Research Article
本研究は、サリドロシドがAMPK/Sirt1/HIF-1α経路を介して、部分的に低酸素HT22細胞に対してミトコンドリア保護効果を発揮するユニークなメカニズムを同定した。
Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohbaの有効成分であるサリドロシド(Sal)は、低酸素条件下での脳細胞の代謝改善とエネルギー供給の増強により、ミトコンドリア保護効果を発揮することがわかっています。しかし、その作用機序は完全には解明されていません。本研究では、塩基(ATP、ADP、AMP)レベルに対するSalの影響を分析するために、最初に高速液体クロマトグラフィーが採用されました。次に、異なる種にわたる細胞および組織における薬物標的の関与を検証および定量化するために広く使用されている分子間相互作用法である細胞熱シフトアッセイ(CETSA)を選択し、AMPK/Sirt1/HIF-1α経路関連タンパク質に対するSalの親和性を確認しました。その結果、Salは低酸素HT22細胞のATPおよびADPレベルを増加させ、AMPレベルを低下させることが明らかになりました。さらに、SalはAMPKα、p-AMPKα、Sirt1、およびHIF-1αタンパク質に安定して結合することを示しました。結論として、SalはAMPK/Sirt1/HIF-1α経路を調節してヌクレオチド含量を調節することにより、ミトコンドリア保護効果を発揮する可能性があります。この研究は、細胞サンプル中のヌクレオチド含有量分析の方法論的参照を提供し、伝統的な漢方薬に由来する化合物の標的の同定と発見に貢献します。
脳は、その高い代謝要求、限られた解糖能力、および酸化的リン酸化への依存性のために、酸素に対して非常に敏感です。その結果、高地で低酸素環境にさらされると、低気圧低酸素性脳損傷(HHBI)1,2を容易に引き起こす可能性があります。疫学研究によると、高地に慣れていない個人が高地に急速に上昇すると、急性高山病の発生率は最大75%に達し、重症の場合の致死率は約1%になることが示されています。さらに、医療がない場合、高地の脳または肺水腫の死亡率は40%にもなる可能性があります3,4。
HHBIは、幅広い臨床症状を呈します。軽度から中等度の症例には、頭痛、めまい、記憶喪失などが含まれます5、重症の場合は認知障害、意識の変化、および潜在的に致命的な結果をもたらす可能性があります5。高地地域におけるHHBIの予防と治療は、医学研究の重要な焦点となっています。予防戦略には、主に高地環境での適応トレーニングが含まれ、これには十分な休息、バランスの取れた食事、適切な栄養、適切な運動が含まれます6,7。さらに、脳細胞を保護し、脳低酸素症を緩和することを目的とした薬理学的介入は、現在のHHBI研究の中心であり続けています。
ミトコンドリアは、細胞内の主要なエネルギー生産センターとして機能し、アデノシン三リン酸(ATP)を合成して細胞のエネルギー需要を満たします。低酸素条件下では、ミトコンドリアのエネルギー産生が減少し、ATPレベルの低下と細胞機能の障害につながります8。低酸素損傷はまた、Ca2+およびpH恒常性のミトコンドリア調節を妨害し、アポトーシスおよび壊死を引き起こす9,10。ミトコンドリアの機能障害と低酸素性脳損傷との間には、相互に補強し合う関係があります。一方では、低酸素症によるミトコンドリアの障害は、細胞のエネルギー代謝をさらに低下させることで酸素欠乏を悪化させ、悪循環を引き起こします。一方、ミトコンドリアの機能障害は細胞内Ca2+レベルを上昇させ、アポトーシスカスケードを活性化して細胞死を引き起こします11。低酸素性脳損傷の根底にあるメカニズムは依然として複雑で、完全には理解されていませんが、複数の研究により、ニューロンのミトコンドリアエネルギー代謝の障害がその病因の重要な要因として特定されています12,13。したがって、ミトコンドリア機能のさらなる調査は、低酸素性脳損傷の潜在的な治療標的に関する貴重な洞察を提供する可能性があります。
サリドロシド(Sal)は、高原植物Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohbaから抽出された有効成分であり、食品健康製品や医薬品に広く使用されています14。Salの分子式はC14H20O7であり、2-(4-ヒドロキシフェニル)-エチルβ-D-グルコピラノシドとしても知られています。それは、抗低酸素症、抗酸化剤、抗疲労剤、抗腫瘍剤、免疫調節剤、抗炎症剤、ならびに心血管および脳血管保護作用15,16,17を含む多様な薬理学的特性を有する。これらの中で、その抗低酸素効果は最もよく文書化されたものの1つです。最近の研究では、マウスのプラトー誘発性脳損傷に対するその予防的および治療的効果の潜在的なメカニズムとして、Salの有意なミトコンドリア保護効果がますます強調されています14,18。しかし、SalがATP、ADP、およびAMPレベルに影響を与える正確な分子メカニズムは、まだ十分に理解されていません。
AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)は、細胞のエネルギー恒常性を維持するための重要なエネルギーセンサーとして機能します。AMPKの活性化はSirtuin 1(Sirt1)を刺激し、細胞内NAD+レベル19の増加につながります。研究によると、Sirt1は低酸素誘導因子1-α(HIF-1α)を調節して、低酸素20に対する細胞応答を調整できることが示されています。これまでの研究で、Salがニューロンのミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を阻害し、HIF-1αを介したミトコンドリアのエネルギープロセスを調節し、ニューロンのアポトーシスを弱め、血液脳関門の完全性を維持し、それによってラットをプラトー誘発性脳損傷から保護することが実証されています14,21。しかし、ATPとその代謝産物であるADPおよびAMPに対するSalの影響は依然として不明です。
これを調べるために、まず高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、これら3つのヌクレオチドのレベルを定量化しました。さらに、2013年に導入された生物物理学的手法で、無傷の細胞におけるリガンド-タンパク質相互作用を研究するために広く用いられている細胞熱シフトアッセイ(CETSA)が利用されました22。この方法は、通常、異なる種にわたる細胞や組織における薬物標的の関与を検証および定量化するために適用されます。具体的には、標的細胞ライセートを薬物とさまざまな温度で一定時間共インキュベートした後、薬物結合タンパク質は熱安定性が向上し、変性や沈殿しにくくなります。次いで、沈殿した未結合タンパク質を遠心分離 により 除去し、続いて上清22のウェスタンブロット分析を通じて薬物-標的相互作用を同定する。Salの潜在的な分子標的を特定するために、CETSAを選択し、AMPK/Sirt1/HIF-1α経路関連タンパク質との結合親和性を評価しました。
この研究で使用された試薬と機器の商業的な詳細は、 資料表に記載されています。
1. 溶液の調製
2. 細胞培養
注:HT22細胞培養およびCoCl2刺激低酸素モデルは、以前の報告21に従って確立された。
3. ヌクレオチド(ATP、ADP、AMP)含量測定法
4. 細胞熱シフトアッセイ(CETSA)
HPLCで検出したATP、ADP、およびAMPの標準曲線は、それぞれY = 7006.5X - 222.99、Y = 5217.3X - 17.796、Y = 9280.1X + 22.749でした(図1A-C)。HPLCで各グループで測定したヌクレオチド含量は、標準曲線を用いて計算しました(図1D-I)。その結果、CoCl2は、対照群と比較して、HT22細胞のATPおよびADPレベルを有意に低下させることがわかった(P < 0.01、図1J、K)。さらに、AMPK阻害剤であるドルソモルフィン(Dor)の投与は、CoCl2治療群と比較してATPおよびADPレベルの顕著な低下をもたらしました(P < 0.01、図1J、K)。しかし、Salによる治療は、CoCl2処理群と比較してATPおよびADPレベルを有意に増加させました(P < 0.05、図1J、K)。
さらなる解析により、CoCl2 処理群では AMP レベルが有意に増加したのに対し、Sal 処理ではこの急増が効果的に制限されることが明らかになりました (P < 0.01、 図 1L)。適切なミトコンドリア機能は、細胞内のATP、ADP、およびAMPの恒常性、および正常な細胞生理機能を維持するために不可欠です。ミトコンドリアの機能状態は、ATP、ADP、およびAMPの変換率とバランスに直接影響します。ミトコンドリアの損傷または機能不全は、ATP合成を損ない、ADPとAMPの変換率を低下させ、それによって細胞のエネルギー供給と代謝バランスを乱す可能性があります。
これらの知見は、SalがATP、ADP、およびAMP変換を調節することにより、HT22細胞の低酸素損傷を緩和する可能性があることを示唆しています。さらに、ミトコンドリア関連タンパク質へのSal結合のCETSA分析では、Sal処理後のAMPKα、p-AMPKα、Sirt1、およびHIF-1αの熱安定性の増加が示されました。これは、Salがこれらのタンパク質と相互作用する可能性があることを示唆しており(図2)、以前の研究21,23,24の結果と一致しています。
データの可用性:
すべての生データが提供されます(補足ファイル1 および 補足ファイル2)。
図1:ヌクレオチド(ATP、ADP、AMP)含有量に対するSalの影響(A-C)ATP(A)、ADP(B)、およびAMP(C)の標準曲線。(D-I)異なる処理群にわたるATP、ADP、およびAMP含有量を決定するための代表的なHPLC曲線。(J-L)さまざまな治療群におけるATP、ADP、およびAMP含有量の統計解析(コントロール、250 μM CoCl2、250 μM CoCl2 + 10 μM Dor、250 μM CoCl2 + 20 μM Sal、および250 μM CoCl2 + 10 μM Dor + 20 μM Sal)。(n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01)この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CETSA法を用いたAMPK/Sirt1/HIF-1α経路関連タンパク質へのSal結合特性の評価 β-アクチン(A)、AMPKα(B)、p-AMPKα(C)、Sirt1(D)、およびHIF-1α(E)タンパク質バンドおよびHT22細胞の発現傾向をCETSA(n = 3)によって評価した。Salとさまざまなタンパク質との結合特性は、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアを使用して、さまざまな温度で分析しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
