טכניקה אופטימלית ופשוטה לייצור ותרבות של פרוסות כבד בחיתוך מדויק

פרוטוקול לייצור ותרבית של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (PCLS) לחקר כבדי עכברים. המאמר מתמקד בהיבטים מרכזיים של הפרוטוקול, הדורש רק ציוד מעבדה סטנדרטי עם גישה לוויברטום ומאפשר הישרדות של PCLS למשך 4 ימים לפחות.

פרוטוקול זה מציג מערכת פשוטה ליצירה ותרבית של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (PCLS). PCLS מכיל את כל התאים בסביבה שלמה, ולכן דומה למודל קטן של האיבר כולו. הם מאפשרים לחקור רקמות חיות תוך שכפול הפנוטיפים המורכבים שלהן. פרוטוקול זה מאפשר הכנת פרוסות מכבדי עכברים באמצעות ויברטום וציוד מעבדה סטנדרטי. פרוטוקולים לייצור וטיפוח PCLS חסרים סטנדרטיזציה ויכולים להשתנות באופן דרסטי למדי בהתאם לרקמה המעניינת, סוג הוויברטום בו נעשה שימוש והצורך בחמצן. אלה יכולים להיות קשים לשכפול במעבדות מסוימות שיש להן גישה רק לוויברטום בסיסי ולמתקני תרבית רקמות נפוצים. גיבשנו פרוטוקול המתמקד בחשיבותם של כמה צעדים מרכזיים במסגרת הפרוטוקולים המגוונים שכבר קיימים. פרוטוקול זה, אם כן, מדגיש את החשיבות של שיטת ההטמעה, כיוון החיתוך, מערכת דינמית לעומת סטטית והרלוונטיות של נפח מינימלי של תרבות. ניתן להקים ולשכפל פרוטוקול זה בצורה פשוטה ברוב המעבדות שיש להן גישה לפורס רקמות בסיסי. ביחד ובהתאם לפרוטוקול זה, PCLS יכול להישאר בחיים לפחות 4 ימים. PCLS הוא מודל פשוט, חסכוני וניתן לשחזור לחקר בדיקות פתופיזיולוגיות וטיפוליות לאיברים כמו הכבד.

פרוסות רקמה בחיתוך מדויק (PCTS) הן חלקים דקים של איברים. הם מאפשרים לשמר את הארכיטקטורה של האיבר המשכפל מיני איבר תוך שמירה על ההיבט התלת מימדי של תאים שכנים ומטריצה חוץ-תאית. זהו מודל מושך בשל הגישה הקלה שלו, החיסכון בעלויות והמאפיינים הפחות עתירי עבודה תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמות.

PCTS ממלאים פער בין מחקרי תאים במבחנה למחקר בבעלי חיים in vivo, ומתגברים על רוב החסרונות של שני המודלים. PCTS נוצר מאיברים שונים, כגון כבד¹, מעיים ^2,3, מעי^{גס 2}, מוח ^4,5, ריאות ^6,7,8, כליות ^9,10, טחול^11,12, לב^13,14 אך גם גידולים^15,16. הם יכולים גם להגיע מבעלי חיים שונים, כגון עכבר¹, חולדה^17,18 אך גם חזיר¹⁹ ופסולת כירורגית אנושית 15,20,21. למרות ש-PCTS דורש שימוש בבעלי חיים, מה שמרמז על סוגיות אתיות, האיבר מבעל חיים אחד יכול לייצר PCTS מרובים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים בהסכמה עם הנחיות NC3Rs (הפחתה, החלפה, עידון)²² תוך הגבלת וריאציות בין-אישיות.

הפיתוח של פורסות רקמות משופרות, למשל, ויברטומות²³, איפשר מעבר מפרוסות חתוכות ידנית המאופיינות בעובי הטרוגני ושיעור הישרדות נמוך לפרוסות דקות יותר הניתנות לשחזור עם שלמות מבנית שנשמרה טוב יותר.

עם זאת, פרוטוקולים עבור PCTS, וליתר דיוק, הכנה ותרבית של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (PCLS) משתנים באופן משמעותי בספרות וחסרים סטנדרטיזציה, במיוחד עבור פרמטרים חיוניים כגון ציוד חיתוך, תוכן בינוני ותנאי תרבית. הפרוטוקולים יכולים גם להשתנות באופן ניכר בהתאם לרקמת המקור. חלק מהפרוטוקולים ידרשו חמצון של המאגר או התרבית עם כמה מערכות ביו-ריאקטור מסובכות²⁴. הם בדרך כלל מתמקדים בנפרד בהיבטים טכניים שונים או מיועדים לרקמות שונות ולעתים קרובות יכולים להיות יקרים ומאתגרים יותר לשכפול במעבדה הממוצעת בצורה חסכונית.

כאן, פרוטוקול זה מאגד כמה נקודות מפתח כגון שיטת ההטמעה, כיוון החיתוך, השימוש בשקעים²⁵, מערכת תרבית דינמית²⁶ והחשיבות של נפח מינימלי של תרבות. חלק מהשלבים הללו עברו אופטימיזציה בעבר באופן עצמאי או בהקשר אחר, כגון פיברוזיס²⁷ או תגובת גידול²⁸. פרוטוקול זה מדגיש גם את החשיבות של הטמעה באמצעות סוגים מסוימים של פורסים וכיוון החיתוך, שהם שניהם פרמטרים קשים לשליטה ולעתים קרובות מוזנחים בספרות. שיטה פשוטה זו מייצרת PCLS הנשמר בתרבית למשך 4 ימים לפחות עם התקנה קלה ושימוש בציוד מעבדה סטנדרטי עם גישה לפורס רקמות בסיסי.

עכברי CD57Bl/6J מסוג פרא נרכשו ממעבדות צ'ארלס ריבר. לעכברים הייתה גישה חופשית למזון ומים, שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד עם תנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים ועם מחזור אור של 12 שעות. בעלי חיים בני 3 שבועות הוקרבו, וכבדים נקטפו מיד ללא זלוף. כל העבודות בבעלי חיים אושרו לאחר ביקורת אתית מקומית על ידי מועצת הביקורת האתית והרווחה של בעלי החיים של אוניברסיטת קולג' לונדון ובוצעו תחת רישיון פרויקט של משרד הפנים PP9223137 ובהתאם לחוק הנהלים המדעיים של משרד הפנים (בעלי חיים) (1986) והנחיות ARRIVE. כל המאמצים נעשו כדי להגביל את הפגיעה בבעלי חיים בהתאם לנוהג המקובל ביחידה לשירותים ביולוגיים ביוניברסיטי קולג' לונדון.

