Method Article
* These authors contributed equally
تم تطوير جسيم نانوي من الببتيد والبولوكسامين ذاتي التجميع (PP-sNp) باستخدام جهاز خلط ميكروفلويديك لتغليف وتسليم الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر . يمكن ل mRNA / PP-sNp الموصوف نقل الخلايا المستزرعة بكفاءة في المختبر.
أظهرت لقاحات الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخة في المختبر إمكانات هائلة في مكافحة جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). يجب تضمين أنظمة التسليم الفعالة والآمنة في لقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب الخصائص الهشة للحمض النووي الريبوزي المرسال. تم تصميم نظام توصيل الجينات النانوية الببتيد بولوكسامين (PP-sNp) ذاتي التجميع خصيصا للتوصيل الرئوي للأحماض النووية ويعرض قدرات واعدة في التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الناجح. هنا ، يتم وصف طريقة محسنة لإعداد PP-sNp لتوضيح كيفية تغليف PP-sNp ل Metridia luciferase (MetLuc) mRNA ونقل الخلايا المستزرعة بنجاح. يتم الحصول على MetLuc-mRNA عن طريق عملية النسخ في المختبر من قالب الحمض النووي الخطي. يتم إنتاج PP-sNp عن طريق خلط الببتيد الاصطناعي / البولوكسامين مع محلول mRNA باستخدام خلاط microfluidic ، مما يسمح بالتجميع الذاتي ل PP-sNp. يتم تقييم شحنة PP-sNp لاحقا عن طريق قياس إمكانات زيتا. وفي الوقت نفسه ، يتم قياس التشتت المتعدد والحجم الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية PP-sNp باستخدام تشتت الضوء الديناميكي. يتم نقل الجسيمات النانوية mRNA / PP-sNp إلى خلايا مستزرعة ، ويتم فحص المواد الفائقة من زراعة الخلايا لنشاط luciferase. تظهر النتائج التمثيلية قدرتها على النقل في المختبر. قد يلقي هذا البروتوكول الضوء على تطوير الجيل التالي من أنظمة توصيل لقاح الحمض النووي الريبوزي المرسال.
وقد تم الإعلان عن التطعيم باعتباره واحدا من أكثر التدخلات الطبية كفاءة للحد من المراضة والوفيات الناجمة عن الأمراض المعدية1. وقد أثبتت أهمية اللقاحات منذ تفشي مرض فيروس كورونا 2019 (كوفيد-19). وعلى عكس المفهوم التقليدي لحقن مسببات الأمراض المعطلة أو الموهنة الحية، تركز أحدث نهج اللقاحات، مثل اللقاحات القائمة على الأحماض النووية، على الحفاظ على الخصائص المناعية لمسببات الأمراض المستهدفة مع تجنب قضايا السلامة المحتملة المرتبطة بالفيروس الميكروبي الكامل التقليدي أو في اللقاحات القائمة على البكتيريا. تظهر كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي (أي الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر ، IVT mRNA) إمكانات وقائية إلى علاجية ضد مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض المعدية والسرطانات 2,3. من حيث المبدأ، ترتبط إمكانات اللقاحات القائمة على الأحماض النووية بإنتاجها وفعاليتها وسلامتها4. يمكن تصنيع هذه اللقاحات بطريقة خالية من الخلايا للسماح بإنتاج فعال من حيث التكلفة وقابل للتطوير وسريع.
يمكن للقاح واحد قائم على الحمض النووي تشفير مستضدات متعددة ، مما يتيح استهداف العديد من المتغيرات الفيروسية أو البكتيريا مع انخفاض عدد التطعيمات وتعزيز الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض المرنة 5,6. إلى جانب ذلك، يمكن أن تحاكي اللقاحات القائمة على الحمض النووي عملية الغزو الطبيعي للفيروس أو العدوى البكتيرية، مما يجلب استجابات مناعية بوساطة الخلايا البائية والخلايا التائية. على عكس بعض الفيروسات أو في اللقاحات القائمة على الحمض النووي ، توفر اللقاحات القائمة على IVT mRNA ميزة كبيرة من حيث السلامة. يمكنهم التعبير بسرعة عن المستضد المطلوب في السيتوسول ولا يتم دمجهم في الجينوم المضيف ، مما يغني عن المخاوف بشأن الطفرات الإدخالية7. يتحلل IVT-mRNA تلقائيا بعد الترجمة الناجحة ، لذلك يمكن التحكم بسهولة في حركية التعبير عن البروتين 8,9. بتحفيز من جائحة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، مكنت الجهود التي تبذلها الشركات/المؤسسات في جميع أنحاء العالم من إطلاق العديد من أنواع اللقاحات في السوق. وتظهر تكنولوجيا اللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT إمكانات كبيرة، وقد أثبتت لأول مرة نجاحها المتوقع سابقا، نظرا لتصميمها السريع وقدرتها المرنة على التكيف مع أي مستضدات مستهدفة في غضون عدة أشهر. لم يفتح نجاح لقاحات IVT mRNA ضد COVID-19 في التطبيقات السريرية حقبة جديدة من البحث والتطوير في لقاح IVT mRNA فحسب ، بل تراكم أيضا خبرة قيمة للتطوير السريع للقاحات الفعالة للتعامل مع تفشي الأمراض المعدية10,11.
على الرغم من الإمكانات الواعدة للقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، فإن التسليم الفعال داخل الخلايا ل IVT mRNA إلى موقع العمل (أي السيتوبلازم) لا يزال يشكل عقبة رئيسية12 ، خاصة بالنسبة لتلك التي تدار عبر الشعب الهوائية4. IVT mRNA هو بطبيعته جزيء غير مستقر مع عمر نصف قصير للغاية (~ 7 h)13 ، مما يجعل IVT mRNA عرضة للغاية للتدهور بواسطة RNase14 في كل مكان. تميل الخلايا الليمفاوية في الجهاز المناعي الفطري إلى ابتلاع الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المعترف به في حالات التطبيق في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، فإن كثافة الشحنة السالبة العالية والوزن الجزيئي الكبير (1 × 104-1 × 106 Da) ل IVT mRNA تضعف نفاذيتها الفعالة عبر الطبقة الثنائية من الدهون الأنيونية للأغشية الخلوية15. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام توصيل مع بعض المواد الحيوية الوظيفية لمنع تدهور جزيئات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT وتسهيل امتصاص الخلايا16.
بصرف النظر عن بعض الحالات الاستثنائية التي تم فيها استخدام الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT العاري مباشرة في التحقيقات في الجسم الحي ، يتم استخدام أنظمة التسليم المختلفة لنقل الحمض النووي الريبي المرسال IVT إلى الموقع العلاجي للعمل17,18. وقد كشفت الدراسات السابقة أنه يتم الكشف عن عدد قليل فقط من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في سيتوسول دون مساعدة من نظام التسليم19. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لتحسين توصيل الحمض النووي الريبي مع الجهود المستمرة في هذا المجال ، بدءا من تكثيف البروتامين إلى تغليف الدهون20. الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) هي الأكثر تقدما سريريا بين مركبات توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال ، كما ثبت من حقيقة أن جميع لقاحات mRNA COVID-19 المعتمدة للاستخدام السريري تستخدم أنظمة توصيل قائمة على LNP21. ومع ذلك، لا يمكن لل LNPs التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الفعال عندما يتم تسليم التركيبات عبر الطريق التنفسي22، مما يحد بشكل ملحوظ من تطبيق هذه التركيبات في تحفيز الاستجابات المناعية المخاطية أو معالجة الأمراض المرتبطة بالرئة مثل التليف الكيسي أو نقص α1-antitrypsin. لذلك ، فإن تطوير نظام تسليم جديد لتسهيل التسليم الفعال ونقل الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في الخلايا المرتبطة بمجرى الهواء مطلوب لحل هذه الحاجة غير الملباة.
وقد تأكد أن نظام إيصال الجسيمات النانوية ذاتية التجميع من الببتيد والبولوكسامين (PP-sNp) يمكن أن يتوسط في النقل الفعال للأحماض النووية في الجهاز التنفسي للفئران23. يعتمد PP-sNp نهج تصميم معياري متعدد الوظائف ، والذي يمكنه دمج وحدات وظيفية مختلفة في الجسيمات النانوية للفحص السريع والتحسين23. يمكن أن تتفاعل الببتيدات الاصطناعية والبوليمرات المشتركة للكتلة البرمائية المحايدة كهربائيا (البولوكسامين) داخل PP-sNp تلقائيا مع IVT mRNA لتوليد جسيمات نانوية موزعة بشكل موحد مع بنية مدمجة وسطح أملس23. يمكن ل PP-sNp تحسين تأثير نقل الجينات لجزيئات IVT mRNA في الخلايا المستزرعة والجهاز التنفسي للفئران23. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد PP-sNp يحتوي على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT الذي يشفر Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (الشكل 1). يتم استخدام الخلط السريع والمتحكم فيه عبر جهاز خلط الموائع الدقيقة ، والذي يستخدم تصميم خلط العظام المتعرجة المتداخلة ، في هذا البروتوكول. الإجراء سهل التنفيذ ويسمح بتوليد PP-sNp بأحجام أكثر اتساقا. الهدف العام من إنتاج PP-sNp باستخدام خلاط الموائع الدقيقة هو إنشاء PP-sNp لتعقيد mRNA بطريقة يتم التحكم فيها جيدا ، مما يسمح بنقل الخلايا بكفاءة وقابلية للتكرار في المختبر. يصف هذا البروتوكول إعداد وتجميع وتوصيف PP-sNp المحتوي على MetLuc-mRNA.
1. النسخ في المختبر من الحمض النووي الريبي المرسال المعدل كيميائيا
ملاحظة: يلزم استخدام أنابيب خالية من النوكليز ، والكواشف ، والأواني الزجاجية ، ونصائح الماصة ، وما إلى ذلك ، لأن RNases موجودة في كل مكان في البيئة ، مثل المحاليل المختبرية ، وأسطح الأدوات ، والشعر ، والجلد ، والغبار ، وما إلى ذلك. نظف أسطح المقاعد والماصات جيدا قبل الاستخدام ، وارتد قفازات لتجنب تلوث RNase.
2. توليد IVT mRNA / PP-sNp
3. قياس القطر الهيدروديناميكي وتعدد التشتت ل IVT-mRNA / PP-sNp
4. إعداد الخلايا للنقل
5. نقل الخلايا المستزرعة
6. تحليل فعالية نقل الخلايا باستخدام فحص Metridia luciferase (MetLuc)
تم هضم البلازميد المؤتلف لإنتاج قالب الحمض النووي الخطي (الشكل 2A). باستخدام البروتوكول الموصوف ، يمكن لمجموعة النسخ T7 في المختبر إنتاج ما يصل إلى 80-120 ميكروغرام من MetLuc-mRNA غير المغطى لكل تفاعل 20 ميكرولتر و 50-60 ميكروغرام من MetLuc-mRNA المغطى لكل تفاعل 100 ميكرولتر. عند تحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي ، يجب أن يظهر MetLuc-mRNA السليم بجودة عالية نطاقا واحدا وواضحا ، كما هو موضح في الشكل 2B. يمكن أن تؤدي الملوثات التي يتم إدخالها في التفاعل من قالب الحمض النووي إلى تدهور الحمض النووي الريبي وانخفاض الغلة.
تم إعداد PP-sNp الذي يحتوي على MetLuc-mRNA (MetLuc-mRNA / PP-sNp) باستخدام طريقة خلط الموائع الدقيقة (الشكل 1). ويبين الجدول 1 البيانات المتعلقة بالتوصيف الفيزيائي الكيميائي ل MetLuc-mRNA/PP-sNp كأمثلة. يمكن اعتبار نصف القطر الهيدروديناميكي ل MetLuc-mRNA / PP-sNp صحيحا إذا كان يتراوح بين 70-100 نانومتر. إلى جانب ذلك ، يجب أن يكون PDI الخاص ب PP-sNp ثابتا ويفضل أن يكون أقل من 0.2 ، ولكن يتم قبول قيم PDI التي تصل إلى 0.3 تقريبا.
