Method Article
Bu protokol, fareler ve sıçanlar için, optimize edilmiş bir anestezik rejim ve ince ayarlı endoskopik manipülasyon teknikleri kullanılarak solunum ve yutma sırasında gırtlağın yakından, engelsiz video görüntülemesine izin veren bir seri transoral laringoskopi yaklaşımını tanımlar.
Gırtlak, memelilerde nefes alma, yutma ve ses çıkarma olmak üzere üç temel işlevi olan önemli bir organdır. Nefes almada zorluk (nefes darlığı), yutma bozukluğu (disfaji) ve/veya ses bozukluğu (disfoni) ile sonuçlanan çok çeşitli bozuklukların laringeal fonksiyonu bozduğu bilinmektedir. Disfaji, özellikle, aspirasyon pnömonisine ve buna bağlı morbiditeye, tekrarlayan hastaneye yatışa ve erken mortaliteye yol açabilir. Bu ciddi sonuçlara rağmen, laringeal disfonksiyon için mevcut tedaviler büyük ölçüde, ne yazık ki tipik olarak normal laringeal fonksiyonu geri getirmeyen cerrahi ve davranışsal müdahaleleri hedeflemektedir ve bu nedenle yenilikçi çözümlere olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır.
Bu boşluğu doldurmak için, murin (yani fare ve sıçan) modellerinde laringeal disfonksiyonu araştırmak için deneysel bir endoskopik yaklaşım geliştiriyoruz. Bununla birlikte, kemirgenlerde endoskopi, mevcut endoskop teknolojisine göre küçük boyutları, üst solunum yolundaki anatomik farklılıklar ve gırtlağa en iyi şekilde erişmek için anestezi gerekliliği nedeniyle oldukça zordur. Burada, farelerde ve sıçanlarda laringeal hareketin yakından, engelsiz video görüntülemesine izin veren yeni bir transoral laringoskopi yaklaşımını açıklıyoruz. Protokoldeki kritik adımlar arasında hassas anestezi yönetimi (yutmayı ortadan kaldıran ve/veya solunum sıkıntısına bağlı mortalite riskini ortadan kaldıran aşırı dozu önlemek için) ve endoskopun mikromanipülatör kontrolü (sonraki miktar tayini için tek bir araştırmacı tarafından laringeal hareketin stabil video kaydı için) yer alır.
Daha da önemlisi, protokol, çeşitli patolojik durumların özellikle laringeal fonksiyon üzerindeki etkisini incelemek için aynı hayvanlarda zaman içinde gerçekleştirilebilir. Bu protokolün yeni bir avantajı, yutma sırasında hava yolu korumasını görselleştirme yeteneğidir, bu da glottis görünümünü engelleyen laringeal giriş üzerindeki epiglottik inversiyon nedeniyle insanlarda mümkün değildir. Bu nedenle kemirgenler, normal laringeal fonksiyonu etkili bir şekilde eski haline getirmek için tedavileri keşfetmek amacıyla normal ve patolojik laringeal hava yolu koruma mekanizmalarını spesifik olarak araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar.
Gırtlak, boğazdaki solunum ve sindirim yollarının kesiştiği noktada bulunan kıkırdaklı bir organdır ve burada yiyecek ve sıvıya (yani yutma sırasında) karşı havanın akışını ve yönünü (yani nefes alma ve ses çıkarma sırasında) hassas bir şekilde kontrol etmek için bir valving mekanizması olarak işlev görür. Konjenital (örneğin, laringomalazi, subglottik stenoz), neoplastik (örneğin, laringeal papillomatoz, skuamöz hücreli karsinom), nörolojik (örneğin, idiyopatik laringeal felç, inme, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz) ve iyatrojenik (örneğin, baş veya boyun cerrahisi sırasında kasıtsız yaralanma) dahil olmak üzere gırtlağı etkileyen çok çeşitli bozuklukların bilinmektedir. Etiyolojiden bağımsız olarak, laringeal disfonksiyon tipik olarak bir kişinin ekonomik ve sosyal refahını olumsuz yönde etkileyen dispne (nefes almada zorluk), disfoni (ses bozukluğu) ve disfaji (yutma bozukluğu) semptom üçlüsü ile sonuçlanır 1,2,3,4.
Ayrıca, disfaji, özellikle tıbbi olarak kırılgan bireylerde, aspirasyon pnömonisine (tam olarak kapalı olmayan bir gırtlaktan akciğerlere kaçan gıda veya sıvı nedeniyle) ve buna bağlı morbiditeye, tekrarlayan hastaneye yatışa ve erken mortaliteye yol açabilir 5,6. Bu ciddi sonuçlara rağmen, laringeal disfonksiyon için mevcut tedaviler büyük ölçüde normal laringeal fonksiyonu tipik olarak geri getirmeyen cerrahi ve davranışsal müdahaleleri hedeflemektedir 1,2,7,8,9,10, bu nedenle yenilikçi çözümlere olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu amaca yönelik olarak, murin (yani fare ve sıçan) modellerinde laringeal disfonksiyonu araştırmak için deneysel bir endoskopik yaklaşım geliştiriyoruz.