1. התכוננו לניסוי

1. ביום שלפני הקטיף, בצע את השלבים הבאים.
   1. הכן 1 ליטר של מאגר קרבס-הנסלייט (KREBS) על ידי המסת בקבוקון אחד של אבקת קרבס ל-1 ליטר מים סטריליים. מצננים אותו ל-4 מעלות צלזיוס ושומרים אותו על קרח רטוב.
   2. מחטאים את המגש עם 70% אתנול ושוטפים עם PBS סטרילי. שמור את המגש עטוף בנייר כסף במקרר למשך הלילה כדי לסייע בשמירה על סביבה קרה בזמן החיתוך.
   3. יש לרסס את כל שאר החלקים הניתנים להסרה באתנול, לשטוף עם PBS סטרילי, להשאיר לייבוש ולשמור אותם סטריליים. חיטוי הלהבים ושמור אותם סטריליים עד לשימוש.
   4. הכן 4% w/v אגרוז נמס נמוך במים סטריליים. לאחר ההשעיה וההמסה, יש לאחסן את האגרוז במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.
2. ביום הקציר ולפני קציר הכבד, בצע את הצעדים הבאים.
   1. ממיסים את האגרוז הנמס הנמוך של 4% ושומרים אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש לוודא שהאגרוז התקרר ל-37 מעלות צלזיוס ושכל הבועות התפזרו לפני השימוש.
   2. הכן את צלחות התרבות על ידי הוספת 2.6 מ"ל, 1.5 מ"ל ו -0.7 מ"ל לבאר בהתאמה לצלחות 6, 12 ו -24 באר. הוסיפו 8 מיקרומטר תוספות נקבוביות לכל באר. הנח את הצלחות באינקובטור לח המוגדר לרמת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-21% O₂ . זה יעזור להתאים את ה-pH תוך חימום המדיה, כך שהיא מוכנה לתרבית.
   3. תרבית את הפרוסות עם תוספות נקבוביות של 8 מיקרומטר כדי לאפשר גישה לשני הפנים של הפרוסה. הכן את המדיה באופן הבא: הוסף ל-William's Medium E (WME), תוסף L-גלוטמין 2 מ"מ, סרום בקר עוברי 10% (FBS), 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, תמיסת D-גלוקוז 25 מ"מ ותמיסת HEPES 15 מ"מ.

2. איסוף כבד והכנה (15 דקות)

1. עקר את כל המכשירים לפני הקציר.
2. להרדים את העכבר על פי נהלים מקומיים לטיפול בבעלי חיים למטרות מדעיות באמצעות מסכת איזופלורן. לפני פתיחת חלל הבטן, צבט בין אצבעות הרגליים כדי לוודא שהחיה מורדמת כראוי. אם ניתן להסיר את הכבד במהירות, ניתן להמית את העכבר על ידי חנק_CO2 או פריקת צוואר הרחם. מכיוון שההליך הוא הליך סופני, אל תשתמש במשחת עיניים מכיוון שהדבר לא ישפיע על בעל החיים.
3. יש לרסס את הבטן באתנול 70%. אופציונלי: לגלח את העכבר כדי למנוע זיהום בשיער.
4. פתח את חלל הבטן בעזרת מלקחיים סטריליים ומספריים על ידי חיתוך העור והצפק מאמצע הבטן. נתח את הכבד בעדינות מאיברים או כלי דם אחרים והימנע מפגיעה באונות.
5. יש לאחסן את כל הכבד מיד ב-Krebs Buffer קר כקרח. בצע את כל השלבים הנוספים על הקרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והמשך להכנת הכבד במהירות האפשרית כדי למנוע מוות נוסף של תאים.

3. הטמעת אונות הכבד (25 דקות לכל אונת כבד)

1. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי על קרח המכילה בופר קרבס קר כקרח, ומוודאים שהכבד כולו שקוע במלואו.
2. הפרד כל אונה בנפרד באמצעות מלקחיים קהים וסכין חדה וסטרילית כדי למנוע נזק לאונות.
3. בחר את האונה הראשונה לחיתוך ושמור את האונות הנותרות במאגר קרבס קר כקרח עד שהן מוכנות להטמעה וחיתוך.
4. חותכים את כל הקצוות כדי לקבל אונה קלה יותר לניהול עם קצוות ישרים מוכנים להטמעה. זה גם יעזור להסיר חלק מהקפסולה הסיבית של גליסון כדי להקל עוד יותר על החתך. עשו זאת תוך שמירה על משטחי הכבד רטובים במאגר קרבס קר כקרח.
5. מניחים צלחת פטרי בגודל 3 ס"מ (או דומה) על קרח רטוב ויוצקים לתוכה את האגרוז הנמס 4% (כבר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס). שמור היטב על הקרח כדי לאפשר לאגרוז להתקרר בכיוון כלפי מעלה תוך מניעת שקיעת האונה לתחתית והטמעתה בצורה אחידה.
6. השאירו את האגרוז להתקרר עוד יותר למשך 30 שניות והניחו לתוכה את האונה הקצוצה. האונה תתייצב באמצע גוש האגרוז. תהליך ההטמעה דורש תרגול ואופטימיזציה כדי להתאים לכל תנאי מעבדה וניסיון אישי.
7. מניחים את האונה המוטבעת, עדיין על קרח, במקרר למשך 5 דקות. לאחר מכן יש להגדיר את האגרוז בבירור.
8. חותכים את החלק החיצוני של גוש האגרוז. עקור את גוש האגרוז מהצלחת.
9. חותכים את האגרוז לגודל הניתן לניהול יותר, ומוודאים שהצד העליון והצד המודבק לפלטפורמת הוויברטום מקבילים לקצה העליון של האונה.
10. התחל את תהליך החיתוך במהירות האפשרית אך ודא שגוש האגרוז נשמר במאגר קרבס קר כקרח ועל קרח.

4. ייצור פרוסות כבד (40 דקות לאונה)

1. הגדר את הוויברטום לחיתוך בעובי של 250 מיקרומטר, במהירות של 5 ובתדר של 7 הרץ. אלה פרמטרים מנחים; בהתאם לסוג הוויברטום בו נעשה שימוש, זה עשוי לדרוש אופטימיזציה.
2. רססו את אזורי הוויברטום והספסל ב-70% אתנול לפני החיתוך כדי לשמור על הסביבה סטרילית ככל האפשר.
3. מניחים את המגש על הוויברטום ויוצקים קרח סביבו. הנח את הלהבים על הוויברטום בזווית של 10° כלפי מטה ומתחת לאופק.
4. מלאו את מיכל הוויברטום במאגר קרבס קר כקרח. הניחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על הרציף.
5. יבש את קצה גוש האגרוז שיודבק על הרציף באמצעות רקמה סופגת סטרילית.
6. הנח את בלוק האגרוז על הפלטפורמה הנשלפת. מקם את האונה זקופה כדי לאפשר לחתוך אותה לרוחב. למרות שגודל הפרוסות מצטמצם, הדבר מקל באופן דרסטי על תהליך החיתוך על ידי הגבלת הלחץ על האונה בזמן החיתוך.
7. המתן דקה אחת עד שהדבק יתייצב ויטבול את הפלטפורמה הנשלפת לתוך המיכל וודא שבלוק האגרוז מכוסה לחלוטין במאגר קרבס.
8. תכנת את הוויברטום לחיתוך על ידי הגדרת מצבי ההתחלה והעצירה. התחל לחתוך פרוסות עבות יותר בתחילה עד שמגיעים לאונה הכבד.
9. השלך את הפרוסה הראשונה, מכיוון שייתכן שהיא לא נחתכת לעובי הנכון. כדי להימנע מפגיעה בפרוסות, השתמש במרית כדי לאסוף את פרוסות הכבד במקום מלקחיים או מברשות.
   הערה: ניתן להשתמש במברשת קטנה מחוטאת ב-70% אתנול ושטופה ב-PBS סטרילי כדי להנחות בעדינות את הרקמה במהלך תהליך החיתוך.
10. חזור על התהליך עד להגעה למספר הפרוסות הנדרש. האונה עלולה לעקור את עצמה מדי פעם מהאגרוז, ולמנוע שימוש נוסף. אוספים את הפרוסות למאגר קרבס קר כקרח עד לתרבות.

5. דגירה של פרוסות כבד

1. מעבירים את הפרוסות, בעזרת מרית, לבארות המוכנות המכילות את המדיה והתוספות.
2. הנח את הלוחות על שייקר מסלולי, הגדר את המהירות ל-130 סל"ד ודגר באמצעות חממת תרבית תאים קונבנציונלית עם 5% CO2 ו-21% O2 ב-37 מעלות צלזיוס. נפח התרבות הסופי הוא 2.6 מ"ל, 1.5 מ"ל ו -0.7 מ"ל לבאר בצלחות של 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.
3. הניחו צלחת ריקה אחת מתחת לצלחת התרבות המכילה את הפרוסות בתרבית כדי לאפשר פיזור חום מוגזם שמקורו בפלטפורמת השייקר. החלף את המדיום כל 48 שעות.

6. בדיקת הישרדות תאים

1. העבירו את הפרוסות לצלחת של 48 בארות המכילה 400 מיקרוליטר של מדיה Medium E מלאה של וויליאמס שחוממה מראש והוסיפו 80 מיקרוליטר של MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) מגיב טטרזוליום.
2. לאחר הדגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ על שייקר, העבירו 200 מיקרוליטר של מדיה לצלחת של 96 בארות, ומדדו את הספיגה ב-490 ננומטר באמצעות קורא צלחות מרובות בארות. השתמש בפרוסות שנותרו על הספסל ב-PBS ובטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כבקרות שליליות.

7. צביעה היסטולוגית

1. הפזר והתייבש מחדש את החלקים באמצעות קסילן ואתנול, ואחריהם מים נטולי יונים. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 3 דקות.
2. שוטפים במים נטולי יונים למשך 5 דקות. טבלו במהירות פי 10 באתנול חומצי (1 מ"ל HCL מרוכז ו-400 מ"ל אתנול 70%).
3. יש לשטוף פעמיים במים נטולי יונים ולנגב עודפי מים. טובלים את החלקים באוזין למשך 30 שניות.
4. יש לייבש ל-95% אתנול, ולאחר מכן ל-100% אתנול למשך 5 דקות, פי 3 כל אחד. טובלים חלקים בקסילן 3x למשך 15 דקות כל אחד. הנח כיסויים על מגלשות.

בעת הקציר, הזלוף של החיה מושמט בכוונה כדי להבטיח עיבוד מהיר של האיבר ולמנוע נזק לאיברים. הכבד נשאב במהירות לאחר החתך ומונח מיד במאגר מגן איברים קר כקרח, למשל, בופר קרבס^24,29. למרות שחיתוך רקמת כבד טרייה ללא הטבעה תואר בעבר¹, הטמעת הכבד באגרוז³⁰ נמס נמוך (איור 1) בשילוב עם מאגר מגן איברים יאפשרו תנאי חיתוך אופטימליים על הוויברטום, יפחיתו נזק לרקמות ויגדילו את יכולת השחזור בעובי החתך. עובי הרקמה הוא קריטי מכיוון שחלקים דקים מאפשרים ליותר שכבות תאים לגשת לחומרים מזינים וחמצן³¹ ולהפחית את מוות התאים. עם זאת, קטעים דקים מדי הופכים קשים לחיתוך הומוגני. לעומת זאת, פרוסות עבות מ -400 מיקרומטר יראו קצב חדירה נמוך יותר של חומרים מזינים. החלקים הודגרו בממשק נוזל-אוויר באמצעות תוספת (איור 1) והודגרו עם 5% CO₂ ו-21% O₂ ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר. יש לדגור את החלקים במדיום תרבית תוך 3 שעות לאחר הקטיף, ולאחר מכן מוות תאים מתרחש במהירות³².

כדי לקבוע את הכדאיות של PCLS, כדאיות התאים הוערכה על ידי בדיקת 4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), הדורשת דהידרוגנאזות תלויות NAD(P)H, כלומר תאים פעילים מטבולית, כדי להפחית MTS. ערכי MTS נורמלו למשקל הפרוסה המתאים. כדי לייעל את כדאיות ה-PCLS, נפח מינימלי של מדיום תרבית היה חיוני לשמירה על הכדאיות לאחר 24 שעות של דגירה. נפח של 0.7 מ"ל ב-24 לוחות בארות הראה ירידה משמעותית בכדאיות על ידי בדיקת TMS (p = 0.02) בהשוואה ל-1.5 מ"ל ב-12 לוחות בארות ו-2.6 מ"ל ב-6 לוחות בארות (איור 2A). נפחים אלה נבחרו כדי לאפשר כיסוי קל של החלקים, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים אותם בהתאם לסוג התוספות והצלחות בהן נעשה שימוש. כמו אחרים³³, 12 צלחות באר משמשות כפשרה הטובה ביותר להישרדות אופטימלית בנפח קטן יותר של מדיום תרבית.

