Method Article
بروتوكول لإنتاج واستزراع شرائح الكبد الدقيقة (PCLS) لدراسة كبد الفئران. تركز المقالة على الجوانب الرئيسية للبروتوكول ، والتي لا تتطلب سوى معدات مختبرية قياسية مع إمكانية الوصول إلى الاهتزاز وتسمح ببقاء PCLS لمدة 4 أيام على الأقل.
يقدم هذا البروتوكول نظاما بسيطا لإنشاء واستزراع شرائح الكبد المقطوعة بدقة (PCLS). يحتوي PCLS على جميع الخلايا في بيئة سليمة ، وبالتالي فهو يشبه نموذجا صغيرا للعضو بأكمله. إنها تمكن من دراسة الأنسجة الحية مع تكرار أنماطها الظاهرية المعقدة. يسمح هذا البروتوكول بإعداد شرائح من كبد الفأر باستخدام اهتزاز ومعدات مختبرية قياسية. تفتقر بروتوكولات إنتاج وزراعة PCLS إلى التوحيد القياسي ويمكن أن تختلف بشكل كبير اعتمادا على الأنسجة ذات الاهتمام ونوع الاهتزاز المستخدم والحاجة إلى الأكسجين. قد يكون من الصعب تكاثرها في بعض المختبرات التي لا يمكنها الوصول إلا إلى مرافق الاهتزاز الأساسية ومرافق زراعة الأنسجة المشتركة. لقد وضعنا بروتوكولا يركز على أهمية بعض الخطوات الرئيسية ضمن البروتوكولات المتنوعة المتاحة بالفعل. لذلك ، يؤكد هذا البروتوكول على أهمية طريقة التضمين ، واتجاه القطع ، والنظام الديناميكي مقابل النظام الثابت ، وأهمية الحد الأدنى من حجم الثقافة. يمكن إنشاء هذا البروتوكول وإعادة إنتاجه بطريقة بسيطة في معظم المختبرات التي يمكنها الوصول إلى قطاعة الأنسجة الأساسية. مجتمعة واتباع هذا البروتوكول ، يمكن أن تظل PCLS على قيد الحياة لمدة لا تقل عن 4 أيام. PCLS هو نموذج بسيط واقتصادي وقابل للتكرار لدراسة الفحص الفيزيولوجي المرضي والعلاجي لأعضاء مثل الكبد.
شرائح الأنسجة المقطوعة بدقة (PCTS) هي أقسام رقيقة من الأعضاء. إنها تسمح بالحفاظ على بنية العضو ، وتكرار عضو صغير مع الحفاظ على الجانب ثلاثي الأبعاد للخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية. إنه نموذج جذاب نظرا لسهولة الوصول إليه ، وتوفير التكاليف ، وخصائصه الأقل كثافة في العمالة مع الحفاظ على بنية الأنسجة.
تملأ معاهدة التعاون بشأن البراءات الفجوة بين دراسات الخلايا في المختبر والبحوث الحيوانية في الجسم الحي ، وتتغلب على معظم عيوب كلا النموذجين. تم إنشاء PCTS من أعضاء مختلفة ، مثل الكبد1 ، والأمعاء2،3 ، والقولون2 ، والدماغ4،5 ، والرئة6،7،8 ، والكلى9،10 ، والطحال11،12 ، والقلب13،14 ولكن أيضا الأورام15،16. يمكن أن تنشأ أيضا من مختلفة ، مثل الفأر1 والجرذ17،18 ولكن أيضا الخنزير19 والنفايات الجراحية البشرية15،20،21. وعلى الرغم من أن معاهدة التعاون بشأن البراءات تتطلب استخدام، مما يعني ضمنا مسائل أخلاقية ذات صلة، فإن العضو من واحد يمكن أن يولد معاهدة التعاون بشأن البراءات متعددة، مما يقلل من عدد بما يتفق مع المبادئ التوجيهية NC3Rs (الاختزال والاستبدال والتنقيح)22 مع الحد من الاختلافات بين الأفراد.