İnsan tıbbında, laringeal disfonksiyonun değerlendirilmesi için altın standart, laringoskopi olarak adlandırılan endoskopik görselleştirmedir11,12. Tipik olarak, gırtlağı, özellikle vokal kıvrımları ve bitişik supraglottik ve subglottik laringeal yapıları incelemek için burundan esnek bir endoskop geçirilir. Ağız boşluğu yoluyla gırtlağı görselleştirmek için sert bir endoskop da kullanılabilir. Her iki yaklaşım da laringeal anatominin kaba incelemesine izin verir ve solunum, fonasyon ve öksürük ve laringeal adduktor refleksi gibi çeşitli hava yolu koruyucu refleksleri sırasında laringeal hareketliliği ve fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilir 13,14,15,16. Bununla birlikte, yutma sırasında, gırtlak, gırtlak girişini örtmek için ters döndüğü için epiglot tarafından tamamen gizlenir ve onu yutulan gıda / sıvı bolus yolundan korur. Sonuç olarak, yutma sırasında laringeal hareketin doğrudan görselleştirilmesi insanlarda mümkün değildir ve bu nedenle diğer tanısal yaklaşımlar (örneğin, floroskopi, elektromiyografi, elektroglottografi) kullanılarak dolaylı olarak çıkarılmalıdır.
Bu makale, fareler ve sıçanlar için hafif anestezi altında yutma sırasında solunumun yakın çekimine, engelsiz görüntülenmesine ve hava yolu korumasına izin veren yenilikçi bir laringoskopi protokolünü açıklamaktadır. Protokol, anestezi uygulanmış kemirgeni prosedür boyunca hareketsiz hale getirmek için özel bir platformla birlikte ticari olarak temin edilebilen çeşitli endoskopi sistemleriyle uyumludur. Daha da önemlisi, her laboratuvarın mevcut kaynaklarına ve araştırma gündemine bağlı olarak endoskopi platformlarının çok sayıda tasarımı/konfigürasyonu gerçekten mümkündür. Buradaki amacımız, araştırmacıların araştırmaları bağlamında düşünmeleri için rehberlik sağlamaktır. Ayrıca, bu laringoskopi protokolünün, laringeal disfonksiyon ve rejenerasyon anlayışımıza yeni bakış açıları kazandırabilecek çok sayıda objektif veriye nasıl yol açabileceğini göstermeyi amaçlıyoruz.
Bu murin laringoskopi protokolünde özetlenen tüm adımların birleşik etkisi, iyatrojenik yaralanmaya, hastalığın ilerlemesine ve / veya hava yolu korumasına göre tedavi müdahalesine yanıt olarak zaman içinde laringeal disfonksiyonu tespit etmek ve karakterize etmek için aynı hayvanlarda tekrarlanabilen yetişkin murin larinksinin minimal invaziv bir incelemesi ile sonuçlanır. Dikkat edilmesi gereken, bu protokol seslendirme ile ilgili gırtlak fonksiyonunu değerlendirmez.
Murin laringoskopi protokolü, onaylanmış bir Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolünü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Yönergelerini takip eder. 100'den fazla yetişkin C57BL / 6J faresi ve 50'den fazla yetişkin Sprague Dawley sıçanı, her iki tür için de yaklaşık olarak eşit cinsiyette ve 6 hafta-12 aylık olmak üzere geliştirilmiştir. Daha genç / daha küçük kemirgenlere adaptasyon için ek protokol geliştirme gereklidir. Hayvanlar grup halinde barındırıldı (cinsiyete ve çöpe bağlı olarak kafes başına dört fare veya iki sıçan). Standart vivaryum koşulları, ortam sıcaklığının (20-26 °C), nemin (%30-%70) ve standart 12 saatlik ışık döngüsünün sıkı bir şekilde düzenlenmesine sahip statik kafesi içeriyordu. Tüm hayvanlara haftalık kafes değişimlerinde taze zenginleştirme malzemeleri (örneğin, kulübe / boru, diş tedavileri, yuva) verildi. Aşağıda tarif edildiği gibi anestezi öncesi kısa (4-6 saate kadar) gıda kısıtlaması dışında yiyecek ve suya sınırsız erişim sağlandı. Veteriner ve araştırma personeli hayvanları her gün izledi.
1. Yutmayı ortadan kaldırmayan hayvan anestezisi
2. Gırtlağı görselleştirmek için endoskopun transoral geçişi
3. Solunum sırasında gırtlak hareketinin yakın çekim, engelsiz video kaydı ve uyarılmış yutma
NOT: Solunum, yutma ve yutma-solunum koordinasyonunun senkron elektrofizyolojik kaydı da bir seçenektir.
4. Anestezi iyileşmesi
5. Nefes alma ve yutma sırasında laringeal hareketin objektif olarak ölçülmesi
Bu murin laringoskopi protokolünün başarılı kullanımı, Şekil 6'da gösterildiği gibi, sağlıklı ve hastalık koşulları altında spontan solunum ve uyarılmış yutma sırasında gırtlağın yakından görüntülenmesine neden olur. Ayrıca, bu protokol zaman içinde laringeal fonksiyon / disfonksiyonun araştırılmasına izin vermek için aynı kemirgenlerde birden çok kez tekrarlanabilir. Şekil 7'de gösterildiği gibi, RLN yaralanmasının bir sıçan cerrahi modelinde spontan iyileşme paternini araştırmak için bu laringoskopi protokolünü 4 aylık bir zaman dilimi boyunca 6 kez başarıyla tekrarladık (veriler henüz yayınlanmadı). KX yerine ISO anestezisi kullanma girişimleri, önceki deneylerimizde anlatıldığı gibi, yutmayı uyandırmak için sağ üst laringeal sinirin doğrudan elektriksel stimülasyonu uygulanan kemirgenlerde yutmanın neredeyse ortadan kalkmasına neden oldu (Şekil 8) 31,32. Bu, %2 gibi düşük bir ISO ile meydana geldi; ISO'nun bu seviyenin altına düşürülmesi, spontan hareketin geri dönüşüyle sonuçlandı ve bu nedenle önlendi. ISO'nun bu kafa karıştırıcı etkisi, bu protokolün başarılı bir şekilde kullanılması için anestezi seçiminin önemini vurgulamaktadır.