טלטול הוא חיוני ומגדיל את כדאיות ה-PCLS ב-50% ב-24 שעות לאחר הדגירה בהשוואה לתרבית סטטית (איור 2B). טלטול יוצר ממשק אוויר-נוזל קריטי, המותאם לשימוש במעברים, ומאפשר גישה לחומרים מזינים וחמצן לשני הצדדים של הקטע. ספיגת החמצן והחומרים המזינים מוגברת גם על ידי הזרימה המתמדת שנוצרת על ידי תנועת הרעידה, העוברת גם דרך קרום הטרנסוול.

בדיקת MTS הוערכה משעה אחת של דגירה עד ליום 6 של הדגירה. כדאיות התא נותרה קבועה מהיום ה-0 עד היום הרביעי לאחר הדגירה לפני שנצפתה ירידה משמעותית (p = 0.05) ביום השישי (איור 2C). מורפולוגיה של PCLS שהוערכה על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) לא הראתה שינוי בדרכי המרה ובארכיטקטורה עד 5 ימים לאחר הדגירה (איור 3A-D). בהשוואה ליום 0 (איור 3A), PCLS לא הראה הבדל היסטולוגי ביום 1 (איור 3B) וביום 2 (איור 3C) לאחר הדגירה, עם היפרכרומזיה גרעינית, חדירה דלקתית קלה, ואקואוליזציה לטובת תהליך מוות תאים מתון ביום 5 לאחר הדגירה (איור 3D). יחד, פרוטוקול תרבית PCLS זה מאפשר כדאיות למשך 4 ימים לפחות, בהתאם למחקרים המשתמשים בפרוסות בתנאים דומים³¹.

איור 1: סיכום סכמטי של הפרוטוקול ליצירת PCLS. נתון זה שונה^מ-34. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פרוטוקול אופטימלי של תרבית PCLS מראה כדאיות משביעת רצון למשך 5 ימים. (A) השפעת גודל הבאר על התפשטות התאים (n=3). (B) השפעת טלטול על התפשטות תאים (n=6 לכל מצב). (C) בדיקת התפשטות תאי MTS מקטעי כבד מ-d0 עד d6 ימי דגירה (n=5 לנקודת זמן). יחידה שרירותית OD, מנורמלת לפרוס משקל טרי. הגרף מציג ממוצע ± SD. מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג, ns=לא מובהק, *p<0.05, **p<0.01. נתון זה שונה^מ-34. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוצאות היסטולוגיה. (א-ד) תמונות מייצגות של היסטולוגיה של PCLS בכבד לאחר צביעת H&E. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה שונה^מ-34. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

אנו מדגימים כי ניתן להשיג בקלות ייצור וטיפוח PCLS תוך הבטחת זמן מחצית חיים של 4 ימים לפחות. פרוטוקול זה מסכם חמישה שלבים קריטיים: שיטת ההטמעה אם נעשה שימוש בסוג זה של ויברטום, כיוון החיתוך, מערכת דינמית של תרבית, נפח מינימלי של תרבית ושימוש בתוספות.

פרוטוקולים לייצור ותרבות של PCLS זמינים בדרך כלל. עם זאת, הם חסרים סטנדרטיזציה; הם עשויים להתמקד בנקודות דומות וספציפיות של הפרוטוקול אך יכולים להיות קשים לשכפול בצורה פשוטה או ברוב המעבדות שיש להן גישה לרטט בסיסי. סוגי הוויברטומות או פורסות הרקמות הם רחבים. הם ישתנו בעלות ובמאפיינים הטכניים, כגון מערכת קירור משולבת או לא, אך המאפיין המשותף שלהם הוא מערכת החיתוך שלהם באמצעות סכין גילוח מתנודד. ההבדל העיקרי בכל הנוגע לחיתוך רקמות הוא הדרישה להטמעה. מסיבות ברורות והשפעת ההטמעה על הכדאיות, יש להימנע מכך באופן אידיאלי. דוגמה אחת לפורס ייחוס שאינו דורש הטבעה הוא פורס קרומדיק³⁵. סוג זה של פורס מאפשר לחתוך את הרקמה במאגר מקורר תוך שימוש בליבה, לייצר פרוסות בגודל שווה תוך הימנעות מהטבעה. עם זאת, מכשירים כאלה נוטים להיות יקרים יותר מוויברטומים בסיסיים יותר ופחות נפוצים או זמינים ברוב המעבדות. ויברטומות כמו זו המשמשת בפרוטוקול זה נוטות להיות זמינות כבר לחיתוך רקמות קבועות כימית, אך ידרשו הטמעה של אונות הכבד. יש שהראו כי ניתן להשיג חיתוך פרוסות כבד ללא הטמעה ושימוש בוויברטומה דומה¹; עם זאת, מניסיוננו, זה הוכח כקשה לשחזור. כמו כן, בזמן שימוש בסוג זה של ויברטום, חיתוך כבד ללא ג'ל אגרוז תומך בתלת מימד גורם לפרוסות פגומות ולעובי לא אחיד ולכן מגביר את מוות התאים. פרוטוקול זה כולל חיתוך אונת הכבד לרוחב במקום סגיטלית. שלב החיתוך הוא טכניקה שקשה לשלוט בה, ולמיטב ידיעתנו, כיוון החיתוך הוא פרט חשוב שאף פעם לא מתמקדים בו. כיוון האונה במהלך החיתוך יכול להקל באופן דרסטי על תהליך החיתוך תוך הפחתת הלחץ על הכבד. השימוש בהידרוג'ל יכול להיחשב גם כיתרון משופר³⁶.

הקריטריון החשוב הבא הוא הצורך בכמויות גדולות יותר של תרבות כדי להגדיל את הכדאיות. נפחים גבוהים יותר כבר הוצעו כדי לספק יותר חומרים מזינים ולדלל יותר מוצרי חומצות מרה רעילים³⁷. הוספת מערכת דינמית עם טלטול ובשילוב עם שימוש ב-Transwells משפרת את הגישה לחומרים מזינים ופוטנציאל לחמצן לשני הצדדים של הקטע על ידי יצירת זרימה קבועה 18,38,39. השימוש בטרנסוול והיתרון של מערכת דינמית כבר הוכחו בהקשרים שונים, כגון תגובות פרוסת כבד של גידול אנושי²⁸ ולמידול פיברוזיס^26,27. פרוטוקול זה מאשר את יתרונם בהיבט פיזיולוגי רחב יותר.

מדיום E של וויליאמס נבחר בדרך כלל כמדיום תרבית תאים סטנדרטי עבור PCLS^40,41. מדיה משלימה עם גלוקוז וסרום תוארה עם תועלת פוטנציאלית בשמירה על הכדאיות והפונקציונליות של פרוסות⁴². ריכוז הגלוקוז במדיה נע בדרך כלל בין 4 ננומטר ל-36 ננומטר^43,44, אך לא נמצא קונצנזוס לגבי ההשפעה של ריכוז גלוקוז גבוה יותר על הכדאיות או התגובה החמצונית. נטען כי תוספת של אינסולין או דקסמתזון³⁵ משפרת את הכדאיות לטווח הארוך, אך לא הושגה הסכמה מכיוון שתוספת של תוספים כאלה עלולה לגרום לתנגודת משנית לאינסולין עם השפעה במורד הזרם על הכדאיות⁴⁵.

נתונים קודמים מראים שקטעים דקים מ-200 מיקרומטר הופכים קשים לחיתוך הומוגני ויכולים להראות מתח חמצוני, בעוד שפרוסות עבות מ-400 מיקרומטר מראות שיעור חדירה נמוך של חומרים מזינים 18,19,46. כמו כן, בהתבסס על מראה PCLS, השפעות על המרקם וקלות החיתוך, מועדף עובי של 250 מיקרומטר. חדירת החומרים המזינים או החומר הטיפולי לשכבות התאים הפנימיות של ה-PCLS משופרת מאוד גם באמצעות טרנסוולס כחלק מהמערכת הדינמית ^18,32. בניגוד לשימוש בפורס קרומדיק, שיש לו את היתרון בייצור פרוסות בגודל שווה באמצעות שילוב של מערכת חיתוך ליבה, ניתן להתאים את הפרוטוקול על ידי שינוי גודל הפרוסות במידות שוות לאחר החיתוך. עם זאת, יש לקחת בחשבון את השונות בגודל, במשקל או בתכולת החלבון בניסוי ואת השפעתה על סביבת התרבית, ולכן על הכדאיות והסמנים הביולוגיים. מסיבה זו, קריאות בדיקת ה-MTA, תוך שימוש בפרוטוקול זה, מנורמלות למשקל הטרי של כל פרוסה. כמו כן, ניתן להבחין בהטרוגניות עובי, אך למרבה הצער, סביר להניח שהיא תיצפה באמצעות כל סוגי הפורסות. המשתמש יכול לשקול להשליך את הפרוסות הפחות הומוגניות על ידי הערכת ההיבט שלהן, אך זו עדיין נחשבת לאפשרות לא אמינה ונותרה חיסרון של PCTS. המגבלה העיקרית הקשורה למודל זה נותרה הכדאיות היחסית לטווח הקצר, אך היא נופלת במסגרת הזמן שכבר פורסמה^24,31. ניתן לשפר את זמינות החמצן כדי להגביר את הכדאיות הזו. חלק מהפרוטוקולים שפורסמו בעבר דרשו מצע תרבית מורכב וריכוז חמצן גבוה מ-80%, ויסות חילוף החומרים ומתן כדאיות ארוכה יותר 1,24,35,38. קשה גם להשוות ישירות את רמות החמצן המשמשות לחמצון PCLS ורמות החמצן המשמשות לתרבית קווי תאים. הנתונים על השפעות החמצן על הפיזיולוגיה של PCLS מוגבלים מאוד^18,47, וריכוז חמצן גבוה יותר עשוי לשנות את הפתופיזיולוגיה ואת הפנוטיפ באופן משמעותי על ידי יצירת מיני חמצן רעילים⁴⁸.

לסיכום, ניתן לייצר PCLS קצר מועד עם ציוד מוגבל ולהשתמש בו כמודל ex vivo אמין. ארכיטקטורת רקמות היא חיונית בפיזיולוגיה של הכבד, ו-PCLS המאפשר לשמר אותה היא דוגמה נוספת מדוע יש לשקול מודל זה בצורה רווחת יותר. פרוסות חתוכות מדויקות צריכות, אם כן, להפוך לכלי מוכר יותר במחקר מדעי.

אין שום אינטרס מתחרה שצריך לחשוף.

המחברים מודים למירבלה בנדול, סמנתה ריצ'רדס, לואיז פישר, רבקה טאונס ולצוות מהשירותים הביולוגיים של UCL על עזרתם בגידול ותחזוקה של מושבות החיות. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של מועצת המחקר הרפואי הבריטית MR/T008024/1 (JB) ומרכז המחקר הביו-רפואי של בית החולים גרייט אורמונד סטריט (JB). הדעות המובעות הן של המחבר(ים) ולאו דווקא של ה-NHS או ה-NIHR.