سمح تطوير تقطيع الأنسجة المحسنة ، على سبيل المثال ، الاهتزازات23 ، بالانتقال من الشرائح المقطوعة يدويا التي تتميز بسماكة غير متجانسة ومعدل بقاء ضعيف إلى شرائح أرق قابلة للتكرار مع سلامة هيكلية محفوظة بشكل أفضل.
ومع ذلك، فإن بروتوكولات معاهدة التعاون بشأن البراءات، وبشكل أكثر تحديدا، إعداد شرائح الكبد المقطوعة بدقة (PCLS) وثقافتها تختلف اختلافا كبيرا في الأدبيات وتفتقر إلى التوحيد القياسي، لا سيما بالنسبة للمعلمات الأساسية مثل معدات التقطيع والمحتوى المتوسط وظروف الاستزراع. يمكن أن تختلف البروتوكولات أيضا بشكل ملحوظ اعتمادا على الأنسجة الأصلية. ستتطلب بعض البروتوكولات أكسجة المخزن المؤقت أو الثقافة مع بعض أنظمة المفاعلات الحيوية المعقدة24. عادة ما تركز بشكل فردي على جوانب تقنية مختلفة أو مصممة لأنسجة مختلفة ويمكن أن تكون مكلفة وأكثر صعوبة في التكاثر في المختبر العادي بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
هنا ، يجمع هذا البروتوكول بعض النقاط الرئيسية مثل طريقة التضمين ، واتجاه القطع ، واستخدام الآبار25 ، ونظام الاستزراع الديناميكي26 ، وأهمية الحد الأدنى من حجم الثقافة. تم تحسين بعض هذه الخطوات سابقا بشكل مستقل أو في سياق مختلف ، مثل التليف27 أو استجابة الورم28. يؤكد هذا البروتوكول أيضا على أهمية التضمين باستخدام أنواع معينة من القطاعات واتجاه القطع ، وكلاهما معلمان يصعب إتقانه وغالبا ما يتم إهماله في الأدبيات. تولد هذه الطريقة البسيطة PCLS يتم الاحتفاظ بها في المزرعة لمدة لا تقل عن 4 أيام مع سهولة الإعداد واستخدام معدات المختبر القياسية مع إمكانية الوصول إلى قطاعة الأنسجة البدائية.
تم شراء الفئران CD57Bl / 6J من النوع البري من مختبرات نهر تشارلز. كان للفئران حرية الوصول إلى الطعام والماء ، وتوجد في أقفاص جيدة التهوية بشكل فردي مع ظروف درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها وبدورة ضوئية مدتها 12 ساعة. تم التضحية بالحيوانات التي تبلغ أعمارها 3 أسابيع ، وتم حصاد الكبد على الفور دون نضح. تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية بعد المراجعة الأخلاقية المحلية من قبل مجلس رعاية والمراجعة الأخلاقية في كلية لندن الجامعية وتم إجراؤها بموجب ترخيص مشروع وزارة الداخلية PP9223137 ووفقا لقانون الإجراءات العلمية لوزارة الداخلية () (1986) وإرشادات ARRIVE. تم بذل جميع الجهود للحد من الضرر الذي يلحق بالحيوانات وفقا للممارسة المعتادة في وحدة الخدمات البيولوجية في كلية لندن الجامعية.
1. الإعداد للتجربة
2. جمع الكبد والتحضير (15 دقيقة)
3. تضمين فصوص الكبد (25 دقيقة لكل فص كبد)
4. إنتاج شرائح الكبد (40 دقيقة لكل فص)
5. حضانة شرائح الكبد
6. اختبار بقاء الخلية
7. تلطيخ الأنسجة
عند الحصاد ، يتم حذف نضح عن قصد لضمان المعالجة السريعة للعضو ومنع تلف الأعضاء. يتم استخراج الكبد بسرعة بعد الشق ووضعه على الفور في مخزن مؤقت واقي للأعضاء مثلج ، على سبيل المثال ، عازلة كريبس24،29. على الرغم من أن تقطيع أنسجة الكبد الطازجة دون التضمين قد تم وصفهسابقا 1 ، فإن تضمين الكبد في agarose30 منخفض الذوبان (الشكل 1) جنبا إلى جنب مع عازلة واقية للأعضاء سيمكن من ظروف القطع المثلى على الاهتزاز ، مما يقلل من تلف الأنسجة ويزيد من قابلية التكاثر في سمك القسم. سمك الأنسجة أمر بالغ الأهمية لأن المقاطع الرقيقة تسمح لمزيد من طبقات الخلايا بالوصول إلى العناصر الغذائية والأكسجين31 وتقليل موت الخلايا. ومع ذلك ، يصبح من الصعب قطع الأقسام الرقيقة جدا بشكل متجانس. على العكس من ذلك ، ستظهر الشرائح التي يزيد سمكها عن 400 ميكرومتر معدل اختراق أقل للعناصر الغذائية. تم احتضان الأقسام في واجهة هواء سائل باستخدام ملحق (الشكل 1) واحتضانها بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 21٪ O2 عند 37 درجة مئوية على شاكر. يجب تحضين الأقسام في وسط استزراع في غضون 3 ساعات بعد الحصاد ، وبعد ذلك يحدث موت الخلايا بسرعة32.
لتحديد جدوى PCLS ، تم تقييم صلاحية الخلية عن طريق اختبار 4،5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) ، والذي يتطلب نازعة الهيدروجين المعتمدة على NAD (P) H ، أي الخلايا النشطة الأيضية ، لتقليل MTS. تم تطبيع قيم MTS إلى وزن الشريحة المعنية. لتحسين جدوى PCLS ، كان الحد الأدنى من حجم وسط الاستزراع ضروريا للحفاظ على الجدوى بعد 24 ساعة من الحضانة. أظهر حجم 0.7 مل في 24 لوحة بئر انخفاضا كبيرا في الجدوى بواسطة مقايسة TMS (ص = 0.02) مقارنة ب 1.5 مل في 12 لوحة بئر و 2.6 مل في 6 ألواح آبار (الشكل 2 أ). تم اختيار هذه المجلدات للسماح بتغطية الأقسام قليلا ، ولكنها قد تحتاج إلى تعديل اعتمادا على نوع الإدخالات واللوحات المستخدمة. مثل33 ، يتم استخدام 12 لوحة بئر أخرى كأفضل حل وسط للبقاء الأمثل ضمن حجم أصغر من وسط الاستزراع.
يعد الاهتزاز أمرا ضروريا ويزيد من قابلية بقاء PCLS بنسبة 50٪ بعد 24 ساعة من الحضانة مقارنة بالثقافة الثابتة (الشكل 2 ب). يخلق الاهتزاز واجهة هواء سائلة مهمة ، محسنة باستخدام الآبار ، مما يسمح بالوصول إلى العناصر الغذائية والأكسجين لكلا وجهي القسم. يزداد امتصاص الأكسجين والمواد المغذية أيضا من خلال التدفق المستمر الناتج عن حركة الاهتزاز ، والتي تمر أيضا عبر غشاء الجيدات.
تم تقييم اختبار MTS من حضانة 1 ساعة حتى اليوم 6 من الحضانة. ظلت صلاحية الخلية ثابتة من اليوم 0 إلى اليوم 4 بعد الحضانة قبل ملاحظة انخفاض كبير (ص = 0.05) في اليوم 6 (الشكل 2 ج). لم يظهر مورفولوجيا PCLS التي تم تقييمها بواسطة تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & E) عدم وجود تغيير في القنوات الصفراوية والهندسة المعمارية حتى 5 أيام بعد الحضانة (الشكل 3A-D). بالمقارنة مع اليوم 0 (الشكل 3 أ) ، لم تظهر PCLS أي اختلاف نسيجي في اليوم 1 (الشكل 3 ب) واليوم 2 (الشكل 3 ج) بعد الحضانة ، مع فرط اللون النووي ، والتسلل الالتهابي الخفيف ، والتفريغ لصالح عملية موت الخلايا المعتدلة في اليوم 5 بعد الحضانة (الشكل 3 د). مجتمعة ، يتيح بروتوكول ثقافة PCLS هذا الجدوى لمدة 4 أيام على الأقل ، بما يتفق مع الدراسات التي تستخدم شرائح في ظروف مماثلة31.
الشكل 1: تخطيطي يلخص بروتوكول إنشاء PCLS. تم تعديل هذا الرقم من34. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يظهر البروتوكول الأمثل لثقافة PCLS قابلية مرضية لمدة 5 أيام. (أ) تأثير حجم البئر على تكاثر الخلايا (ن = 3). (ب) تأثير الاهتزاز على تكاثر الخلايا (ن = 6 لكل حالة). (ج) اختبار تكاثر الخلايا MTS من أقسام الكبد من d0 إلى d6 أيام من الحضانة (ن = 5 لكل نقطة زمنية). وحدة تعسفية OD ، تطبيع لشريحة الوزن الجديد. يوضح الرسم البياني متوسط ± SD. اختبار t للطالب ثنائي الذيل غير المقترن ، ns = غير مهم ، * ص <0.05 ، ** ص <0.01. تم تعديل هذا الرقم من34. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نتائج الأنسجة. (أ-د) صور تمثيلية لأنسجة PCLS الكبدية بعد تلطيخ H& E. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من34. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نحن نثبت أنه يمكن تحقيق إنتاج وزراعة PCLS بسهولة مع ضمان عمر نصف لا يقل عن 4 أيام. يلخص هذا البروتوكول خمس خطوات حاسمة: طريقة التضمين إذا تم استخدام هذا النوع من الاهتزاز ، واتجاه القطع ، ونظام ديناميكي للثقافة ، والحد الأدنى من حجم الثقافة ، واستخدام الإدخالات.
تتوفر بروتوكولات إنتاج وثقافة PCLS بشكل شائع. ومع ذلك ، فهي تفتقر إلى التوحيد القياسي. قد يركزون على نقاط متشابهة ومحددة من البروتوكول ولكن قد يكون من الصعب تكرارها بطريقة بسيطة أو في معظم المختبرات التي يمكنها الوصول إلى اهتزاز أساسي. أنواع الاهتزازات أو تقطيع الأنسجة واسعة. ستختلف في التكلفة والخصائص الفنية ، مثل وجود نظام تبريد متكامل أم لا ، ولكن ميزتها المشتركة هي نظام القطع الخاص بها باستخدام شفرة حلاقة متذبذبة. الفرق الرئيسي فيما يتعلق بتقطيع الأنسجة هو متطلبات التضمين. لأسباب واضحة وتأثير التضمين على الجدوى ، يجب تجنبه بشكل مثالي. أحد الأمثلة على مقسم التقطيع المرجعي الذي لا يتطلب التضمين هو قطاعة Krumdieck35. يسمح هذا النوع من القطاعة بقطع الأنسجة في مخزن مؤقت مبرد أثناء استخدام قلب ، مما ينتج عنه شرائح متساوية الحجم مع تجنب التضمين. ومع ذلك ، يميل هذا الجهاز إلى أن يكون أكثر تكلفة من الاهتزازات الأساسية وأقل استخداما أو توفرا في معظم المختبرات. تميل الاهتزازات مثل تلك المستخدمة في هذا البروتوكول إلى أن تكون متاحة بالفعل لقطع الأنسجة الثابتة كيميائيا ولكنها تتطلب تضمين فصوص الكبد. أظهر البعض أنه يمكن تحقيق قطع شرائح الكبد دون تضمين واستخدام اهتزازمماثل 1 ؛ ومع ذلك ، في تجربتنا ، ثبت أنه من الصعب إعادة إنتاجه. أيضا ، أثناء استخدام هذا النوع من الاهتزاز ، يتسبب تقطيع الكبد بدون هلام الاغاروز الداعم ثلاثي الأبعاد إلى تلف الشرائح وسمك غير متساو ، وبالتالي يزيد من موت الخلايا. يتضمن هذا البروتوكول قطع فص الكبد بشكل عرضي بدلا من السهمية. خطوة القطع هي تقنية يصعب إتقانها ، وعلى حد علمنا ، فإن اتجاه القطع هو تفاصيل مهمة لا يتم التركيز عليها أبدا. يمكن أن يؤدي اتجاه الفص أثناء القطع إلى تسهيل عملية القطع بشكل كبير مع تقليل الضغط على الكبد. يمكن أيضا اعتبار استخدام الهيدروجيل فائدة محسنة36.