Endoskopik görüntü kalitesi iyi olduğunda, Şekil 9'da gösterildiği gibi, solunum ve yutmanın temsili video klipleri hareket izleme yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Özel gırtlak izleme yazılımımız tarafından otomatik olarak oluşturulan temsili sonuç ölçümleri Tablo 1'de listelenmiştir. Solunum ve yutma ile ilgili birkaç sonuç önleminin, aynı temsili sıçanda başlangıç ve RLN sonrası transeksiyon arasında belirgin şekilde farklı olduğunu unutmayın. Solunum sırasındaki glottal açılar başlangıç ve RLN sonrası transeksiyon arasında benzerken, solunum sırasında sağ / sol laringeal hareket genliği (yani, ortalama hareket aralığı oranı veya MMRR) ve frekans (açma-kapama döngüsü oranı veya OCCR) oranları transeksiyon sonrası daha düşüktü. Benzer şekilde, RLN transeksiyonunu takiben yutma süresi daha kısaydı.
Senkron elektrofizyolojik kayıtlar (ör., solunum pnömogramı ve genioglossus EMG) elde edilirse, laringoskopi verileriyle korelasyon için birkaç ek objektif sonuç ölçütü ölçülebilir. Araştırmamızı ilgilendiren elektrofizyoloji temelli sonuç ölçümlerinin örnekleri Şekil 10'da özetlenmiştir. Şu anda bu sonuç ölçümlerinin otomatik olarak ölçülmesi için algoritmalar geliştiriyoruz.
Şekil 1: Murin endoskopi platformu. (A) Özel murin endoskopi platformunun yandan ve (B) üstten görünümleri, temel bileşenler etiketlenmiş olarak gösterilmiştir. Isıtma yastığının altındaki masa tablasının boyutunun ayarlanabilir olduğunu unutmayın. Burada, daha küçük bir ısıtma yastığı (gösterilmemiştir) barındıran fare boyutunda bir masa tablasını ortaya çıkarmak için kolayca çıkarılabilen, farelerle kullanılan masa üstü ve ısıtma yastığı boyutları gösterilmiştir. Özel bir adaptör, bir endoskopu platform tabanına bağlı bir mikromanipülatöre sabitler. Bu stratejik tasarım, endoskopi prosedürü sırasında kasıtsız/kontrolsüz endoskop hareketinden hayvanın yaralanma riski olmadan tüm platformun bir ünite olarak hareket ettirilmesine izin verir. Mikromanipülatör, endoskop ucunun x (sol/sağ), y (ileri/geri), z (yukarı/aşağı) dahil olmak üzere birçok yönde brüt ve mikro ayarlamalarının yanı sıra y (eğim) ve z (sapma) etrafında dönmesine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murin laringoskopi için otoskop ve özel kılıf. (A) Ticari bir otoskopun demonte bileşenleri ve murin laringoskopi için adaptörlü özel paslanmaz çelik kılıf. (B) Monte edildiğinde, otoskop ucu metal kılıfın 1 mm ötesine uzanır, ancak gerektiğinde 5 mm'ye kadar ayarlanabilir. Bu stratejik tasarım, dar otoskop ucunun kemirgenin gırtlak girişine ilerlemesini kolaylaştırırken, biraz daha büyük çaplı (2,4 mm) metal kılıf, nefes alma ve yutma sırasında tüm gırtlağın en iyi şekilde görselleştirilmesi için velum ve epiglotu yeterince açık tutar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Endoskopi sırasında minimal invaziv elektrofizyolojik kayıt. Kemirgenin karnına bir solunum sensörü bantlanır; deriden dilin genioglossus kasına bir EMG elektrodu yerleştirilir; ve kalçaya deri altından bir toprak elektrodu yerleştirilir. Bu yaklaşım, yutma, nefes alma ve yutma-solunum koordinasyonunun endoskopi ile senkronize olarak araştırılmasına olanak sağlar. Elektrot yerleştirme yerlerinde cildin tıraş edildiğini ve temizlendiğini/dezenfekte edildiğini unutmayın. Sarı yıldız = elektrofizyolojik kayıtlarda sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için elektrot kurşun bağlantı bölgelerinin etrafına sarılmış alüminyum folyo. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gırtlağı uzaktan görüntülemek için transoral endoskopi. (A) Dili hafif bir parmak tutuşu ile nazikçe geri çektikten sonra, endoskop dil ile merkezi kesici dişler arasına kırmızı yıldız konumunda (yani, endoskop şaftı ile anatomik hizalamayı korumak için geri çekilen dille aynı taraf) yerleştirilir. (B) Endoskop sert damağı geçtiğinde, (C) epiglot ve velum görünür hale gelir. (D) Glotisi görselleştirmek için, velum ve epiglot, velumun yüzeyine (resim C'deki siyah ana hatlı yıldızın konumunda) basınç uygulanarak "ayrılmalıdır". Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Gırtlağın yakın çekim endoskopik görüntülemesi. (A) Endoskop ucu, ayrılmış velum ve epiglot (siyah çerçeveli yıldızın bulunduğu yerde) arasındaki mikromanipülatör kontrolü ile nazikçe yönlendirilir. Endoskop ilerledikçe, (B) gırtlak görünür hale gelir ve glottal boşluk (sarı yıldız) mikromanipülatör ayarlamaları ile kamera görüş alanında ortalanır. (C) Endoskopun devam eden mikromanipülatör ilerlemesi, gırtlağın tüm ventral-dorsal ve lateral boyutlarının görüntülenmesine neden olur. Kısaltmalar: VC = gırtlağın ventral komissürü (yani, vokal kıvrımlar arasındaki ventral birleşme noktası); DC = gırtlağın dorsal komissürü (yani, aritenoidler arasındaki dorsal birleşme noktası); VF'ler = ses telleri; A = aritenoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Solunum ve yutma sırasında murin gırtlağının görselleştirilmesi. Yetişkin bir Sprague Dawley sıçanında (AC) sağ RLN'nin cerrahi transeksiyonundan önce ve (DF) sonra nefes alma ve yutma sırasında laringeal hareketi gösteren temsili endoskopik görüntüler. Larinksin dinlenme duruşunun, RLN yaralanmasını takiben (A) taban çizgisine kıyasla değişmeden (D) göründüğünü unutmayın. (B,E) Maksimum inspirasyon sırasında, RLN yaralanmasını takiben laringeal asimetri belirginleşir. Başlangıçta gösterildiği gibi glottal boşluğu (sarı yıldız) genişletmek için her iki aritenoidin de kaçırılması yerine, (E) ipsilateral (sağ) aritenoid (siyah yıldız) ve vokal kıvrım, RLN hasarını takiben solunum döngüsü boyunca hareketsiz görünür. Yutma sırasında sağ taraflı asimetri de belirgindir. (C) Başlangıçta, aritenoidler yutma sırasında orta hatta yaklaşır ve vokal kıvrımlar arasında küçük bir ventral glottal boşluk bırakır. (F) RLN yaralanmasını takiben, ipsilateral aritenoid ve VF, yutma sırasında paradoksal olarak (yani, etkilenmeyen tarafla aynı yönde, kırmızı ok) hareket eder ve ventralden posterior laringeal komissürlere uzanan geniş bir glottal boşluk (sarı yıldız) bırakır. (F) Bu görüntü, iyatrojenik RLN hasarının bir sıçan modelinde bozulmuş laringeal hava yolu korumasının doğrudan kanıtını sağlar. (C,F) Gırtlağın yutma sırasında endoskopa daha yakın hareket ettiğini, epiglottis ve velumun artık kamera görüş alanında görünmediğini unutmayın. Siyah oklar normal gırtlak hareketinin yönünü gösterirken, kırmızı ok paradoksal hareketi gösterir; sarı yıldız = glottal boşluk. Kısaltmalar: VF'ler = ses telleri; A = aritenoid; RLN = tekrarlayan laringeal sinir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: İyatrojenik RLN hasarının bir sıçan modelinde solunum ve yutma sırasında laringeal disfonksiyonu araştırmak için seri laringoskopi kullanma. 4 aylık bir süre boyunca sekiz yetişkin Sprague-Dawley sıçanında laringeal hareket mesafesini ve yönünü tahmin etmek için -2 ile +2 arasında değişen bir Likert ölçeği kullanıldı. Başlangıç laringoskopisinden sonra, sıçanlara sağ RLN'yi kesmek için cerrahi bir prosedür uygulandı, ardından ameliyattan 1 hafta sonra seri laringoskopi, daha sonra ameliyattan 1 ila 4 ay sonra 1 aylık aralıklarla tekrar yapıldı. Sekiz sıçanın tümü prosedürden kurtuldu, böylece seri laringoskopi için anestezi rejimimizin etkinliğini gösterdi. (A) Videolar, solunum sırasında gırtlak hareketini ölçmek için gerçek zamanlı ve kare kare / yavaş harekette analiz edildi, burada 0 = hareket yok, 1 = biraz hareket ve 2 = etkilenen (sağ) tarafın sağlam (sol) tarafa kıyasla normal hareket mesafesi. (B) Yutma için, glottal boşluk boyutu şu şekilde tahmin edildi: 0 = glottal boşluk boyutunda azalma yok (ör., laringeal hava yolu koruması yok), 1 = bir miktar glottal boşluk azalması (ör., eksik hava yolu koruması) ve 2 = vokal kıvrımlar arasında sadece küçük bir ventral glottal boşluk ile aritenoidlerin tam addüksiyonu (yani, tam hava yolu koruması). Nefes alma ve yutma için negatif değerler, beklenenden zıt yönde gırtlak hareketini gösterir (ör., paradoksal). RLN yaralanmasını takiben hem nefes almanın hem de yutmanın olumsuz etkilendiğini unutmayın. İlginç bir şekilde, laringeal hava yolu koruması 1 WPS zaman noktasında (paradoksal da olsa) tamamlandı, ancak daha sonra daha da kötüleşti, koruma yokluğundan eksik korumaya kadar değişti. Kısaltmalar: WPS = ameliyat sonrası hafta; MPS = ameliyattan sonraki aylar; RLN = tekrarlayan laringeal sinir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Kemirgenlerde ISO tarafından inhibe edilen yutma. (A) ISO anestezisi altında laringoskopi yapılan bir kemirgenin, bu amaç için tasarlanmış özel ISO dağıtım