Выделение экзосом после ударно-волновой терапии in vitro

Экзосомы высвобождаются при воздействии ударных волн in vitro. В этой статье мы описываем, как применять ударные волны к культивируемым эндотелиальным клеткам и впоследствии выделять экзосомы для дальнейшего исследования.

Ударно-волновая терапия обычно применяется при ортопедических показаниях, включая тендинопатии, такие как латеральный эпикондилит (теннисный локоть) и тендинит ахиллова сухожилия (пяточная шпора), а также при незаживающих ранах и костях. Несмотря на разные патологии, сочетание ангиогенного и противовоспалительного эффекта ударно-волновой терапии приводит к регенерации в мягких тканях и костях. За более чем 30 лет клинического применения не наблюдалось никаких побочных эффектов. Более того, фундаментальные исследования даже выявили регенеративное воздействие на ишемизированный миокард.

В предыдущей работе мы смогли показать, что механический стимул культивируемых клеток транслируется через высвобождение экзосом в биологическую реакцию. Тем не менее, точный механизм еще предстоит выяснить. Механическая муфта имеет решающее значение при применении ударно-волновой терапии, так как даже небольшие пузырьки воздуха могут поглощать ударные волны. Ранее описанный метод водяной бани является действенным методом, гарантирующим адекватное и воспроизводимое применение ударной волны in vitro.

Нам удалось разработать осуществимый и воспроизводимый протокол для выделения экзосом из культивируемых клеток после применения ударной волны. Тем самым мы демонстрируем возможность изучения основных механизмов механотрансдукции, а также регенеративного и ангиогенного потенциала экзосом, высвобождаемых ударной волной.

Ударные волны (УВ) — это звуковые волны давления, которые появляются в природе при высвобождении большого количества энергии за короткий промежуток времени (например, гром с молнией). В клинической практике ударные волны используются в литотрипсии для разрушения камней в почках без соответствующих побочных эффектов в течение более 30^лет. По происшествиям, на рентгенограммах наблюдалось утолщение подвздошной кости после распада камней в почках. Это наблюдение послужило основой для исследований нарушений заживления костей и привело к лечению несращения длинных костей ^3,4,5.

Показания к проведению ударно-волновой терапии были расширены, и в настоящее время метод находится в рутинном клиническом применении при ортопедических показаниях, включая тендинопатии, такие как латеральный эпикондилит (локоть теннисиста) и тендинит ахиллова сухожилия (пяточная шпора)^6,7. Кроме того, фундаментальные исследования продемонстрировали высокий ангиогенный потенциал ударно-волновой терапии (УВТ). В нем исследование показало увеличение ангиогенных факторов роста, таких как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), PIGF (фактор роста плаценты) и FGF (фактор роста эндотелия сосудов) при УВТ с последующим ангиогенезом⁸.

Для изучения возможной благоприятной роли ангиогенеза, индуцированного ударной волной, при других патологиях мы применили СР-терапию на животной модели ишемической болезни сердца ^9,10. После того, как был продемонстрирован регенеративный эффект в ишемизированном миокарде, мы смогли определить незаменимую роль рецептора врожденного иммунитета TLR 3 (рецептор типа Toll 3) при ударно-волновой терапии^11,12. Дальнейшие исследования показали, что механический стимул СР-терапии транслируется в биологический сигнал через высвобождение экзосом. По сравнению с экзосомами, физиологически высвобождаемыми из эндотелиальных клеток, экзосомы, высвобождаемые при УВТ, содержат повышенный груз ангиогенной микроРНК. При введении в ишемизированный миокард УВТ высвобождает экзосомы, индуцирующие регенерацию¹³.

Поскольку воздух поглощает ОУ, решающее значение имеет идеальное соединение между аппликатором и колбами для клеточных культур. Стандартизированная водяная баня представляет собой возможный метод применения УВТ in vitro и воспроизводимую экспериментальную установку. Чтобы избежать отражения и, как следствие, интерференции волн, клиновидный поглотитель разрушает первичные волны, идущие к задней части водяной бани. По этой причине мы рекомендуем применять ударные волны in vitro только с использованием описанной водяной бани.

В этом протоколе мы описываем применение ударных волн in vitro для высвобождения ангиогенных экзосом в надосадочную жидкость. Данный протокол дает возможность исследовать роль экзосом в механотрансдукции и является основой для дальнейших исследований высвобождения экзосом при УВТ.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека были получены путем кесарева сечения в отделении гинекологии. Таким образом, было получено письменное информированное согласие пациентов. Разрешение было дано комитетом по этике Медицинского университета Инсбрука (no. UN4435).

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте под стерильным ламинарным колпаком, чтобы избежать загрязнения.

1. За 24 ч до начала эксперимента

1. Приготовьте свободную от экзосом эндотелиальную питательную среду путем ультрацентрифугирования фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 4 °C и 120 000 x g в течение ночи.
2. Покройте колбу для клеточных культур площадью 75 см² 10% желатином.
3. Засейте эндотелиальные клетки человека в колбе для клеточных культур с использованием эндотелиальной питательной среды.
   День эксперимента:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте 4 л ddH₂O, FCS без экзосом, базальную среду для роста эндотелиальных клеток и PBS до 37 °C.

2. Подготовьте приложение для ударно-волновой терапии

1. Приготовьте эндотелиальную питательную среду без экзосом, добавив добавки из коммерческого набора (например, Bullet Kit) и добавив ультрацентрифугированную ФКС без экзосом вместо обычной ССК в эндотелиальную питательную среду.
2. Наполните водяную баню примерно 3,5 л 37 °C предварительно подогретым ddH₂O.
3. Подключите SW-аппликатор к водяной бане.
4. Определение параметров обработки (плотность потока энергии, частота импульсов) на программном устройстве. Мы рекомендуем 500 импульсов с плотностью потока энергии 0,07 мДж/мм² и частотой 5 Гц.

3. Применение ударной волны

1. Исследование жизнеспособности клеток по морфологическому виду и плотности эндотелиальных клеток с помощью микроскопа с использованием 100-кратного общего увеличения. Используйте колбы с высокой конфлюенцией только для увеличенного количества экзосом.
2. Осторожно замените среду эндотелиальных клеток примерно 250 мл PBS, чтобы полностью заполнить колбу и подавить весь остаточный воздух.
3. Используйте парапленку или герметичные крышки, чтобы запечатать колбу.
4. Держите колбу для клеточных культур в вертикальном положении внутри водяной бани стороной, закрытой клеткой, противоположной устройству SW. Убедитесь, что расстояние от колбы до аппликатора соответствует указанной маркировке. Для аппарата Orthowave 180c используйте расстояние от 10 см.
5. Используйте 250 импульсов SW-терапии в нижней половине колбы с клеточными культурами.
6. Поверните колбу на 180° и используйте 250 импульсов для верхней половины колбы для клеточных культур.
7. Затем снимите пломбу колбы и замените PBS 15 мл эндотелиальной питательной среды на FCS, свободную от экзосом.
8. Культивировали клетки в свободной от экзосом среде в течение времени, необходимого для проведения эксперимента. Наибольшее количество экзосом может быть собрано через 4 ч после СВ-терапии (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В группе, где проводилась фиктивная операция, флаконы с клеточными культурами подвергались той же обработке (см. раздел выше) без использования СР-терапии.

4. Выделение экзосом

1. Переложите надосадочную жидкость в сборную пробирку и центрифугу при температуре 4 °C и 300 x g в течение 10 минут. На этом этапе удаляются все клетки надосадочной жидкости.
2. Для удаления клеточного мусора перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугу при температуре 4 °C и 3 000 x g в течение 20 минут.
3. Процедите надосадочную жидкость через фильтр 200 нм в центробежную трубку для удаления апоптотических тел.
4. Центрифуга фильтрует надосадочную жидкость при 4 °C с 120 000 x g в течение 70 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу экзосомы с 300 мкл PBS.
   1. Поскольку гранула экзосомы не видна после ультрацентрифугирования, поверните ультрацентрифужную трубку на 30 секунд, чтобы убедиться, что гранула экзосомы снова суспендирована. Отрегулируйте объем PBS в соответствии с потребностями эксперимента и дальнейшими экспериментами.
5. Храните ресуспендированные экзосомы при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить после переноса надосадочной жидкости в сборную пробирку или перед ультрацентрифугированием путем замораживания надосадочной жидкости при температуре -80 °C.

5. Подводные камни

1. Убедитесь, что SW-аппликатор плотно подключен к водяной бане. Неполное соединение может привести к негерметичности водяной бани.
2. Убедитесь, что расстояние от колбы до аппликатора является точным, чтобы использовать одинаковое количество плотности потока энергии для разных колб.
3. Отметьте колбы для клеточных культур, которые были подвергнуты SW-терапии, и колбы для клеточных культур, которые были контрольными образцами.
4. Высушите колбы перед тем, как положить их обратно в инкубатор, чтобы избежать заражения.

Используя описанный протокол, мы подвергали эндотелиальные клетки человека (HUVECs), а также эндотелиальные клетки коронарных артерий человека (CAEC; PromoCell) до ударно-волновой терапии (например, Orthowave 180c). Высвобожденные везикулы количественно оценивали с помощью анализа нанослежения (NTA). Таким образом, мы могли наблюдать увеличение высвобождения микровезикул при терапии SW (рис. 1A, B). Визуализация высвобождаемых везикул HUVEC с помощью просвечивающей электронной микроскопии выявила характерный размер экзосом в 100 нм (рисунок 1C), а также типично описанную чашеобразную форму (рисунок 1D). Поскольку анализ проточного цитометра выявил наличие маркеров экзосомных белков CD9, CD81 и CD63, не может быть никаких сомнений в том, что микровезикулы, высвобождаемые HUVECs, являются экзосомами (рис. 1, E-G).

Рисунок 1: Высвобождение экзосом при ударно-волновой терапии in vitro. (A) Микровезикулы, высвобождаемые HUVECs, количественно оценивали с помощью NTA в течение определенного времени после терапии SW. Данные выражены в виде средних значений ± SEM. *P<0.05. n=3–6. (B) Повышенные уровни микровезикул были обнаружены в надосадочной жидкости CAECs через 4 часа после терапии SW. Данные выражаются в средних ± SEM. ****P < 0,0001. n=4–6. (К-Д) NTA выявила типичный размер, а просвечивающая электронная микроскопия выявила типичную форму экзосомы. n=3–5. Масштабная линейка = 200 нм. (Э-Г) Высвобождающиеся микровезикулы экспрессируют экзосомные маркеры CD 9, CD 63 и CD 81. Данные выражаются в виде средних ± СЕМ. n=6. Статистические сравнения между двумя группами: t-критерий Стьюдента, множественные группы: односторонняя ANOVA с апостериорным анализом Тьюки. Модифицировано из Gollmann-Tepeköylü et ^al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В многочисленных фундаментальных исследованиях был продемонстрирован регенеративный эффект ударно-волновой терапии, которая регулярно применяется при ортопедических показаниях ^3,4,5. На различных животных моделях было продемонстрировано регенеративное действие на ишемизированный миокард, что привело к началу исследования CAST-HF ^9,10. Это рандомизированное контролируемое исследование направлено на оценку пользы прямой ударно-волновой терапии сердца, применяемой дополнительно во время операции аортокоронарного шунтирования¹⁴. Незаменимая роль экзосом в ударно-волновой терапии может быть продемонстрирована в предыдущей работе¹³. Тем не менее, точный механизм высвобождения экзосом, а также точный груз высвобождаемых экзосом остается неясным. Для изучения высвобождения, а также регенеративного эффекта высвобожденных экзосом мы разработали осуществимый и стандартизированный протокол получения экзосом с помощью ударно-волновой терапии.

Насколько нам известно, это первый протокол, описывающий метод выделения экзосом с помощью ударно-волновой терапии. Водяная баня обязательно необходима для того, чтобы протокол гарантировал адекватное применение ПО, так как она предотвращает поглощение воздуха¹⁵ . Таким образом, все экзосомы, выделенные по этому протоколу, возникают из эндотелиальных клеток, обработанных с одинаковой плотностью потока энергии.

Поскольку у нас есть опыт получения экзосом только из эндотелиальных клеток, мы не можем рекомендовать точную схему эксперимента для экспериментов с другими клеточными линиями. Тем не менее, мы убеждены, что механотрансдукция через экзосомы при SW-терапии играет решающую роль и в других типах клеток. В любом случае, дальнейшие исследования должны подтвердить эту теорию. При работе с другими клеточными линиями, помимо эндотелиальных клеток, мы бы рекомендовали пилотную трассу. Работая с эндотелиальными клетками, мы обнаружили необходимость тщательного покрытия колб перед посевом клеток. В противном случае клетки будут отделяться при SW-терапии. Мы полагаем, что это относится и к другим клеточным линиям.

Кроме того, для получения сопоставимых результатов важно точное соединение между аппликатором и водяной баней, а также точное расстояние от аппликатора до колбы с клеточными культурами. Поскольку источник (например, наконечники электродов в электрогидравлической системе), расположенный внутри аппликатора, расположен по-разному в различных SW-аппликаторах, следует учитывать, что расстояние между аппликатором и колбами для клеточных культур различается в разных SW-устройствах. Кроме того, мы рекомендуем использовать только адгезивные клетки, так как в суспензионной культуре нет постоянного расстояния между аппликатором и каждой клеткой. Ограничением этого протокола является необходимость использования ультрацентрифуги. Однако этот метод позволяет избежать покупки наборов для выделения экзосом.

В целом, этот протокол представляет собой стандартизированный метод изучения роли высвобождения внеклеточных везикул при ударно-волновой терапии и, следовательно, может быть важным инструментом для понимания молекулярных эффектов SW.

JH и MG являются акционерами компании Heart Regeneration Technologies GmbH, дочерней компании Медицинского университета Инсбрука, целью которой является продвижение сердечной ударно-волновой терапии (www.heart-regeneration.com). Всем остальным авторам нечего раскрывать.

Это исследование было поддержано неограниченным исследовательским грантом AUVA для JH и CGT.