المعيار المهم التالي هو الحاجة إلى كميات أكبر من الثقافة لزيادة الجدوى. تم بالفعل اقتراح كميات أكبر لتوفير المزيد من العناصر الغذائية وتخفيف منتجات الأحماض الصفراوية الأكثر سمية37. تؤدي إضافة نظام ديناميكي مع الاهتزاز وجنبا إلى جنب مع استخدام Transwells على تحسين الوصول إلى العناصر الغذائية وربما الأكسجين إلى كلا وجهي القسم من خلال إنشاء تدفق ثابت18،38،39. تم بالفعل إثبات استخدام transwell وميزة النظام الديناميكي في سياقات مختلفة ، مثل استجابات شريحة الكبد للورم البشري28 ونمذجة التليف26،27. يؤكد هذا البروتوكول ميزتها في الجانب الفسيولوجي الأوسع.
يتم اختيار ويليامز Medium E بشكل شائع كوسيط قياسي لزراعة الخلايا لPCLS 40،41. تم وصف الوسائط المكملة بالجلوكوز والمصل ذات الفائدة المحتملة في الحفاظ على صلاحية ووظائف الشرائح42. عادة ما يتراوح تركيز الجلوكوز في الوسط بين 4 نانومتر إلى 36 نانومتر43،44 ، ولكن لم يتم العثور على إجماع على تأثير تركيز الجلوكوز العالي على الجدوى أو الاستجابة التأكسدية. يزعم أن إضافة الأنسولين أو ديكساميثازون35 يحسن قابلية البقاء على المدى الطويل ، ولكن لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء لأن إضافة هذه المكملات يمكن أن تحفز مقاومة الأنسولين الثانوية مع تأثير نهائي على الجدوى45 .
تظهر البيانات السابقة أن الأجزاء الأرق من 200 ميكرومتر يصعب قطعها بشكل متجانس ويمكن أن تظهر إجهادا تأكسديا ، بينما تظهر الشرائح التي يزيد سمكها عن 400 ميكرومتر معدل اختراق منخفض للمغذيات18،19،46. أيضا ، بناء على مظهر PCLS ، والتأثيرات على الملمس ، وسهولة القطع ، يفضل سمك 250 ميكرومتر. كما تم تحسين تغلغل العناصر الغذائية أو العامل العلاجي في طبقات الخلايا الداخلية ل PCLS بشكل كبير باستخدام الآبار كجزء من النظام الديناميكي 18،32. على عكس استخدام قطاعة Krumdieck التي تتميز بإنتاج شرائح متساوية الحجم من خلال دمج نظام القطع الأساسي ، يمكن تكييف البروتوكول عن طريق تغيير حجم الشرائح بأبعاد متساوية بعد التقطيع. ومع ذلك ، يجب مراعاة التباين في الحجم أو الوزن أو محتوى البروتين في التجربة وتأثيره على بيئة الاستزراع ، وبالتالي على الجدوى والمؤشرات الحيوية. لهذا السبب ، يتم تطبيع قراءات اختبار MTA ، أثناء استخدام هذا البروتوكول ، إلى الوزن الجديد لكل شريحة. أيضا ، يمكن ملاحظة عدم تجانس السماكة ، ولكن لسوء الحظ ، من المحتمل أن يتم ملاحظته باستخدام جميع أنواع القطاعات. يمكن للمستخدم التفكير في التخلص من الشرائح الأقل تجانسا من خلال تقييم جانبها ، لكن هذا لا يزال يعتبر خيارا غير موثوق به ويظل عيبا في معاهدة التعاون بشأن البراءات. يظل القيد الرئيسي المرتبط بهذا النموذج هو الجدوى النسبية على المدى القصير ، لكنه يقع ضمن الإطار الزمني المنشور بالفعل24،31. يمكن تعزيز توافر الأكسجين لزيادة هذه الجدوى. تتطلب بعض البروتوكولات المنشورة سابقا وسائط ثقافة معقدة وتركيز أكسجين أعلى من 80٪ ، مما يؤدي إلى تنظيم عملية التمثيل الغذائي وتوفير صلاحية أطول1،24،35،38. من الصعب أيضا مقارنة مستويات الأكسجين المستخدمة في أكسجة مركبات الكربون الكلورية متعددة الكلور ومستويات الأكسجين المستخدمة في زراعة خطوط الخلايا. البيانات المتعلقة بتأثيرات الأكسجين على فسيولوجيا PCLS محدودة للغاية18،47 ، ومن المرجح أن يؤدي تركيز الأكسجين العالي إلى تعديل الفيزيولوجيا المرضية والنمط الظاهري بشكل كبير عن طريق توليد أنواع الأكسجين التفاعلية السامة48.
في الختام ، يمكن إنتاج PCLS قصيرة العمر بمعدات محدودة واستخدامها كنموذج موثوق به خارج الجسم الحي . تعد بنية الأنسجة أمرا بالغ الأهمية في فسيولوجيا الكبد ، ويعد PCLS الذي يسمح بالحفاظ عليه مثالا آخر على سبب وجوب النظر في هذا النموذج بطريقة أكثر انتشارا. لذلك ، يجب أن تصبح الشرائح المقطوعة بدقة أداة أكثر شهرة في البحث العلمي.
لا توجد مصالح متنافسة يجب الكشف عنها.
يشكر المؤلفون ميرابيلا باندول وسامانثا ريتشاردز ولويز فيشر وريبيكا تاونز والموظفين من UCL Biological Services لمساعدتهم في تربية وصيانة مستعمرات. تم دعم هذا العمل بتمويل من زمالة العلماء السريريين لمجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة MR / T008024 / 1 (JB) ومركز أبحاث الطب الحيوي في مستشفى جريت أورموند ستريت (JB). الآراء المعبر عنها هي آراء المؤلف (المؤلفين) وليس بالضرورة آراء NHS أو NIHR.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 cm petri dish | Any | any suitable for cell culture | |
6, 12, 24 well culture plate | Any | any suitable for cell culture | |
Cyanoacrylate super glue | Any | ||
D-Glucose | Gibco | A24940 | |
Eosin | Merck | HT110316 | |
Ethanol | Any | ||
Fetal Bovine serum | ThermoFisher | 26400044 | |
Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
Hematoxylin | Merck | 51275 | |
HEPES | Gibco | H0887 | |
inserts 8um, for 12 well plates | Strastedt | 83.3931.800 | |
inserts 8um, for 24 well plates | Strastedt | 83.3932.800 | |
inserts 8um, for 6 well plates | Strastedt | 83.3930.800 | |
KREBS | Merck | K3753 | |
Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
Low melting agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
MTS tetrazolium reagent | Abcam | ab197010 | |
multi-well plate reader | Any | ||
PBS tablets | ThermoFisher | P4417 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Scalpel blade | Any | ||
Surgical forceps | Any | with a flat square-tip | |
Surgical scissors | Any | ||
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
William’s Medium E with GlutaMAX (WME) | ThermoFisher | W4125 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved