי p-JNK. (F) רמות ביטוי P38. (G) רמות ביטוי p-P38. מרתח XY הגביר את הביטוי של חלבוני p-JNK ו-p-P38 תוך ויסות נמוך של ביטוי p-ERK. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רכיבים שנספגו בדם לאחר מתן מרתח XY. הטבלה מפרטת את הרכיבים הפעילים שהתגלו בדם לאחר מתן מרתח XY: A: Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang), B: Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu), C: Trichosanthes kirilowii Maxim. (Tianhuafen), D: Panax ginseng C.A. Mey (Renshen), E: Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang), F: Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren), G: Phragmites communis Trin. (לוגן).

שכיחות הסרטן עולה מדי שנה, ומושכת עניין קליני ומחקרי משמעותי^22,23. מחקרים אחרונים הוכיחו את יעילותה של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בטיפול בסרטן ריאות 24,25,26. לדוגמה, מרתח מיימנדונג הוכח כמשפר את המספר והפעילות של תאי NK, ובכך מעכב גרורות סרטן ריאות²⁷. באופן דומה, מרתח Mahuang Fuzi Xixin השיג השפעות טיפוליות על סרטן הריאות על ידי השפעה על מסלולי איתות מרובים²⁸. מחקר זה משתמש בניתוח LC-MS ובניסויים in vivo כדי לחזות את המנגנונים האפשריים שבאמצעותם מרתח XY מפעיל השפעות טיפוליות על אדנוקרצינומה של הריאות.

ניתוח LC-MS זיהה 15 מרכיבי כניסת דם. בין אלה, הוכח כי טריצין ופיקרופודופילוטוקסין מעכבים עמידות לתרופות ומפחיתים את רמות הביטוי של p-PRKCA, SPHK1, SPHK2 ו-EGFR, ובכך מדכאים את פעילות תאי סרטן הריאות^29,30. ג'ינסנוסיד Rg1 וג'ינסנוסיד Rg3, מרכיבים של ג'ינסנג קוריאני C.A. מאייר, יכולים לחסום מיטוזה של תאים, לעכב איתות מסלול mTOR, להפעיל השפעות אנטי-אנגיוגניות, לשפר את תפקוד מערכת החיסון, ובסופו של דבר לעכב צמיחת גידול וגרורות תוך הפחתת עמידות לתרופות 31,32,33,34. סטכיוז יכול לגרום לאפופטוזיס בתאי סרטן המעי על ידי ויסות הביטוי של חלבונים פרו-אפופטוטיים³⁵. לאימפריאלין, אלקלואיד בעל תכונות אנטי דלקתיות ואנטי פרוליפרטיביות, יש פוטנציאל כחומר אנטי-גידולי בשלב מוקדם³⁶. פימין יכול לעצור את מחזור התא על ידי גרימת אפופטוזיס, לעכב את נדידת התאים באמצעות מתח רשתית אנדופלזמי, ולווסת את ביטוי החלבון הקשור למסלול NF-κB כדי לדכא את הצמיחה של תאי סרטן השד והקיבה^37,38. דווח כי אוקובין וג'וג'ובוזיד B מקדמים אוטופגיה ואפופטוזיס בתאי גידול תוך עיכוב אנגיוגנזה, ובכך מפעילים השפעות אנטי-גידוליות 39,40,41.

מסלול ה-MAPK חיוני לתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הפעלת תאים, התפשטות, אוטופגיה ואפופטוזיס. מספר תרכובות שזוהו במרכיבי כניסת הדם של מרתח XY, כגון Ginsenoside Rg1, Ginsenoside Rg3, Peimine ו-Jujuboside B, עשויות להפעיל השפעות אנטי-גידוליות דרך מסלול MAPK 42,43,44,45. מסלול ה-MAPK כולל את מפלי האיתות ERK, JNK ו-P38 ונחקר רבות בחקר הסרטן בשל תפקידו בוויסות תהליכים פיזיולוגיים באמצעות הפעלת מפל החלבון של MAP3K-MAP2K-MAPK^46,47.

הפעלת מסלול ה-ERK מגרה את התפשטות התאים ומעכבת אפופטוזיס על ידי ויסות הפעילות והביטוי של חלבונים פרו-אפופטוטיים ואנטי-אפופטוטיים ברמות השעתוק והתרגום^48,49. מעכבי חלבון המכוונים למסלול ERK נחקרו בהרחבה ומשמשים בטיפול בסרטן 50,51,52. מונומרים ותכשירים של רפואה סינית מסורתית (TCM) הוכחו גם כבעלי השפעות אנטי-גידוליות על ידי ויסות מסלול ERK. לדוגמה, נוסחת QYHJ מעכבת את ההתפשטות ומקדמת אפופטוזיס של תאי אדנוקרצינומה של צינור הלבלב על ידי ויסות הביטוי של p-P38 ו-p-ERK1/2⁵³. נגזרות חומצה פרולית מדכאות התפשטות, עוצרות את מחזור התא וגורמות לאפופטוזיס בקו תאי סרטן ריאות אנושי^{A549 54}.

מסלול JNK/P38 ממלא תפקידים שונים על ידי ויסות חלבוני אפקטור שונים במורד הזרם באמצעות זרחון, ובכך משפיע על מחזור התא, התפשטות התאים ואפופטוזיס^55,56. מחקרים הראו כי טריפטוליד מווסת את הביטוי של p-P38 ו-p-JNK ומעכב את התפשטותם של תאי A549, ומפעיל השפעות אנטי-גידוליות⁵⁷. בנוסף, בייקליין גורם לאפופטוזיס בתאי HeLa על ידי השפעה על ביטוי p-P38 ו-p-JNK⁵⁸. מחקרי in vivo ו-in vitro הראו כי הזרקת Aidi משפיעה על הביטוי של p-JNK ו-p-P38 בתאי HepG2 ובמודלים של עכברי קרצינומה של הכבד, ובכך מעכבת את התפשטות הגידול⁵⁹.

Ki-67 ו-Caspase 3 הם אינדיקטורים מרכזיים להתפשטות הגידול ואפופטוזיס. Ki-67 הוא חלבון גרעיני המתבטא מאוד במהלך התפשטות התאים ונעדר בתאים שקטים (שלב G0)⁶⁰. מכיוון שהתפתחות הגידול קשורה קשר הדוק לשגשוג תאים, המחקר על המתאם בין Ki-67 לגידול זכה לתשומת לב משמעותית. ביטוי Ki-67 נמצא בקורלציה חיובית עם ממאירות, אגרסיביות ופרוגנוזה של הגידול^61,62, מה שהופך אותו לסמן ביולוגי בשימוש נרחב להתפשטות סרטן⁶³. הוא נחקר בהרחבה בפתוגנזה ובפרוגנוזה של סרטן מערכת העיכול, הריאות, השד וצוואר הרחם 64,65,66,67.

משפחת הקספאז מורכבת מאנזימים פרוטאוליטיים המווסתים אפופטוזיס ודלקת. קספאז 3, שנמצא בעיקר בציטופלזמה, הוא גורם מפתח לאפופטוזיס. זה מקל על מוות תאים על ידי פיצול חלבוני שלד תאים, השבתת חלבונים מעכבי אפופטוזיס ופירוק אנזימי תיקון DNA 68,69,70. שינויים בביטוי Caspase 3 יכולים להשפיע על רגישות תאי הגידול לכימותרפיה, ובכך להשפיע על פלישה, גרורות והתקדמות של סוגי סרטן שונים 71,72,73,74.

מחקר זה הראה כי מרתח XY עיכב את התפשטות הגידול בעכברים נושאי גידול LLC באופן תלוי מינון. ניתוח פתולוגי של רקמות גידול מקבוצות הטיפול XY ו-DDP חשף סידורי תאים רופפים יותר בהשוואה לקבוצת M, יחד עם מיטוזה פתולוגית מופחתת. בנוסף, נצפו נמק ודימום ברקמות הגידול של קבוצות הטיפול. תוצאות אימונוהיסטוכימיה (IHC) אישרו עוד כי מרתח XY עיכב את התפשטות תאי הגידול וקידם אפופטוזיס באופן תלוי מינון. ניתוח כתמים מערביים של רקמות הגידול הצביע על שינויים משמעותיים ברמות הביטוי של חלבוני מפתח במסלול MAPK. בסך הכל, הממצאים הפתולוגיים וה-IHC מצביעים על כך שמרתח XY מפעיל השפעות טיפוליות נגד אדנוקרצינומה של הריאות על ידי ויסות ביטוי החלבונים במסלול האיתות MAPK.

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי פריט תוכנית הפיתוח המדעי והטכנולוגי של מחוז ג'ילין (YDZJ202301ZYTS459).