時間 (分) | 移動相 | |
溶剤A | 溶剤B | |
0 | 2% | 98% |
10 | 2% | 98% |
15 | 70% | 30% |
50 | 70% | 30% |
55 | 2% | 98% |
70 | 2% | 98% |
表1:移動相溶出手順。
補足ファイル1:HPLCでATP、ADP、AMPを検出するための生データ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:CETSAタンパク質バンド。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ミトコンドリアは、HHBI 23,24,25の治療的予防に関与する重要な細胞小器官です。同グループによるこれまでの研究では、SalがAMPK、Sirt1、HIF-1αタンパク質の発現を制御し、ニューロンのミトコンドリア機能を強化し、HHBIから保護することが確認されています21,24。ただし、低酸素細胞のヌクレオチドに対するSalの直接的な影響については、さらなる調査が必要です。さらに、さまざまな温度条件下での化合物とタンパク質の結合電位を評価することは、それらの相互作用を理解するために不可欠です。
これらの側面に対処するために、本研究では、HPLCを使用してHT22細胞のミトコンドリアATP、ADP、およびAMPレベルに対するSalの影響を調べ、ミトコンドリアエネルギー代謝におけるその役割についての直接的な洞察を提供しました。以前の研究18に基づいて、HT22細胞に低酸素を誘導するために250μMのCoCl2 が選択されました。その結果、Salは低酸素HT22細胞のAMP含量を減少させながら、ATPおよびADPレベルを有意に増加させることが示されました(図1)。これらの結果は、グループの以前の知見と組み合わせると、Salが低酸素ニューロンのミトコンドリアに保護効果を発揮することをさらに確認しています。
AMPKは、真核生物の高度に保存されたプロテインキナーゼであり、エネルギー代謝を調節します。細胞のATP、ADP、およびAMPレベルの変化を感知し、さまざまな基質をリン酸化することにより、グルコース代謝、脂肪酸合成、およびミトコンドリア生合成を調整します26。AMPKの活性化は、特に細胞内ATPレベルの低下とAMPレベルの上昇に反応して、エネルギー生産を促進し、エネルギー消費を抑制します27。さらに、AMPKは、グルコアミラーゼをリン酸化し、酵素触媒を変化させ、ホスホアルギニン-アルギニンプールからATPを迅速に生成することにより、ATPの予備力を高めます28。
本研究では、選択的リン酸化AMPK阻害剤であるDorを使用して、塩基がヌクレオチドレベル29に及ぼす影響を調査しました。HPLCを使用して、Dor単独またはSalと組み合わせて曝露されたCoCl2処理HT22細胞のATP、ADP、およびAMPレベルを定量化しました。この知見は、SalがATP/ADP/AMP比を調節し、それによって低酸素症に対する神経保護効果を発揮することを示しています(図1)。確立されたHPLC法は、細胞レベルでヌクレオチドに対する生理活性化合物の影響を直接評価するための直感的でシンプルかつ効率的なアプローチを提供します。
HIF-1αは、低酸素刺激に応答して活性化される転写因子です。低酸素条件下では、HIF-1αの安定性は著しく向上し、細胞質から核に移り、そこでHIF-1β30とヘテロ二量体を形成することができる。このプロセスは、血管新生、グルコース代謝、および解糖に関与する遺伝子の発現を促進する31,32,33。さらに、HIF-1αの安定性は、酸化的リン酸化中のミトコンドリア機能および細胞内O2レベルと高い相関があることが示されている31。しかし、低酸素症によるミトコンドリア機能障害は、細胞内エネルギー供給の不足につながり、その結果、HIF-1α経路が活性化され、低酸素症への細胞適応が調節されます31,32。
Sirt1は、Sirtuinファミリーの一員であり、NAD+依存性脱アセチル化によってHIF-1αタンパク質の安定性を低下させ、それによってその核蓄積を制限する32。低酸素条件下では、細胞内ATPレベルの低下はAMPK活性の増加につながり、これはリン酸化31,32,33を介してHIF-1αおよびその関連タンパク質の細胞内輸送、安定性、および転写活性に影響を与える。さらに、Sirt1とAMPKはHIF-1αとコアクチベーターとの間の相互作用を調節し、それによってその転写活性を調節し、低酸素症33への細胞適応をさらに促進します。低酸素症で損傷した脳細胞では、AMPK、Sirt1、およびHIF-1αが相互作用して細胞内エネルギーの恒常性を維持し、代謝プロセスを調節します。
in vitroで化合物-タンパク質複合体の耐熱性と結合電位を評価するためのシンプルで効率的な方法には、リガンド結合時のタンパク質の安定性を評価する技術が含まれます。化合物とタンパク質の相互作用によりタンパク質の熱安定性が増し、温度による変性に対する感受性が低下し、比較的安定したタンパク質収量が得られることは十分に確立されています。細胞熱シフトアッセイ(CETSA)とウェスタンブロット分析を組み合わせると、正確な結合部位は明らかにされませんが、薬物と標的の相互作用と潜在的なオフターゲット効果を研究するための低コストで効率的なアプローチを提供します22,34。CETSAは、異なる種にわたる細胞や組織における薬物標的の関与を検証および定量するために広く使用されています。
この研究では、CETSAを使用して、Salが細胞レベルでAMPKα、p-AMPKα、Sirt1、およびHIF-1αと相互作用するかどうかを評価しました。加熱処理後、Salはこれらのタンパク質の発現を増加させ、安定したSal-AMPKα、Sal-p-AMPKα、Sal-Sirt1、およびSal-HIF-1α複合体の形成を示唆しています(図2)。これらの知見は、以前の実験結果21,24と一致している。したがって、CETSAウェスタンブロットは、化合物-タンパク質相互作用およびin vitroでの熱安定性の大規模なスクリーニングのための堅牢で効率的なアプローチとして機能します。
HPLCおよびCETSA技術を使用して、ミトコンドリアエネルギー代謝に対するSalの保護メカニズムに関する洞察が得られましたが、特定の制限が残っています。CETSAは、化合物がタンパク質の耐熱性にどのように影響するかについて、アミノ酸レベルでの情報は提供していません。CETSAとイメージング技術を統合して、タンパク質内の化合物結合部位を視覚的に同定し、化合物-タンパク質複合体が熱誘起変性にどのように抵抗するかをより明確に理解できるようになることが、潜在的な進歩となるでしょう。これを達成するためには、さらなる科学的革新と洗練された実験デザインが必要です。さらに、CETSAを局在表面プラズモン共鳴や示差走査蛍光法などの他の分子相互作用技術で補完することで、化合物-タンパク質相互作用のより包括的な分析が可能になるだろう35。
著者は何も開示していません。
この研究は、中国国家自然科学基金会(82274207および82474185)、四川省科学技術部(2024NSFSC1845)、四川省科学技術青年科学基金会(2023NSFSC1776)、寧夏回族自治区の主要研究開発プログラム(2023BEG02012)、中国中医薬協会の2024-2026年青年人材支援プロジェクト(2024-QNRC2-B07)、およびXinglin Scholar Researchの支援を受けた成都TCM大学の推進プロジェクト(XKTD2022013およびQJJJ2024027)。
著者の貢献:
Xiaobo Wang、Yating Zhang、Ya Hou、Rui Li、Xianli Mengがこのプロジェクトを考案しました。Yating Zhang、Ya Hou、Tingting Kuangが実験を行い、データを分析しました。Yating ZhangとHong Jiangが原稿を書きました。Xiaobo WangとXianli Mengが原稿を改訂しました。すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile | Aladdin | A104440 | |
0.22 µm aqueous membrane | Jinteng | JTMF0445 | |
0.22 µm needle type microporous filter membrane | Jinteng | JTSFM013001 | |
0.45 µm organic membrane | Jinteng | JTMF0448 | |
Agilent OpenLab software | Agilent | Version 2.X | |
Antibody-AMPKα | Cell Signaling Technology | #2532 | |
Antibody-HIF-1α | Cell Signaling Technology | #41560 | |
Antibody-p-AMPKα | Cell Signaling Technology | #50081 | |
Antibody-Sirt1 | Cell Signaling Technology | #2028 | |
Antibody-β-actin | Cell Signaling Technology | #4970 | |
BCA protein concentration assay kit | Boster Biological Technology | 17E17B46 | |
Bovine serum albumin | Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SW127-02 | |
Broad-spectrum phosphatase inhibitor (100×) | Boster Biological Technology | AR1183 | |
Chromatographic column | Agilent | SB-C18 | |
CoCl2 | Sigma | 15862 | |
Decolorization shaker | Kylin-Bell | TS-2 | |
Dorsomorphin | MedChemExpress (MCE) | HY-13418A | |
Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | 8121587 | |
Electrophoresis buffer | NCM Biotech | 20230801 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Goat Anti-rabbit IgG H&L (TRITC) | ZenBioScience Co., Ltd. | 511202 | |
GraphPad Prism software | GraphPad software, LLC | Version 9.0.0 | |
High performance liquid chromatography | Agilent | 1260 Infinity II Prime | |
High speed refrigerated centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Legend Micro 17R | |
HRP conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG(H+L) | Boster Biological Technology Co., Ltd. | BA1054 | |
HT22 cells | Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. | JNO-02001 | |
Hypersensitive ECL chemiluminescence kit | NCM Biotech | P10300 | |
Image J software | National Institutes of Health | v1.8.0 | |
Metal heating temperature control instrument | Baiwan Electronictechnology Co., Ltd. | HG221-X3 | |
Methanol | Aladdin | M116118 | |
Nucleotide (ATP, ADP, and AMP) content assay kit | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | BC5114 | |
PAGE gel rapid preparation kit | Biosharp | PL566B-5 | |
Penicillin-streptomycin | NCM Biotech | C125C5 | |
Phosphate buffered saline (1×) | Gibco | 8120485 | |
Pre-stained color protein marker (10-180 kDa) | Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SW176-02 | |
Protein loading buffer (5x) | Boster Biological Technology | AR1112 | |
PVDF (0.45 μm) | Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SW120-01 | |
Rapid membrane transfer solution | Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SW171-02 | |
RIPA lysate | Boster Biological Technology Co., Ltd. | AR0105 | |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | RFS-H0400191102 | |
TBS buffer | NCM Biotech | 23HA0102 | |
Transmembrane buffer | NCM Biotech | 23CA2000 | |
Trypsin (0.25%, 1×) | HyClone | J210045 | |
Tween 20 | Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd. | PM12012 | |
Ultrasonic cell disruption apparatus | Ningbo Xinyi ultrasonic equipment Co., Ltd. | JY92-IIDN | |
Visionworks imaging system | Analytik Jena | UVP ChemStudio | |
Vortex mixer | Kylin-Bell | XW-80A |
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