sisteminin etiketli bileşenleriyle görüntüsü. Bu yenilikçi yaklaşımın önemli bir uyarısı, personelin ISO'ya maruz kalma riskidir. (B) Bu yaklaşımın bir başka dezavantajı, yutmanın ISO tarafından bastırılmasıdır. Bu yan yana kutu grafiği ve dağılım grafiği, yutmayı uyandırmak için sağ üst laringeal sinirin doğrudan elektriksel stimülasyonu uygulanan farelerde (grup başına 9) ISO ile KX anestezisinin etkisini karşılaştıran yayınlanmamış verileri özetlemektedir. Burada gösterilen, 20 s'lik 20 Hz stimülasyon ve ardından 10 s'lik dinlenmeden oluşan 5 dakikalık bir deneme sırasında uyandırılan kırlangıçların sayısıdır. KX ile karşılaştırıldığında, ISO ile anestezi uygulanan farelerde (% 2 kadar düşük) önemli ölçüde daha az yutma vardı (p < 0.001, bağımsız örnekler t-testi) ve yutma 4/9 farede bile kaldırıldı. Benzer bulgular hem fareler hem de sıçanlarla yapılan cerrahi olmayan deneylerden ortaya çıkmıştır (veriler gösterilmemiştir). Kısaltmalar: ISO = izofluran; KX = ketamin-ksilazin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: İzleme yazılımı kullanılarak murin laringeal hareketinin objektif olarak ölçülmesi. Şekil 6'daki Şekil 6'daki aynı görüntüler, RLN yaralanması sonrası ve başlangıçta bir sıçanda nefes almaya karşı yutmayı gösteren aynı görüntüler, özel yazılımımız tarafından eklenen laringeal hareket izleme çizgileri ile burada gösterilmektedir. Kalan video karelerinde sol (mavi çizgi) ve sağ (kırmızı çizgi) laringeal hareketin otomatik olarak izlenmesi için aritenoidlerin medial sınırı boyunca ilk video karesine izleme çizgileri manuel olarak eklendi. Özel yazılımımız tarafından 2,5 sn video kliplerden oluşturulan ilgili laringeal hareket grafikleri, (A, D) laringeal dinlenme duruşuna, (B, E) inspirasyon sırasında maksimum glottal boşluğa ve (C, F) yutma sırasında glottik kapanmaya karşılık gelen etiketlerle bireysel sol/sağ harekete karşı türetilmiş global laringeal hareketi gösterir. RLN yaralanması sonrası sağ tarafın (kırmızı oklar) paradoksal hareketine ve karşılık gelen türetilmiş küresel hareket grafiğinde gösterilen büyük glottal boşluğa dikkat edin. Temsili sonuç ölçütleri Tablo 1'de yer almaktadır. Kısaltma: RLN = tekrarlayan laringeal sinir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Laringoskopi verileriyle korelasyon için elektrofizyoloji temelli sonuç ölçümleri. (A) Sağlıklı bir sıçan için solunum ve yutma sırasındaki elektrofizyoloji kayıtları gösterilmiştir. Üst pencere bir solunum izi (kemirgenin karnına bantlanmış bir solunum sensöründen), orta pencere genioglossus kasındaki EMG aktivitesini ve alt pencere filtrelenmiş EMG aktivitesini gösterir. Yutma olayları sırasında kesintiye uğrayan nefes alma sırasındaki ritmik solunum ve EMG paternine dikkat edin. Yutma olayları, solunum izindeki pürüzlü hareket (siyah oklar) ve hemen ardından kısa apne (kırmızı yıldız) ile kolayca tespit edilir. (B) A'daki kesikli dikdörtgen kutunun genişletilmiş bir penceresi, elektrofizyolojik kayıtlardan birkaç sonuç ölçümünün nasıl nicelleştirildiğini gösterir. (A) İnspirasyon sırasında (sarı paneller), solunum izinin (üst pencere), iki elektrofizyolojik yöntem arasındaki zamansal farklılıkları vurgulayan EMG patlama aktivitesine kıyasla ~ 150 ms (mavi çift ok) geciktiğini unutmayın. Temsili elektrofizyolojiye dayalı sonuç ölçümleri şunları içerir: 1) inspiratuar faz süresi (i); 2) solunumlar arası aralık (ii, solunum ve filtrelenmiş EMG kanalları yoluyla hesaplanır); eğrinin altındaki kırlangıç alanı (III); ve yutma apnesi (iv; solunum ve filtrelenmiş EMG kanalları aracılığıyla hesaplanır). Kısaltma: EMG = elektromiyografi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Sonuç Ölçütleri | Taban çizgisi | RLN Sonrası Yaralanma | |
Nefes | Minimum glottal açı (derece) | 34.5 | 34.6 |
Maksimum glottal açı (derece) | 52.9 | 49.9 | |
Ortalama glottal açı (derece) | 43.7 | 42.2 | |
Ortalama hareket aralığı oranı (MMRR) | 1.26 | 0.29 | |
Açık kapalı döngü oranı (OCCR) | 1 | 0.11 | |
Yutma | Laringeal addüksiyon (ms) | 200 | 233 |
Glottik kapanma süresi (ms) | 67 | 0 | |
Laringeal abdüksiyon (ms) | 233 | 67 | |
Toplam yutma süresi (ms) | 500 | 300 |
Tablo 1: Özel gırtlak izleme yazılımı tarafından otomatik olarak oluşturulan temsili sonuç ölçümleri. Kısaltma: RLN = tekrarlayan laringeal sinir.
Laringoskopi platformu hakkında ek metin. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Solunum ve yutma sırasında gırtlak hareketinin yakından görüntülenmesine izin veren, tekrarlanabilir bir murine özgü laringoskopi protokolünü başarıyla geliştirdik. Daha da önemlisi, protokol, çeşitli patolojik durumların özellikle laringeal fonksiyon üzerindeki etkisini incelemek için aynı hayvanlarda zaman içinde gerçekleştirilebilir. Bu protokol son on yılda geliştirildi ve yol boyunca önemli değişiklikler ve sorun giderme işlemlerinden geçti. Anestezi optimizasyonu, yutmayı ortadan kaldıran ve/veya solunum sıkıntısına bağlı mortalite riski taşıyan aşırı dozu önlemek için üstesinden gelinmesi gereken en büyük zorluktu. Başlangıçta ISO'yu kullandık, bu da yutmanın kaldırılması, aşırı tükürük üretimi (endoskopik görselleştirmeyi engelleyen) ve personelin maruz kalma riski ile sonuçlandı ve bu prosedür için ISO kullanımına karşı ciddi kontrendikasyonlar olarak kabul edildi. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılan bir kemirgen anestezik 33,34,35 olduğu için KX'e odaklandık.
Bu amaç için potansiyel olarak uygun olan diğer endoskoplara kıyasla daha küçük şaft çapı (1.1 mm) nedeniyle sialendoskop kullanırken14,22,29,30,36 numaralı farelerle protokol geliştirmeye başladık. Daha da önemlisi, sialendoskopun başlangıçta laringeal adduktör refleksini14 uyandırmak/incelemek için hava darbeleri vermek için kullandığımız bir çalışma kanalı vardır. Bununla birlikte, laringeal adduktör refleksinin farelerde ve sıçanlarda, büyük olasılıkla genel anestezi ve / veya tekrarlanan hava darbesi dağıtımından mukozal kurumaya sekonder laringeal / faringeal duyu reseptörlerinin inaktivasyonu nedeniyle sıklıkla azaldığını / ortadan kalktığını bulduk. Çalışmalarımızda laringeal adduktor refleksi güvenilir bir şekilde uyandırılamasa da, yutma şaşırtıcı bir şekilde devam etti ve laringeal girişte / yakınında mekanik stimülasyon ile kolayca uyarıldı. Bu nedenle odağımızı mekanik olarak uyarılmış yutmanın endoskopik analizine çevirdik.
Bu süreçte, kırılmaya meyilli olan ve laringeal hareketi güvenilir bir şekilde görselleştirmek ve analiz etmek için yetersiz aydınlatma ve görüntü çözünürlüğüne sahip yarı sert sialendoskopu terk ettik. Çok sayıda alternatif endoskopun araştırılmasında, sonuçta hem farelerde hem de sıçanlarda laringoskopi için uygun olan spesifik bir otoskopa karar verdik. Deneyimlerimize dayanarak, murin laringoskopi için uygun bir endoskop seçerken en önemli özellik, yüksek kaliteli video çekimi için yeterince parlak ışığı iletebilen 2 mm'den daha küçük bir şaft çapıdır . Daha büyük çaplı endoskoplar, laringeal hareketin yakından görüntülenmesi için farelerde ve sıçanlarda laringeal girişten kolayca geçemez. Otoskoplar, mükemmel ışık geçirgenliği, sert / dayanıklı tasarımları ve diğer endoskop tiplerine (örneğin, sialendoskop, esnek endoskop) kıyasla nispeten düşük maliyetleri nedeniyle bu amaç için özellikle idealdir. Ek olarak, endoskopun manuel kontrolü sabit ellerde bir seçenek iken, mikromanipülatör kontrolünü bu laringoskopi protokolünün önemli bir özelliği olarak görüyoruz. Daha da önemlisi, endoskopun mikromanipülatör kontrolü, sonraki miktar tayini için tek bir araştırmacı tarafından laringeal hareketin stabil video kaydına izin verir. Bugüne kadar, bu otoskop tabanlı protokolü yetişkin fareler ve sıçanlarla başarıyla kullandık. Daha genç / daha küçük kemirgenlerle laringoskopi yapmak için daha küçük çaplı endoskop seçeneklerinin gerekli olacağından şüpheleniyoruz.
Laringoskopi protokolümüzün yeni bir avantajı, kemirgenlerde yutma sırasında hava yolu korumasını görselleştirme yeteneğidir, bu da glotsisin görünmesini engelleyen laringeal giriş üzerindeki epiglottik inversiyon nedeniyle insanlarda mümkün değildir. Bu nedenle kemirgenler, normal laringeal fonksiyonu etkili bir şekilde eski haline getirmek için tedavileri keşfetmek amacıyla normal ve patolojik laringeal hava yolu koruma mekanizmalarını spesifik olarak araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu murin laringoskopi protokolünün bu benzersiz yeteneği, şimdiye kadar geliştirdiğimiz/tanımladığımız çok sayıda kemirgen disfaji modelinde aspirasyonu tespit edemeyen videofloroskopiye (yani, disfaji için diğer "altın standart" test) göre büyük bir avantajdır 30,36,37,38,39,40. Bu negatif VFSS bazlı bulgu, transoral endoskopi yaklaşımımızla görülebilen kemirgenlerin üst solunum yolundaki çeşitli anatomik farklılıklara bağlanabilir. İlk olarak, kemirgen gırtlağı, nazofarenkste yüksekte konumlandırılır ve burada sıkıca bağlanmış bir epiglott ve çıkmaz bir ağız boşluğu oluşturan velum ile gizlenir. Ek olarak, istirahat halindeki epiglot, velumun üzerindeki mukozal bir kılıfın altında sıkışır. Bu anatomik konfigürasyon, kemirgenlerin zorunlu burun solunumu yapmasına neden olur; Bu nedenle, uyanık kemirgenlerde ağızdan nefes almak, solunum morbiditesinin bir işaretidir. Bununla birlikte, sağlıklı kemirgenlerde yutma sırasında, epiglot mukozal kılıftan dışarı kayar ve gırtlak nazofarenksin içine doğru yükselirken, bolus yolunun dışına çıkarken gırtlak girişi üzerinde ters döner. Bu dinamik üst solunum yolu olayları, sağlıklı kemirgenlerde ve laringeal disfonksiyon modellerinde laringoskopi yoluyla doğrudan görüntülenebilir / değerlendirilebilir.
Daha da önemlisi, VFSS testi sırasında aspirasyon yapılmamasına rağmen, kemirgen modellerinin (ör., iyatrojenik RLN yaralanması) gerçekten de disfaji ile ilişkili aspirasyonu olan insan hastalara translasyonel olan laringoskopi yoluyla laringeal hava yolu korumasının bozulduğuna dair kanıt gösterdiğini gösterdik. Bu nedenle, bu murin laringoskopi protokolü, şu anda hala zor olan hava yolu koruma mekanizmalarını ve hedefe yönelik tedavileri spesifik olarak araştırmak için yararlı bir translasyonel platform sağlar. Bu hedefe ulaşmak, yutmayı uyandırmak için laringeal/faringeal mukozanın kalibre edilmemiş mekanik stimülasyonunu sağlamak için endoskop ucunu kullanan mevcut yöntemimizin daha da geliştirilmesini/optimizasyonunu gerektirecektir. Üstün laringeal sinirin32,41 doğrudan elektriksel stimülasyonu ve laringeal/faringeal mukozanın kimyasal (örneğin, sitrik asit42) stimülasyonu dahil olmak üzere, yutmayı uyarmak için daha titiz, hassas kontrollü yöntemler şu anda laboratuvarımızda araştırılmaktadır. Bu protokolün ek bir sınırlaması, uyanık ve doğal beslenme davranışını taklit etmeyen kemirgenlerin sırtüstü konumlandırılmasıdır. İlk protokol geliştirme, sınırlı mandibular hareketle sonuçlanan ve aynı zamanda ağız boşluğunun görünürlüğünü sınırlayan ve endoskop geçişini belirgin şekilde engelleyen yüzüstü pozisyonlamayı içeriyordu. Hipofarenkste bulunan endoskop ucu ile gırtlağı belli bir mesafeden görüntülemek mümkündür; Bununla birlikte, bu yaklaşım tipik olarak gırtlağın daha iyi görselleştirilmesi için epiglottis, velum ve/veya dilin manuel olarak geri çekilmesini gerektirir. Bu amaç için çeşitli özel manuel geri çekme cihazları ürettik (örneğin, modifiye otoskop spekulusu, modifiye pipet uçları). Bununla birlikte, gırtlağın bazı kısımları tipik olarak görünmez kalır ve geri çekme cihazları gırtlak hareketini kısıtlayabilir, bu da işlev bozukluğu ile karıştırılabilir. Ayrıca, endoskopi platformunun son ek özellikleri (örneğin, Trendelenburg eğimi ve çene hareketine uyum sağlamak için kulak çubukları arasında bir kesik) yüzüstü pozisyonda kemirgenlerin test edilmesini kolaylaştırabilir. Kulak çubukları ve ek ısı, laringoskopi protokolünün gerekli özellikleridir. Kulak bantları, endoskopun transoral manipülasyonu sırasında başın hareket etmesini önler. Homeotermik bir ısıtma sistemi, stabil anesteziyi teşvik etmek ve prosedür boyunca hipotermiyi önlemek için vücut ısısını 36 °C ile 38 °C arasında tutar.
Artık kemirgenlerde nefes alma ve yutma sırasında gırtlak hareketini güvenilir bir şekilde videoya kaydetmek için metodoloji mevcut olduğundan, yüksek verimli miktar tayini önemli bir sonraki adımdır. Bu nedenle, özel yazılımımız tarafından oluşturulan hangi sonuç ölçümünün sağlıklı durumları hastalık koşullarından en iyi şekilde ayırt edebileceğini belirlemek ve aynı zamanda doğal hastalık ilerlemesine veya tedavi müdahalelerine yanıt olarak zaman içindeki değişiklikleri tespit etmek için video analiz çalışmalarımız devam etmektedir. En iyi adaylar, video görüntüleme analizini hızlandırmak için sonraki makine öğrenimi yaklaşımlarının odak noktası olacaktır. Daha da önemlisi, yetersiz görüntü kalitesi durumları (örneğin, yetersiz aydınlatma, görüş alanı dışındaki anatomik yapılar, gırtlak yapılarını gizleyen aşırı salgılar vb.) şu anda gırtlak takibi için uygun değildir; Ancak, bu engel gelecekte makine öğrenimi araçları aracılığıyla aşılabilir. O zamana kadar, gırtlak izleme analizi kriterlerini karşılayan video kare dizilerinin dikkatli bir şekilde seçilmesi (protokol bölüm 5'te açıklandığı gibi) çok önemlidir.
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu çalışma kısmen iki NIH hibesi ile finanse edildi: 1) Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden (NHLBI) çoklu PI (TL ve NN) R01 hibesi (HL153612) ve 2) Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü'nden (NIDCD) bir R03 hibesi (TL, DC0110895). Özel gırtlak hareket izleme yazılımı geliştirmemiz kısmen Coulter Vakfı hibesi (TL ve Filiz Bunyak) tarafından finanse edildi. Kate Osman, Chloe Baker, Kennedy Hoelscher ve Zola Stephenson'a laboratuvar kemirgenlerimize mükemmel bakım sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, MU Fizik Makine Atölyesi'nden Roderic, Schlotzhauer ve Cheston Callais'e, özel endoskopi platformumuzun tasarımı, girdisi ve üretimi ve araştırma ihtiyaçlarımızı karşılamak için ticari endoskoplar ve mikromanipülatörlerde stratejik değişiklikler için teşekkür ederiz. Özel gırtlak hareket izleme yazılımımız, Dr. Filiz Bunyak ve Dr. Ali Hamad (MÜ Elektrik Mühendisliği ve Bilgisayar Bilimleri Bölümü) ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Ayrıca otoskop seçimi konusunda rehberlik sağladığı için Karl Storz Endoskopi'den Jim Marnatti'ye teşekkür ederiz. Son olarak, mevcut murin laringoskopi protokolümüzün geliştirilmesine katkıları sağlayan Lever Lab'daki çok sayıda önceki öğrenciyi/kursiyeri tanımak istiyoruz: Marlena Szewczyk, Cameron Hinkel, Abigail Rovnak, Bridget Hopewell, Leslie Shock, Ian Deninger, Chandler Haxton, Murphy Mastin ve Daniel Shu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Atipamezole | Zoetis | Antisedan; 5 mg/mL | Parsippany-Troy Hills, NJ |
Bioamplifier | Warner Instrument Corp. | DP-304 | Hamden, CT |
Concentric EMG needle electrode | Chalgren Enterprises, Inc. | 231-025-24TP; 25 mm x 0.3 mm/30 G | Gilroy, CA |
Cotton tipped applicator (tapered) | Puritan Medical Products | REF 25-826 5W | Guilford, ME |
Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 8/30 | Colorado Springs, CO |
DC Temperature Control System - for endoscopy platform | FHC, Inc. | 40-90-8D | Bowdoin, ME |
Electrophysiology recording software | ADInstruments | LabChart 8 with video capture module | Colorado Springs, CO |
Endoscope monitor | Karl Storz Endoscopy-America | Storz Tele Pack X monitor | El Segundo, CA |
Glycopyrrolate | Piramal Critical Care | NDC 66794-204-02; 0.2 mg/mL | Bethlehem, PA |
Ground electrode | Consolidated Neuro Supply, Inc. | 27 gauge stainless steel, #S43-438 | Loveland, OH |
Isoflurane induction chamber | Braintree Scientific, Inc. | Gas Anesthetizing Box - Red | Braintree, MA |
Ketamine hydrochloride | Covetrus North America | NDC 11695-0703-1, 100 mg/mL | Dublin, OH |
Metal spatula to decouple epiglottis and velum | Fine Science Tools | Item No. 10091-12; | Foster City, CA |
Micro-brush to remove food/secretions from oral cavity | Safeco Dental Supply | REF 285-0023, 1.5 mm | Buffalo Grove, IL |
Mouse-size heating pad for endoscopy platform | FHC, Inc. | 40-90-2-07 – 5 x 12.5 cm Heating Pad | Bowdoin, ME |
Ophthalmic ointment (sterile) | Allergan, Inc. | Refresh Lacri-lube | Irvine, CA |
Otoscope | Karl Storz | REF 1232AA | El Segundo, CA |
Pneumogram Sensor | BIOPAC Systems, Inc. | RX110 | Goleta, CA |
Pulse oximetry - Vetcorder Pro Veterinary Monitor | Sentier HC, LLC | Part No. 710-1750 | Waukesha, WI |
Rat-size heating pad for endoscopy platform | FHC, Inc. | 40-90-2 – 12.5X25cm Heating Pad | Bowdoin, ME |
Sterile needles for drug injections | Becton, Dickinson and Company | REF 305110, 26 G x 3/8 inch, PrecisionGlide | Franklin Lakes, NJ |
Sterile syringes for drug injections | Becton, Dickinson and Company | REF 309628; 1 mL, Luer-Lok tip | Franklin Lakes, NJ |
Surgical drape to cover induction cage for dark environment | Covidien LP | Argyle Surgical Drape Material, Single Ply | Minneapolis, MN |
Surgical tape to secure pneumograph sensor to abdomen | 3M Health Care | #1527-0, 1/2 inch | St. Paul, MN |
Transparent blanket for thermoregulation | The Glad Products Company | Press’n Seal Cling Film | Oakland, CA |
Video editing software | Pinnacle Systems, Inc. | Pinnacle Studio, v24 | Mountain View, CA |
Water circulating heating pad - for anesthesia induction/recovery station | Adroit Medical Systems | HTP-1500 Heat Therapy Pump | Loudon, TN |
Xylazine | Vet One | NDC 13985-701-10; Anased, 100 mg/mL | Boise, ID |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır