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마우스 간 연구를 위한 PCLS(Precision-cut Liver Slices)의 생산 및 배양을 위한 프로토콜입니다. 이 기사는 비브라톰에 액세스할 수 있는 표준 실험실 장비만 필요하고 최소 4일 동안 PCLS의 생존을 허용하는 프로토콜의 주요 측면에 중점을 둡니다.
이 프로토콜은 PCLS(Precision-cut Liver Slices)의 생성 및 배양을 위한 간단한 시스템을 제공합니다. PCLS는 모든 세포를 온전한 환경에 포함하므로 전체 장기의 미니 모델과 유사합니다. 이를 통해 살아있는 조직을 연구하는 동시에 복잡한 표현형을 복제할 수 있습니다. 이 프로토콜은 비브라톰 및 표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 간에서 절편을 준비할 수 있도록 합니다. PCLS를 생산하고 배양하기 위한 프로토콜은 표준화되어 있지 않으며 관심 조직, 사용되는 비브라톰 유형 및 산소의 필요성에 따라 상당히 달라질 수 있습니다. 이는 기본 진동체와 일반적인 조직 배양 시설에만 접근할 수 있는 일부 실험실에서 재현하기 어려울 수 있습니다. 우리는 이미 사용 가능한 다양한 프로토콜 내에서 몇 가지 주요 단계의 중요성에 초점을 맞춘 프로토콜을 구성했습니다. 따라서 이 프로토콜은 임베딩 방법, 절단 방향, 동적 대 정적 시스템, 최소 배양 부피의 관련성의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 기본 조직 슬라이서에 액세스할 수 있는 대부분의 실험실에서 간단한 방식으로 확립하고 재현할 수 있습니다. 이 프로토콜을 종합하여 따르면 PCLS는 최소 4일 동안 생존할 수 있습니다. PCLS는 간과 같은 장기에 대한 병태생리학 및 치료적 스크리닝을 연구하기 위한 간단하고 경제적이며 재현 가능한 모델입니다.
정밀 절단 조직 절편(PCTS)은 장기의 얇은 부분입니다. 그들은 미니 장기를 복제하는 기관의 구조를 보존하는 동시에 이웃 세포와 세포 외 기질의 3차원 측면을 보존할 수 있습니다. 조직 구조를 보존하면서 쉽게 접근할 수 있고 비용이 절감되며 노동 집약적이지 않은 특성으로 인해 매력적인 모델입니다.
PCTS는 체외 세포 연구와 생체 내 동물 연구 사이의 간극을 메우며 두 모델의 대부분의 단점을 극복합니다. PCTS는 간1, 장 2,3, 결장2, 뇌 4,5, 폐 6,7,8, 신장 9,10, 비장 11,12, 심장13,14뿐만 아니라 종양15,16과 같은 다양한 기관에서 생성되었습니다. 그들은 또한 마우스1, 쥐17,18뿐만 아니라 돼지19 및 인간 수술 폐기물 15,20,21과 같은 다양한 동물에서 유래 할 수 있습니다. PCTS는 윤리적 관련 문제를 암시하는 동물의 사용을 요구하지만, 한 동물의 장기가 여러 개의 PCTS를 생성할 수 있으므로 NC3Rs 지침(Reduction, Replacement, Refinement)22에 따라 개체 수를 줄이면서 개인 간 변동을 제한할 수 있습니다.
예를 들어 vibratomes23과 같은 개선된 조직 슬라이서의 개발로 인해 두께가 불균일하고 생존율이 낮은 것을 특징으로 하는 수동 절단 절편에서 구조적 무결성이 더 잘 보존된 재현 가능한 더 얇은 절편으로 전환할 수 있었습니다.
그러나 PCTS, 특히 PCLS(Precision-cut Liver Slices) 준비 및 배양에 대한 프로토콜은 문헌에서 크게 다르며 특히 슬라이싱 장비, 배지 함량 및 배양 조건과 같은 필수 매개변수에 대한 표준화가 부족합니다. 프로토콜은 또한 기원 조직에 따라 눈에 띄게 달라질 수 있습니다. 프로토콜 중 일부는 일부 복잡한 생물반응기 시스템을 사용하여 완충액 또는 배양액의 산소화를 필요로 합니다24. 일반적으로 서로 다른 기술적 측면에 개별적으로 초점을 맞추거나 다른 조직을 위해 설계되었으며 종종 비용이 많이 들고 일반 실험실에서 비용 효율적인 방식으로 복제하는 것이 더 어려울 수 있습니다.
여기서, 이 프로토콜은 포매 방법, 절단 방향, 트랜스웰(transwells)25의 사용, 동적 배양 시스템(26 ) 및 최소 배양 부피의 중요성과 같은 몇 가지 핵심 사항을 결합합니다. 이러한 단계 중 일부는 이전에 독립적으로 또는 섬유증27 또는 종양 반응28과 같은 다른 맥락에서 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 또한 특정 유형의 슬라이서를 사용한 임베딩의 중요성과 절단 방향을 강조하는데, 이는 모두 마스터하기 어려운 매개변수이며 문헌에서 종종 무시됩니다. 이 간단한 방법은 기초적인 조직 슬라이서에 액세스할 수 있는 표준 실험실 장비를 사용하여 쉽게 설정하고 최소 4일 동안 배양에서 유지되는 PCLS를 생성합니다.
야생형 CD57Bl/6J 마우스는 Charles River Laboratories에서 구입했습니다. 생쥐는 온도와 습도가 조절되고 12시간의 광 주기로 개별적으로 환기가 되는 케이지에 수용된 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 3주가 된 동물을 제물로 바치고, 관류 없이 간을 즉시 적출하였다. 모든 동물 작업은 유니버시티 칼리지 런던 동물 복지 및 윤리 검토 위원회(University College London Animal Welfare and Ethical Review Board)의 현지 윤리 검토에 따라 승인되었으며 Home Office 프로젝트 라이선스 PP9223137 따라 Home Office (Animals) Scientific Procedures Act(1986) 및 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 유니버시티 칼리지 런던(University College London)의 생물 서비스 부서(Biological Services Unit)의 표준 관행에 따라 동물에 대한 피해를 제한하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 실험 설정
2. 간 채취 및 준비(15분)
3. 간엽 매립(각 간엽당 25분)
4. 간 슬라이스 생산 (엽 당 40 분)
5. 간 절편의 배양
6. 세포 생존 분석
7. 조직학 염색
수확 시 장기의 신속한 처리를 보장하고 장기 손상을 방지하기 위해 동물의 관류를 의도적으로 생략합니다. 절개 후 간을 신속하게 추출하고 즉시 얼음처럼 차가운 장기 보호 완충액(예: Krebs 완충액24,29)에 넣습니다. 임베딩하지 않고 신선한 간 조직을 절단하는 것은이전에 설명되었지만1, 장기 보호 버퍼와 결합된 저융점 아가로스30(그림 1)에 간을 임베딩하면 진동체에서 최적의 절단 조건을 얻을 수 있어 조직 손상을 줄이고 절편 두께의 재현성을 높일 수 있습니다. 얇은 절편은 더 많은 세포층이 영양소와 산소에 접근할 수 있도록 하고31 세포 사멸을 줄이기 때문에 조직 두께가 중요합니다. 그러나 너무 얇은 단면은 균일하게 절단하기 어려워집니다. 반대로 400μm보다 두꺼운 슬라이스는 영양소의 침투율이 낮습니다. 절편을 인서트(그림 1)를 사용하여 액체-공기 계면에서 배양하고 셰이커에서 37°C에서 5%CO2 및 21%O2로 배양했습니다. 절편은 수확 후 3시간 이내에 배양 배지에서 배양해야 하며, 그 후 세포 사멸이 빠르게 발생합니다32.
PCLS의 생존력을 결정하기 위해 4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 분석으로 세포 생존율을 평가했으며, 이는 MTS를 줄이기 위해 NAD(P)H 의존성 탈수소효소, 즉 대사 활성 세포가 필요합니다.MTS 값은 각 슬라이스 가중치로 정규화되었습니다. PCLS 생존력을 최적화하기 위해서는 배양 24시간 후 생존력을 유지하기 위해 최소한의 배양 배지가 필수적이었습니다. 24개의 웰 플레이트에서 0.7mL의 부피는 12개의 웰 플레이트에서 1.5mL, 6개의 웰 플레이트에서 2.6mL에 비해 TMS 분석에 의한 생존율(p = 0.02)의 현저한 감소를 보여주었습니다(그림 2A). 이러한 볼륨은 섹션을 약간 덮을 수 있도록 선택되었지만 사용된 인서트 및 플레이트의 유형에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 다른33과 마찬가지로 12개의 웰 플레이트는 더 적은 양의 배양 배지 내에서 최적의 생존을 위한 최상의 절충안으로 사용됩니다.
진탕은 필수적이며 정적 배양에 비해 배양 후 24시간에 PCLS 생존율을 50% 증가시킵니다(그림 2B). 쉐이킹은 트랜스웰 사용으로 최적화된 중요한 공기-액체 계면을 생성하여 단면의 양쪽 면에 영양분과 산소에 접근할 수 있도록 합니다. 산소와 영양소의 흡수는 또한 트랜스웰 멤브레인을 통과하는 흔들림 운동에 의해 생성되는 일정한 흐름에 의해 증가합니다.
MTS 분석은 배양 1시간부터 배양 6일차까지 평가되었습니다. 세포 생존율은 배양 후 0일째부터 4일째까지 일정하게 유지된 후 6일째에 유의한 감소(p = 0.05)를 관찰했습니다(그림 2C). 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색으로 평가한 PCLS 형태는 배양 후 최대 5일까지 담관 및 구조에 변화가 없는 것으로 나타났습니다(그림 3A-D). 0일(그림 3A)과 비교했을 때, PCLS는 배양 후 1일(그림 3B)과 2일(그림 3C)에 조직학적 차이를 보이지 않았으며, 핵 과색소증, 경미한 염증성 침윤, 배양 후 5일째에 중등도의 세포 사멸 과정을 선호했습니다(그림 3D). 종합하면, 이 PCLS 배양 프로토콜은 최소 4일 동안 생존력을 가능하게 하며, 이는 유사한 조건에서 절편을 사용한 연구와 일치합니다31.
그림 1: PCLS를 생성하기 위한 프로토콜을 요약한 회로도. 이 수치는34에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PCLS 배양의 최적화된 프로토콜은 5일 동안 만족스러운 생존력을 보여줍니다. (A) 세포 증식에 대한 웰 크기의 효과(n=3). (B) 세포 증식에 대한 진탕의 영향(조건당 n=6). (C) 배양 d0일에서 d6일까지의 간 절편에서 MTS 세포 증식 분석(시점당 n=5). OD 임의 단위로, 새로운 가중치를 슬라이스하도록 정규화됩니다. 그래프는 평균 ± SD를 보여줍니다. 짝을 이루지 않은 2-tailed 스튜던트 t-검정, ns=유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01. 이 수치는34에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 조직학 결과. (A-D) H&E 염색 후 간 PCLS의 조직학의 대표적인 이미지. 눈금자 = 100μM. 이 수치는34에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리는 PCLS의 생산 및 배양이 최소 4일의 반감기를 보장하면서 쉽게 달성될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 이러한 유형의 비브라톰이 사용되는 경우 임베딩 방법, 절단 방향, 동적 배양 시스템, 최소 배양 부피 및 인서트 사용의 5가지 중요한 단계를 요약합니다.
PCLS의 생산 및 배양을 위한 프로토콜이 일반적으로 사용 가능합니다. 그러나 표준화가 부족합니다. 프로토콜의 유사하고 구체적인 지점에 초점을 맞출 수 있지만 간단한 방식으로 복제하거나 기본 진동에 액세스할 수 있는 대부분의 실험실에서 복제하기 어려울 수 있습니다. 진동자 또는 조직 슬라이서의 종류는 넓습니다. 통합 냉각 시스템의 유무와 같은 비용 및 기술적 특수성은 다양하지만 공통적인 특징은 진동 면도날을 사용하는 절단 시스템입니다. 조직 슬라이싱과 관련된 주요 차이점은 임베딩에 대한 요구 사항입니다. 명백한 이유와 임베딩이 생존 가능성에 미치는 영향 때문에 이상적으로는 피해야 합니다. 임베딩이 필요하지 않은 참조 슬라이서의 한 예는 Krumdieck 슬라이서(35)입니다. 이러한 유형의 슬라이서는 코어를 사용하는 동안 냉각된 버퍼에서 조직을 절단할 수 있도록 하여 포매를 피하면서 균일한 크기의 슬라이스를 생성할 수 있습니다. 그러나, 이러한 장치는 더 많은 염기성 진동자보다 더 비싸고, 대부분의 실험실에서 덜 일반적으로 사용되거나 이용 가능한 경향이 있다. 이 프로토콜에 사용된 것과 같은 진동종은 화학적으로 고정된 조직을 절단하는 데 이미 사용할 수 있는 경향이 있지만 간엽의 매립이 필요합니다. 일부는 유사한 비브라톰 1을 삽입하고 사용하지 않고도 간 절편을 절단할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 우리의 경험에 따르면 이것은 재현하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 또한 이러한 유형의 비브라톰을 사용하는 동안 3D 지원 아가로스 젤 없이 간 슬라이싱을 하면 슬라이스가 손상되고 두께가 고르지 않아 세포 사멸이 증가합니다. 이 프로토콜은 간엽을 궁수형이 아닌 가로로 절단하는 것입니다. 절단 단계는 마스터하기 어려운 기술이며, 우리가 아는 한 절단 방향은 결코 초점을 맞추지 않는 중요한 세부 사항입니다. 절단 중 로브의 방향은 간에 가해지는 압력을 줄이면서 절단 과정을 크게 촉진할 수 있습니다. 하이드로겔의 사용은 또한 개선된 혜택으로 간주될 수 있다36.
다음으로 중요한 기준은 생존 가능성을 높이기 위해 더 많은 양의 배양이 필요하다는 것입니다. 더 많은 양이 더 많은 영양분을 제공하고 더 많은 독성 담즙산 생성물을 희석하기 위해 이미 제안되었습니다37. 진탕을 동반한 동적 시스템을 추가하고 트랜스웰을 사용하여 일정한 흐름을 생성함으로써 단면의 양쪽 면에 영양분과 잠재적으로 산소에 대한 접근을 향상시킵니다 18,38,39. 트랜스웰의 사용과 동적 시스템의 이점은 인간 종양 간 절편 반응 28 및 섬유증 모델링26,27과 같은 다양한 맥락에서 이미 입증되었습니다. 이 프로토콜은 더 넓은 생리학적 측면에서 이점을 확인합니다.
Williams의 Medium E는 일반적으로 PCLS40,41의 표준 세포 배양 배지로 선택됩니다. 포도당 및 혈청으로 보충된 배지는 절편의 생존력 및 기능을 보존하는 데 잠재적인 이점을 갖는 것으로 설명되어 왔다42. 매체의 포도당 농도는 일반적으로 4 nM에서 36 nM 43,44 사이이지만 더 높은 포도당 농도가 생존 능력이나 산화 반응에 미치는 영향에 대해서는 합의가 이루어지지 않았습니다. 인슐린 또는 덱사메타손(dexamethasone)35의 첨가는 장기적인 생존력을 향상시킨다고 주장되지만, 이러한 보충제의 첨가는 잠재적으로 생존력에 대한 다운스트림 효과와 함께 2차 인슐린 저항성을 유발할 수 있기 때문에 합의에 도달하지 못했다45.
이전 데이터에 따르면 200μm보다 얇은 절편은 균일하게 절단하기 어려워지고 산화 스트레스를 나타낼 수 있는 반면, 400μm보다 두꺼운 절편은 영양소의 낮은 침투율을 보여줍니다 18,19,46. 또한 PCLS 외관, 질감에 미치는 영향 및 절단 용이성에 따라 250μm의 두께가 선호됩니다. PCLS의 내부 세포층에 있는 영양소 또는 치료제의 침투는 또한 동적 시스템 18,32의 일부로 트랜스웰을 사용하여 크게 개선됩니다. 코어 절단 시스템의 통합을 통해 균일한 크기의 슬라이스를 생산할 수 있는 장점이 있는 Krumdieck 슬라이서를 사용하는 것과는 대조적으로, 슬라이싱 후 동일한 치수로 슬라이스의 크기를 조정하여 프로토콜을 조정할 수 있습니다. 그러나 실험에서 크기, 중량 또는 단백질 함량의 가변성과 배양 환경에 미치는 영향, 따라서 생존력 및 바이오마커에 미치는 영향을 고려해야 합니다. 이러한 이유로 MTA 분석 판독값은 이 프로토콜을 사용하는 동안 각 슬라이스의 새로운 중량으로 정규화됩니다. 또한 두께 이질성을 관찰할 수 있지만 불행히도 모든 유형의 슬라이서를 사용하여 관찰할 수 있습니다. 사용자는 측면을 평가하여 가장 균일하지 않은 슬라이스를 버리는 것을 고려할 수 있지만 이는 여전히 신뢰할 수 없는 옵션으로 간주되며 PCTS의 단점으로 남아 있습니다. 이 모델과 관련된 주요 한계는 상대적인 단기 생존 가능성으로 남아 있지만 이미 발표된 기간 내에 있습니다24,31. 이러한 생존력을 높이기 위해 산소 가용성을 높일 수 있습니다. 이전에 발표된 일부 프로토콜은 복잡한 배양 배지와 산소 농도가 80% 이상이어야 하며, 이는 신진대사를 상향 조절하고 더 긴 생존력을 제공해야 합니다 1,24,35,38. 또한 PCLS에 산소를 공급하는 데 사용되는 산소 수준과 세포주를 배양하는 데 사용되는 산소 수준을 직접 비교하는 것도 어렵습니다. 산소가 PCLS 생리학에 미치는 영향에 대한 데이터는 매우 제한적이며, 18,47 산소농도가 높을수록 독성 활성산소종을 생성함으로써 병태생리학 및 표현형을 실질적으로 변형시킬 수 있다48.
결론적으로, 수명이 짧은 PCLS는 제한된 장비로 생산할 수 있으며 신뢰할 수 있는 생체 외 모델로 사용할 수 있습니다. 조직 구조는 간 생리학에서 매우 중요하며, 이를 보존할 수 있는 PCLS는 이 모델을 보다 보편적인 방식으로 고려해야 하는 또 다른 예입니다. 따라서 정밀하게 절단된 슬라이스는 과학 연구에서 더 인정받는 도구가 되어야 합니다.
공개해야 할 경쟁 이해관계는 없습니다.
저자는 동물 군집의 번식과 유지에 도움을 준 Mirabela Bandol, Samantha Richards, Louise Fisher, Rebecca Towns 및 UCL Biological Services의 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 영국 의학 연구 위원회(United Kingdom Medical Research Council) 임상의 과학자 펠로우십 MR/T008024/1(JB) 및 NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre(JB)의 자금 지원을 받았습니다. 표현된 견해는 저자의 견해이며 반드시 NHS 또는 NIHR의 견해는 아닙니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 cm petri dish | Any | any suitable for cell culture | |
6, 12, 24 well culture plate | Any | any suitable for cell culture | |
Cyanoacrylate super glue | Any | ||
D-Glucose | Gibco | A24940 | |
Eosin | Merck | HT110316 | |
Ethanol | Any | ||
Fetal Bovine serum | ThermoFisher | 26400044 | |
Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
Hematoxylin | Merck | 51275 | |
HEPES | Gibco | H0887 | |
inserts 8um, for 12 well plates | Strastedt | 83.3931.800 | |
inserts 8um, for 24 well plates | Strastedt | 83.3932.800 | |
inserts 8um, for 6 well plates | Strastedt | 83.3930.800 | |
KREBS | Merck | K3753 | |
Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
Low melting agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
MTS tetrazolium reagent | Abcam | ab197010 | |
multi-well plate reader | Any | ||
PBS tablets | ThermoFisher | P4417 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Scalpel blade | Any | ||
Surgical forceps | Any | with a flat square-tip | |
Surgical scissors | Any | ||
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
William’s Medium E with GlutaMAX (WME) | ThermoFisher | W4125 |
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