بعد دمج MetLuc-mRNA بنجاح في PP-sNp ، يمكن احتضان التركيبة بخلايا 16HBE وخط خلية تغصني (DC2.4) ، ويمكن الإشارة إلى كفاءة نقل MetLuc-mRNA من خلال نشاط luciferase داخل supernatant زراعة الخلايا 24 ساعة بعد النقل. الشكل 3 هو مثال نموذجي على النقل الناجح ل MetLuc-mRNA/PP-sNp. يمكن ملاحظة بوضوح أن الخلايا المنقولة باستخدام MetLuc-mRNA / PP-sNp أظهرت تعبيرا أعلى بكثير عن luciferase مقارنة بتلك المنقولة باستخدام وصي النقل القائم على الدهون (LP) المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) ، MetLuc-mRNA العاري (التحكم السلبي) ، PBS (التحكم الفارغ) ، أو محلول T704-sPep المختلط (التحكم الوهمي) في خلايا 16HBE. كما أظهر MetLuc-mRNA / PP-sNp تعبيرا أعلى عن luciferase مقارنة ب LP. وتشير البيانات إلى أن نظام إيصال PP-sNp مهم لحماية الحمض النووي الريبوزي المرسال (MetLuc-mRNA) من التحلل ولتعزيز كفاءة نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال (MetLuc-mRNA) الخارجي. لذلك ، فإن أنظمة التسليم مثل PP-sNp ضرورية بشكل عام لدراسات نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لسير العمل بأكمله ل IVT mRNA / PP-sNp. يرتبط قالب الحمض النووي بالبلازميد عن طريق بناء البلازميد المؤتلف. يتم تجميع قالب الحمض النووي الخطي باستخدام هضم إنزيم التقييد. يتم تصنيع الحمض النووي الريبوزي المرسال المنسوخ في المختبر (IVT mRNA) وتغطيته من قالب الحمض النووي الخطي. يحتوي محلول T704-sPep على T704 والببتيد الاصطناعي (sPep) ، بينما يحتوي محلول IVT mRNA على MetLuc-mRNA. يتم خلط المحاليل المختلطة IVT mRNA و T704-sPep باستخدام خلاط ميكروفلويديك ، والذي يشكل MetLuc-mRNA / PP-sNp. بعد ذلك ، يتم إجراء توصيف MetLuc-mRNA / PP-sNp لتحديد حجم الجسيمات وتعدد التشتت باستخدام Zetasizer. يتم نقل خلايا 16HBE باستخدام MetLuc-mRNA / PP-sNp ، ويتم قياس نشاط luciferase داخل supernatant لتقييم كفاءة النقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إنتاج MetLuc-mRNA. (A) يحتوي قالب الحمض النووي على مروج بوليميراز T7 ، ومنطقة 5'untraslated (UTR) ، وإطار قراءة مفتوح (ORF) من MetLuc ، و 3'UTR ، وذيول poly (A). (ب) الكشف عن الرحلان الكهربائي. يشير السهم الأبيض إلى البلازميد المؤتلف. يشير السهم الأصفر إلى متجه PUC57. يشير السهم الأحمر إلى قالب الحمض النووي للنسخ المختبري ل MetLuc-mRNA. يشير السهم الأخضر إلى MetLuc-mRNA غير المقيد. يشير السهم الأزرق إلى MetLuc-mRNA المغطى بالسقف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كفاءة نقل MetLuc-mRNA/PP-sNp في خلايا 16HBE وDC2.4. تم نقل MetLuc-mRNA باستخدام PP-sNp في (A) خلايا 16HBE و (B) خط خلية تغصني (DC2.4). كان التركيز النهائي ل MetLuc-mRNA 0.02 ميكروغرام / ميكرولتر ، وكان تركيز sPep 0.139 ميكروغرام / ميكرولتر ، وكان تركيز T704 2 ميكروغرام / ميكرولتر في PP-sNp. تم اعتماد ريجنت النقل التجاري القائم على الدهون (LP) كعنصر تحكم إيجابي. تم قياس نشاط luciferase 24 ساعة بعد النقل. تم اعتماد العينة المعالجة بواسطة PBS كعنصر تحكم فارغ. تم اعتماد الحل المختلط T704-sPep كعنصر تحكم وهمي. تم تحليل الفروق الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب (ns p ≥ 0.05 ، * p < 0.05 ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
IVT mRNA | N/P (sPep) | ث/ث (T704) | الحجم (نانومتر) | بي دي آي | زيتا |
17.5 نانوغرام/ميكرولتر | 5 | 100 | 85.12 ± 9.40 | 0.20 ± 0.07 | -13.07 ± 0.47 |
الجدول 1: بيانات التوصيف الفيزيائي الكيميائي ل MetLuc-mRNA/PP-sNp.
الشكل التكميلي 1: إعداد جهاز الموائع الدقيقة المعد داخليا المستخدم في الدراسة الحالية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: تسلسل ترميز قالب الحمض النووي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
لا يسمح البروتوكول الموصوف هنا فقط بالإنتاج الفعال من حيث التكلفة والسريع لتركيبات لقاح IVT mRNA ذات الخصائص المحددة ، ولكنه يوفر أيضا إمكانية تخصيص تركيبة PP-sNp وفقا لأغراض علاجية محددة ، مثل العلاج الجيني. من أجل ضمان التوليد الناجح ل IVT mRNA / PP-sNp ، يقترح إيلاء المزيد من الاهتمام لبعض الخطوات الحاسمة. عند العمل مع الحمض النووي الريبوزي المرسال ، تذكر دائما أنه يجب الحفاظ على الظروف الخالية من الحمض النووي الريبوزي المرسال طوال العملية لأن الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT حساس للغاية فيما يتعلق بالتحلل بواسطة RNAase ، حتى لو تم إعداد الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT مع التعديل الكيميائي. وفي الوقت نفسه ، يجب أيضا ضمان بيئة خالية من RNase عند تخزين التركيبات. يوصى بتخزين IVT mRNA / PP-sNp عند 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع. تظهر النتائج المقدمة أن المياه الخالية من النوكليز فعالة في تشكيل PP-sNp بنجاح مع كفاءة نقل عالية. يمكن استخدام المخازن المؤقتة الأخرى ، مثل PBS والمياه المالحة و OptiMEM وما إلى ذلك ، إذا رغبت في ذلك. يوصى بإجراء عمليات النقل في المختبر باستخدام IVT mRNA / PP-sNp في وسط OptiMEM من أجل ضمان بقاء الخلايا المستزرعة. إذا تم اختيار مخزن مؤقت آخر بدلا من الماء الخالي من النوكليز لإعداد التركيبة ، فمن المهم استخدام IVT mRNA بتركيز منخفض (أقل من 100 نانوغرام / مل) ؛ خلاف ذلك ، تميل الجسيمات النانوية إلى الترسب ، مما يؤدي بدوره إلى جعل تركيبة غير صالحة. سبب هذه الظاهرة هو moiety الكاتيوني داخل الببتيد الاصطناعي. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤدي كثافة الشحنة الإيجابية القوية للجسيم النانوي إلى زعزعة استقرار غشاء الخلية ، وبالتالي إحداث سمية خلوية كبيرة. ومع ذلك ، فقد ثبت في الدراسة السابقة أن الشحنة الموجبة داخل PP-sNp ضرورية في التوسط في امتصاص الخلايا الفعالة IVT mRNA ، والهروب من الإندوسوم ، والنقل الناجح23. ونتيجة لذلك ، من المهم ضبط الشحنة الموجبة داخل PP-sNp لتحقيق توازن دقيق من حيث الكفاءة والسمية.
يمكن تطبيق البروتوكول المقدم على مختلف التركيبات المستندة إلى PP-sNp مع بعض التغييرات في المعلمات. من أجل إيصال اللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، تعد الخصائص الفيزيائية الحيوية مثل حجم الجسيمات ومؤشر التشتت المتعدد حاسمة لكفاءة النقل والمناعة للجسيمات النانوية المحضرة26. يسمح حجم جسيمات IVT mRNA / PP-sNp في مقياس النانومتر بالنقل الفعال عبر الحواجز الفسيولوجية ، وبالتالي فهو مهم للتطبيقات اللاحقة في الجسم الحي. وقد أفيد أن LNPs في نطاق حجم 60-150 نانومتر تنتج استجابات مناعية قوية في الرئيسيات غير البشرية26. من ناحية أخرى ، لم تتمكن الجسيمات النانوية كبيرة الحجم (على سبيل المثال ، 400-1000 نانومتر) من التغلب على حاجز مخاط مجرى الهواء عند تطبيقها على الولادة الرئوية لأنه ، كما كشفت التحقيقات السابقة ، يتراوح متوسط التباعد الشبكي ثلاثي الأبعاد لمسام شبكة مخاط مجرى الهواء من حوالي 60-300 نانومتر27,28. إذا لم يتم تحقيق الحجم المطلوب أو كفاءة النقل ، فإن بعض النصائح لبدء استكشاف الأخطاء وإصلاحها تشمل ضبط كمية البولوكسامين أو مكونات الببتيد الاصطناعية المستخدمة. كشفت الدراسة السابقة أن المعلمات الإضافية ، مثل كمية IVT mRNA المستخدمة في النقل ، ووقت الحضانة ، وأنواع الخلايا وكثافة الخلايا المستزرعة ، يمكن أن تؤثر أيضا بشكل كبير على نتيجة النقل23. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الاستهداف المتباين داخل PP-sNp يسمح بالتسليم المحدد للحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المغلف إلى الخلايا التي تعرض المستقبلات ذات الصلة ، فقد يكون من الضروري الاستعاضة عن روابط الاستهداف البديلة إذا تم نقل الخلايا المستهدفة بأنواع أخرى بدلا من الخلايا المرتبطة بمجرى الهواء. وعموما، لا يزال من الممكن تحسين البروتوكول برؤية أكثر تفصيلا ومزيد من الفحص.
وبالنظر إلى أن IVT mRNA/PP-sNp الأصلي يتم إعداده في البداية عن طريق الخلط اليدوي المباشر، فإن قدرات المشغل تلعب دورا مهما في التحكم في جودة التركيبة. قد تؤدي التعديلات في عملية خلط الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT مع مكونات PP-sNp إلى جزيئات دقيقة كبيرة بدلا من جزيئات نانوية الحجم. الخطوة الأكثر صعوبة هي خلط mRNA والببتيد الاصطناعي ، والذي يجب القيام به بطريقة خاضعة للرقابة. من أجل تحسين قابلية التكاثر بين دفعات مختلفة من تركيبة IVT mRNA / PP-sNp ، تم اعتماد خلاط microfluidic لأن الفحص منخفض الحجم والسرعة العالية والاستنساخ هي ميزات مهمة لاستخدام طريقة الموائع الدقيقة29. أظهرت هذه الطريقة قابلية جيدة للتكاثر ، مع عدم وجود تأثير كبير على حجم الجسيمات ولا كفاءة النقل التي لوحظت بين الدفعات المختلفة. هذا معيار أساسي للقاحات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ليتم تطبيقها في التطبيقات السريرية. على وجه الخصوص ، يجب ألا يتجاوز خلاط الموائع الدقيقة الحد الأقصى لعدد المستخدمين (الموصى به من قبل الشركة المصنعة) ويجب تغييره بين التركيبات ذات التراكيب المختلفة.
يمكن نظريا استخدام بروتوكول نسخ IVT mRNA الموصوف في هذا البروتوكول لإعداد أي بروتين / مستضد مراسل ذي أهمية. تم تطبيق Metridia luciferase (MetLuc) على وجه التحديد في هذه الدراسة لأنه يحمل مزايا فريدة. من السهل إجراء فحص نشاط MetLuc بحساسية عالية لأن MetLuc يمكن أن ينتج إشارة مضيئة حيوية مكثفة ، ويمكن إفرازه مباشرة في وسط الخلية ، وبالتالي تجنب الحاجة إلى تحلل الخلايا. من المهم ملاحظة أن تعبير MetLuc في الخلايا المستزرعة يمكن أن يتأثر بالعديد من المعلمات (على سبيل المثال ، أرقام الخلايا المختلفة لكل بئر وأخطاء السحب ، وما إلى ذلك) بخلاف وظائف MetLuc-mRNA نفسها.
على الرغم من أن البروتوكول الحالي قد تم إنشاؤه لتقديم لقاح IVT mRNA ، إلا أنه يمكن تنفيذه أيضا للقاحات أو العلاجات التي تستند إلى أنواع أخرى من الأحماض النووية ، مثل الحمض النووي البلازميدي (pDNA). يمكن تكييف هذه العملية مع الببتيد الاصطناعي والحمض النووي وتغيرات مكونات البولوكسامين لتطوير PP-sNp معين لمختلف المؤشرات السريرية. في الواقع ، تم تحقيق التكامل الجيني لجين منظم نقل التليف الكيسي الخارجي عبر الغشاء (CFTR) في الأنسجة الظهارية التنفسية للفئران القاضية CFTR باستخدام أداة التعديل الجيني Sleeping Beauty التي قدمها PP-sNp23 بنجاح. فيما يتعلق بالتطبيقات العلاجية ، يمكن استخدام تركيبات IVT mRNA / PP-sNp كهباء جوي باستخدام أجهزة إرذار محددة لعلاج الأمراض الرئوية ، مثل نقص α1-antitrypsin أو التليف الكيسي30. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي تحسين تركيبات IVT mRNA / PP-sNp للرذاذ وتخصيصها ، حيث يمكن أن يكون الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT الهباء الجوي غير فعال بسبب قوة القص الناتجة عن البخاخات والطبيعة الهشة ل IVT mRNA30. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يكون البروتوكول قابلا للتطوير إلى أحجام أكبر باستخدام أجهزة خلط الموائع الدقيقة المختلفة ، مثل أجهزة خلط T-junction وحتى مضخات خلط نفاثات الاصطدام31,32.
باختصار ، يقدم البروتوكول المفصل هنا طريقة قابلة للتكرار لصياغة IVT mRNA في نظام توصيل PP-sNp ، بالإضافة إلى النقل الموثوق اللاحق في الخلايا المستزرعة. تضمن الطريقة الموصوفة نهجا سهلا وسهلا لإنتاج IVT mRNA / PP-sNp باستخدام خلاط ميكروفلويديك. يمكن لاحقا تطبيق التركيبات المحضرة ذات أحجام الجسيمات الصغيرة ومؤشر التشتت المتعدد المنخفض على الخلايا المستزرعة بأمان وكفاءة. سيمكن هذا البروتوكول نظام التسليم القائم على PP-sNp من أن يصبح متاحا للمجتمع الأكاديمي لتصميم لقاحات أو علاجات جديدة قائمة على IVT mRNA مع تجنب جميع العيوب المذكورة. مع الملامح المرنة ل PP-sNp ، من المتوقع تحقيق العديد من التطبيقات المستقبلية باستخدام PP-sNp لإنتاج علاجات متميزة لمعالجة الأمراض المختلفة.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، المنحة رقم 82041045 و 82173764) ، والمشروع الرئيسي لدراسة نظام تكنولوجيا الإمراض والوقاية من الأوبئة (2021YFC2302500) من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين ، ومشروع تشونغتشينغ للمواهب: المواهب الشابة الاستثنائية (CQYC202005027) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (cstc2021jcyj-msxmX0136). المؤلفون ممتنون للدكتور شياويان دينغ لقياس القطر الهيدروديناميكي (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد (PDI).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BamHI | Takara | 1010 | |
cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
DNA sequence | Genescript | ||
Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
KpnI | Takara | 1068 | |
LP | Beyotime | C0533 | |
Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved