Laringoscopia murina minimamente invasiva per l'imaging ravvicinato del movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione

Questo protocollo descrive un approccio di laringoscopia transorale seriale per topi e ratti che consente l'imaging video ravvicinato e senza ostacoli della laringe durante la respirazione e la deglutizione utilizzando un regime anestetico ottimizzato e tecniche di manipolazione endoscopica finemente sintonizzate.

La laringe è un organo essenziale nei mammiferi con tre funzioni primarie: respirazione, deglutizione e vocalizzazione. È noto che un'ampia gamma di disturbi compromette la funzione laringea, con conseguente difficoltà respiratoria (dispnea), compromissione della deglutizione (disfagia) e/o compromissione della voce (disfonia). La disfagia, in particolare, può portare a polmonite da aspirazione e morbilità associata, ospedalizzazione ricorrente e mortalità precoce. Nonostante queste gravi conseguenze, i trattamenti esistenti per la disfunzione laringea sono in gran parte finalizzati a interventi chirurgici e comportamentali che purtroppo in genere non ripristinano la normale funzione laringea, evidenziando così l'urgente necessità di soluzioni innovative.

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un approccio endoscopico sperimentale per studiare la disfunzione laringea in modelli murini (cioè di topo e ratto). Tuttavia, l'endoscopia nei roditori è piuttosto impegnativa a causa delle loro dimensioni ridotte rispetto all'attuale tecnologia degli endoscopi, delle differenze anatomiche nelle vie aeree superiori e della necessità dell'anestesia di accedere in modo ottimale alla laringe. Qui, descriviamo un nuovo approccio alla laringoscopia transorale che consente l'imaging video ravvicinato e senza ostacoli del movimento laringeo in topi e ratti. Le fasi critiche del protocollo includono una gestione precisa dell'anestesia (per prevenire il sovradosaggio che abolisce la deglutizione e/o rischia la mortalità correlata al distress respiratorio) e il controllo con micromanipolatore dell'endoscopio (per la registrazione video stabile del movimento laringeo da parte di un singolo ricercatore per la successiva quantificazione).

È importante sottolineare che il protocollo può essere eseguito nel tempo negli stessi animali per studiare l'impatto di varie condizioni patologiche in particolare sulla funzione laringea. Un nuovo vantaggio di questo protocollo è la capacità di visualizzare la protezione delle vie aeree durante la deglutizione, che non è possibile nell'uomo a causa dell'inversione epiglottotica sopra l'ingresso laringeo che ostruisce la glottide alla vista. I roditori offrono quindi un'opportunità unica per studiare in modo specifico i meccanismi di protezione delle vie aeree laringee normali rispetto a quelle patologiche allo scopo ultimo di scoprire trattamenti per ripristinare efficacemente la normale funzione laringea.

La laringe è un organo cartilagineo situato all'intersezione delle vie respiratorie e digestive della gola, dove funziona come un meccanismo valvolare per controllare con precisione il flusso e la direzione dell'aria (cioè durante la respirazione e la vocalizzazione) rispetto al cibo e al liquido (cioè durante la deglutizione). È noto che una vasta gamma di disturbi colpisce la laringe, tra cui congeniti (ad esempio, laringomalacia, stenosi sottoglottica), neoplastici (ad esempio, papillomatosi laringea, carcinoma a cellule squamose), neurologici (ad esempio, paralisi laringea idiopatica, ictus, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica) e iatrogeni (ad esempio, lesioni involontarie durante un intervento chirurgico alla testa o al collo). Indipendentemente dall'eziologia, la disfunzione laringea si traduce tipicamente in una triade di sintomi di dispnea (difficoltà respiratoria), disfonia (compromissione della voce) e disfagia (compromissione della deglutizione) che hanno un impatto negativo sul benessere economico e sociale di una persona 1,2,3,4.

Inoltre, la disfagia, in particolare in individui fragili dal punto di vista medico, può portare a polmonite da aspirazione (dovuta alla fuoriuscita di cibo o liquidi attraverso una laringe non completamente chiusa nei polmoni) e morbilità associata, ospedalizzazione ricorrente e mortalità precoce ^5,6. Nonostante queste gravi conseguenze, i trattamenti esistenti per la disfunzione laringea sono in gran parte mirati a interventi chirurgici e comportamentali che in genere non ripristinano la normale funzione laringea 1,2,7,8,9,10, evidenziando così l'urgente necessità di soluzioni innovative. A questo scopo, abbiamo sviluppato un approccio endoscopico sperimentale per studiare la disfunzione laringea in modelli murini (cioè murini e ratti).

In medicina umana, il gold standard per la valutazione della disfunzione laringea è la visualizzazione endoscopica, nota come laringoscopia^11,12. Tipicamente, un endoscopio flessibile viene fatto passare attraverso il naso per esaminare la laringe, in particolare le corde vocali e le strutture laringee sopraglottiche e sottoglottiche adiacenti. Un endoscopio rigido può anche essere utilizzato per visualizzare la laringe attraverso la cavità orale. Entrambi gli approcci consentono l'esame macroscopico dell'anatomia laringea e possono essere utilizzati per valutare la mobilità e la funzione laringea durante la respirazione, la fonazione e una varietà di riflessi protettivi delle vie aeree come la tosse e il riflesso adduttore laringeo 13,14,15,16. Durante la deglutizione, tuttavia, la laringe è completamente oscurata dall'epiglottide poiché si inverte per coprire l'ingresso laringeo, proteggendolo dal percorso del bolo di cibo/liquido che viene inghiottito. Di conseguenza, la visualizzazione diretta del movimento laringeo durante la deglutizione non è possibile nell'uomo e deve quindi essere indirettamente dedotta utilizzando altri approcci diagnostici (ad esempio, fluoroscopia, elettromiografia, elettroglottografia).

Questo articolo descrive un innovativo protocollo di laringoscopia per topi e ratti che consente l'imaging ravvicinato e senza ostacoli della respirazione e la protezione delle vie aeree durante la deglutizione in anestesia leggera. Il protocollo è compatibile con una varietà di sistemi endoscopici disponibili in commercio in combinazione con una piattaforma personalizzata per immobilizzare il roditore anestetizzato durante tutta la procedura. È importante sottolineare che sono effettivamente possibili numerosi progetti/configurazioni di piattaforme endoscopiche, a seconda delle risorse disponibili e dell'agenda di ricerca di ciascun laboratorio. Il nostro intento qui è quello di fornire una guida ai ricercatori da considerare nel contesto della loro ricerca. Inoltre, miriamo a dimostrare come questo protocollo di laringoscopia possa portare a una ricchezza di dati oggettivi che possano innescare nuove intuizioni sulla nostra comprensione della disfunzione laringea e della rigenerazione.

L'effetto combinato di tutti i passaggi descritti in questo protocollo di laringoscopia murina si traduce in un esame minimamente invasivo della laringe murina adulta che può essere ripetuto negli stessi animali per rilevare e caratterizzare la disfunzione laringea nel tempo in risposta al danno iatrogeno, alla progressione della malattia e/o all'intervento di trattamento relativo alla protezione delle vie aeree. Da notare che questo protocollo non valuta la funzione laringea correlata alla vocalizzazione.

Il protocollo di laringoscopia murina segue un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e le linee guida del National Institutes of Health (NIH). È stato sviluppato per l'uso con oltre 100 topi adulti C57BL/6J e oltre 50 ratti Sprague Dawley adulti, di sesso approssimativamente uguale e di età compresa tra 6 settimane e 12 mesi per entrambe le specie. È necessario un ulteriore sviluppo del protocollo per l'adattamento ai roditori più giovani/più piccoli. Gli animali sono stati alloggiati in gruppo (fino a quattro topi o due ratti per gabbia, in base al sesso e alla cucciolata). Le condizioni standard del vivarium includevano l'ingabbiamento statico con una rigorosa regolazione della temperatura ambiente (20-26 °C), dell'umidità (30%-70%) e del ciclo di luce standard di 12 ore. Tutti gli animali hanno ricevuto materiale fresco di arricchimento (ad esempio, capanna/tubo, dolcetti dentali, nido) durante i cambi di gabbia settimanali. È stato fornito l'accesso illimitato a cibo e acqua, tranne durante una breve (fino a 4-6 ore) restrizione alimentare prima dell'anestesia, come descritto di seguito. Il personale veterinario e di ricerca monitorava gli animali ogni giorno.

1. Anestesia animale che non abolisce la deglutizione

1. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati (ad es. guanti, maschera) per ridurre al minimo l'esposizione agli allergeni durante il lavoro con i roditori.
2. Limitare il cibo in ogni gabbia per roditori fino a 4-6 ore prima dell'anestesia per ridurre al minimo la ritenzione di cibo nella cavità orale e nella faringe, che può interferire con la visualizzazione endoscopica e/o provocare l'aspirazione del cibo durante la procedura.
   NOTA: La ritenzione di cibo nella cavità orale è un reperto normale nei roditori senza disfagia se non sono stati sottoposti a restrizioni alimentari.
3. Predisporre una "stazione di riscaldamento" per l'induzione/recupero degli animali.
   1. Preriscaldare un termoforo a circolazione d'acqua a 37 °C su una superficie del piano di lavoro.
   2. Selezionare gabbie di induzione/recupero di dimensioni adeguate per la specie da testare. Ad esempio, le gabbie per scatole da scarpe per topi con coperchi superiori filtranti sono di dimensioni adeguate per l'induzione/recupero di topi e ratti. Utilizzare una gabbia di induzione/recupero fresca per ogni animale sottoposto a test; Utilizzare una singola gabbia sia come gabbia di induzione che di recupero per lo stesso animale.
   3. Rivestire il pavimento della gabbia di induzione/recupero con un leggero strato di materiale assorbente (ad es. trucioli di pioppo tremulo, tovagliolo di carta, tappetino per cuccioli) per il calore e l'assorbimento delle secrezioni corporee durante l'induzione e il recupero dell'anestesia.
   4. Posizionare le gabbie preparate (con i coperchi superiori del filtro) completamente sul termoforo per 30-60 minuti prima dell'induzione dell'anestesia.
      NOTA: Questo microambiente fornisce calore supplementare sufficiente per promuovere un metabolismo stabile dell'anestesia durante l'induzione e il recupero.
4. Posizionare la gabbia di casa dell'animale a metà sul termoforo preriscaldato a 37 °C per circa 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia.
   NOTA: Fornire calore supplementare prima della procedura può accelerare l'induzione dell'anestesia e prevenire il sovradosaggio accidentale dovuto al metabolismo dell'anestesia rallentato/ritardato dall'ipotermia.
5. Preparare l'anestesia ketamina-xilazina (KX) in base alla specie e al peso corporeo.
   1. Per i topi: una miscela di 90 mg/kg di ketamina e 11 mg/kg di xilazina è sufficiente per la laringoscopia transorale in topi adulti di fondo C57BL/6 di entrambi i sessi. Regolare le dosi per altri ceppi di topi ed età.
   2. Per i ratti: una miscela di 60 mg/kg di ketamina e 6 mg/kg di xilazina è sufficiente per la laringoscopia transorale nei ratti Sprague Dawley adulti di entrambi i sessi. Regolare le dosi per altri ceppi di ratti ed età.
6. Preriscaldare gli agenti anestetici riempiti con siringa sulla stazione di riscaldamento a 37 °C per evitare la perdita di calore negli animali che si verifica durante l'iniezione di liquidi freddi.
7. Iniettare nel roditore la dose KX calcolata utilizzando una siringa di dimensioni adeguate (ad es. 1 ml) e un ago (ad es. 26 G1/2).
   1. Per i topi: somministrare una singola iniezione sottocutanea (SC).
      NOTA: Nella nostra esperienza, le iniezioni SC nei topi riducono/aboliscono la mortalità correlata all'anestesia rispetto alle iniezioni intraperitoneali (IP).
   2. Per i ratti: somministrare una singola iniezione SC o IP. Se si preferisce, sedare i ratti con isoflurano (ISO) (3-5%) in una camera di induzione immediatamente prima dell'iniezione di KX.
      NOTA: Il movimento spontaneo del corpo può riprendere per un breve periodo (in genere <1 minuto) fino a quando il KX non ha effetto.
8. Somministrare glicopirrolato (agente anticolinergico) immediatamente dopo l'iniezione di KX per ridurre le secrezioni salivari in eccesso che possono ostacolare la visualizzazione della laringe durante l'endoscopia transorale e/o ostruire meccanicamente le vie aeree superiori durante il recupero in anestesia.
   NOTA: Il dosaggio e il percorso di somministrazione sono identici per topi e ratti (0,01-0,02 mg/kg SC) e l'effetto è quasi immediato e dura diverse ore.
9. Dopo l'iniezione di glicopirrolato, posizionare il roditore anestetizzato nella gabbia di induzione preriscaldata sulla stazione di riscaldamento e coprire la gabbia con un telo chirurgico per fornire un ambiente buio che riduca al minimo la stimolazione visiva per 10 minuti, indisturbato.
   1. Terminare la procedura se il roditore rimane deambulante 10 minuti dopo la dose iniziale di KX.
      NOTA: I tentativi di fornire un'anestesia aggiuntiva (KX o mantenimento con ketamina) saranno probabilmente inutili.
10. Dopo 10 minuti, somministrare una dose di mantenimento di ketamina (1/4 della dose iniziale se i riflessi degli arti posteriori sono diminuiti o 1/2 della dose iniziale se i riflessi degli arti posteriori sono vivaci; SC per i topi e SC/IP per i ratti) per mantenere l'anestesia.
11. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale e i traumi associati durante la procedura di laringoscopia.
12. Trasferire il roditore anestetizzato su una piattaforma endoscopica personalizzata per iniziare la procedura di laringoscopia.
    NOTA: Abbiamo progettato la nostra piattaforma endoscopica (Figura 1) in modo che disponga di molteplici funzionalità per l'uso con una varietà di approcci chirurgici ed elettrofisiologici per roditori che non richiedono necessariamente l'endoscopia. In quanto tale, è sovradimensionato per un uso puramente endoscopico. Ove pertinente, evidenzieremo le caratteristiche/componenti essenziali per questo protocollo laringoscopia.
13. Da questo punto in poi, controllare i riflessi degli arti posteriori ogni 15-20 minuti durante l'intera procedura e fornire dosi di mantenimento aggiuntive di ketamina secondo necessità, distanziate di almeno 20 minuti l'una dall'altra. Poiché si tratta di una procedura relativamente breve (in genere <45 minuti in anestesia), raramente è necessaria un'ulteriore ketamina dopo la dose iniziale di mantenimento.

2. Passaggio transorale dell'endoscopio per visualizzare la laringe

1. Prima di anestetizzare l'animale, preparare un endoscopio di dimensioni adeguate con capacità di registrazione video.
   NOTA: Utilizziamo abitualmente un otoscopio a zero gradi con un diametro dello stelo di 1,9 mm e una lunghezza dello stelo di 10 cm con una guaina metallica personalizzata (Figura 2), che è l'endoscopio rappresentativo utilizzato in questo protocollo.
   1. Collegare l'endoscopio a una sorgente luminosa e a un sistema di registrazione endoscopica per la visualizzazione in tempo reale e la registrazione video a una velocità minima di 30 fotogrammi al secondo (fps).
   2. La messa a fuoco e il bilanciamento del bianco della fotocamera garantiscono una qualità dell'immagine ottimale.
   3. Collegare l'endoscopio a un micromanipolatore.
      NOTA: Per il tracciamento del movimento laringeo, fissiamo l'endoscopio a un micromanipolatore sulla piattaforma endoscopica per consentire un controllo preciso dell'endoscopio per un'acquisizione video stabile.
2. Fissare il roditore in decubito dorsale su una piattaforma riscaldata. Stabilizzare e immobilizzare la testa fissandola con barre auricolari.
   1. Assicurati che la testa del roditore possa ruotare liberamente su/giù (ma non da un lato all'altro) nelle barre auricolari senza scivolare fuori. Questo grado di libertà facilita l'inserimento transorale e l'avanzamento dell'endoscopio per raggiungere la laringe.
3. Se durante l'endoscopia si desidera la registrazione elettrofisiologica sincrona della respirazione, della deglutizione e della coordinazione deglutizione-respirazione, procedere con l'applicazione di sensori appropriati a tale scopo (Figura 3).
   1. Fissare un sensore respiratorio all'addome sulla linea mediana, immediatamente caudale al processo xifoideo, utilizzando del nastro chirurgico.
   2. Radere e pulire/disinfettare la pelle con una salvietta imbevuta di alcol prima di inserire gli elettrodi dell'ago per prevenire l'infezione.
   3. Utilizzare un ago da 22 G per perforare una piccola apertura attraverso la pelle prima di inserire l'elettrodo dell'ago per evitare danni all'ago per elettromiografia (EMG).
   4. Inserire un elettrodo ad ago EMG concentrico sterile (ad es. 25 mm x 0,3 mm/30 G) attraverso la pelle sottomentoniera sulla linea mediana nella base della lingua (ad es. genioglosso o muscolo genioioideo, a seconda della profondità di inserimento dell'ago).
   5. Inserire un elettrodo di terra (ad es. acciaio inossidabile da 27 G) per via sottocutanea sull'anca (su entrambi i lati).
   6. Collegare il sensore respiratorio e gli elettrodi ad ago EMG a un sistema di registrazione elettrofisiologica (ad es. bioamplificatore e sistema di acquisizione dati con acquisizione video sincrona) e verificare i segnali elettrofisiologici puliti in entrambi i canali prima di procedere.
   7. Avvolgere i siti di connessione degli elettrodi con un foglio di alluminio per schermare dal rumore elettrico e migliorare il rapporto segnale/rumore nelle registrazioni elettrofisiologiche corrispondenti.
   8. Regolare la posizione del sensore respiratorio e la profondità dell'elettrodo dell'ago EMG secondo necessità per ottenere segnali elettrofisiologici puliti in entrambi i canali. Per seguire questo protocollo, utilizzare una frequenza di campionamento di 1k per la respirazione e una frequenza di campionamento di 20k e un filtro passa-banda (ad esempio, 150-3.000 Hz) per l'EMG.
4. Copri il busto del roditore (e il sensore respiratorio) con una coperta trasparente per facilitare la termoregolazione e consentire la visualizzazione del movimento addominale durante la respirazione. Lasciare gli arti posteriori e il basso addome liberamente esposti per l'accesso durante i controlli dei riflessi e il ridosaggio di mantenimento della ketamina. Assicurarsi che la coperta non limiti il movimento addominale durante la respirazione.
5. Procedere con l'endoscopia transorale (Figura 4).
   1. Apri la bocca del roditore inserendo un applicatore affusolato con punta di cotone dietro gli incisivi centrali, perpendicolare alla mascella. Ruotare il batuffolo di cotone sulla superficie dorsale della lingua per sporgerla leggermente dalla bocca.
6. Usando una presa leggera per le dita, tirare delicatamente la lingua fuori dalla bocca su un lato degli incisivi centrali mentre si inserisce la punta dell'endoscopio nella cavità orale (Figura 4A, B).
   1. Accendere la fonte di luce dopo aver inserito la punta dell'endoscopio in bocca per evitare di danneggiare potenzialmente gli occhi del roditore.
   2. Inserire l'endoscopio lateralmente agli incisivi sullo stesso lato della lingua retratta. Gli incisivi centrali impediscono l'inserimento dell'endoscopio sulla linea mediana, rendendo quindi necessario questo approccio di inserimento laterale.
7. Avviare i sistemi di registrazione endoscopica (ed elettrofisiologica). Registrare continuamente durante l'intera procedura per garantire dati sufficienti per l'analisi post hoc o registrare in momenti selezionati, a seconda delle esigenze dello studio.
8. Far avanzare con cautela l'endoscopio per visualizzare l'orofaringe, facendo attenzione a non graffiare contro il palato duro o applicare una pressione eccessiva sulla lingua che potrebbe causare lesioni.
   1. Rimuovere eventuali particelle di cibo visibili e/o secrezioni salivari in eccesso utilizzando un tampone di dimensioni adeguate (ad es. un micro-pennello da 1,5 mm) per ridurre al minimo il rischio di aspirazione man mano che la procedura avanza.
   2. Continuare ad avanzare/regolare la posizione dell'endoscopio fino a quando l'ipofaringe non è centrato all'interno del campo visivo sul monitor e le strutture anatomiche chiave sono identificabili (Figura 4C). A questo punto, tutte le strutture dovrebbero apparire anatomicamente allineate/simmetriche all'interno del campo visivo della fotocamera; In caso contrario, riposizionare l'endoscopio secondo necessità.
   3. Osservare il movimento evocato della mascella/lingua durante l'avanzamento dell'endoscopio. In caso di assenza, procedere senza ulteriori dosi di ketamina. Se presente, somministrare una seconda dose di mantenimento della ketamina (da 1/4 a 1/2 della dose iniziale di ketamina) e attendere circa 5 minuti per fare effetto prima di procedere. Risomministrare la dose solo se sono trascorsi almeno 20 minuti dall'iniezione precedente per evitare l'eccessiva sedazione e l'abolizione della deglutizione.
   4. Esamina la lingua del roditore ogni 5 minuti durante la procedura per verificare che lo scolorimento scurito, che è indicativo di ischemia. Per evitare ciò, riposizionare l'endoscopio secondo necessità.
9. Applicare una leggera pressione sul velo con una microsonda (ad esempio, una spatola metallica) inserita accanto all'endoscopio per disaccoppiare il palato molle e l'epiglottide per visualizzare la laringe a distanza (Figura 4D). Evitare di utilizzare la punta dell'endoscopio per il disaccoppiamento, poiché la pressione applicata può causare danni ai tessuti molli o piegare/danneggiare permanentemente l'asta dell'endoscopio.
   NOTA: A differenza degli esseri umani, la laringe murina non è direttamente visibile da una prospettiva transorale. Invece, l'epiglottide è intrappolata meccanicamente sotto una membrana mucosa sovrastante il velo, il che provoca la formazione di uno spazio ipofaringeo senza uscita. L'applicazione di una leggera pressione sul velo rilascia l'epiglottide dalla membrana velare per dare una visione parziale della laringe.
10. Osservare le deglutizioni evocate durante il disaccoppiamento velum/epiglottide.
    1. Identificare le deglutizioni come bruschi e brevi spostamenti posteriori della lingua verso il palato duro. Questo movimento avviene tipicamente in sincronia con un breve movimento mandibolare/depressione, fornendo così un surrogato per l'identificazione della deglutizione quando la lingua posteriore non è facilmente visibile nel campo visivo dell'endoscopio.
    2. Identificare anche le deglutizioni tramite l'attività di scoppio EMG della lingua in combinazione con brevi episodi di apnea nella registrazione elettrofisiologica, entrambi che si verificano in sincronia con eventi di chiusura glottica nel video endoscopico.
       1. In caso di deglutizione rapida e ripetitiva indicativa di anestesia insufficiente (cioè troppo leggera), ridosare e attendere ~5-10 minuti prima di procedere. Attendere almeno 20 minuti dopo la precedente iniezione di mantenimento della ketamina per evitare l'eccessiva sedazione e l'abolizione della deglutizione.
       2. Considerare la profondità dell'anestetico ottimale quando vengono evocate solo poche deglutizioni durante il disaccoppiamento velare-epiglotto.
       3. Se la deglutizione viene abolita, l'anestesia è troppo profonda per valutare la protezione delle vie aeree laringee. In questo caso, attendere 5-10 minuti per il metabolismo della ketamina prima di procedere con la visualizzazione ravvicinata della laringe.

3. Registrazione video ravvicinata e senza ostacoli del movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione evocata

NOTA: È possibile anche la registrazione elettrofisiologica sincrona della respirazione, della deglutizione e della coordinazione deglutizione-respirazione.

1. Far avanzare lentamente l'endoscopio tra il velo e l'epiglottide mantenendo la laringe al centro del campo visivo (Figura 5A-C).
   NOTA: La punta dell'endoscopio passerà facilmente attraverso l'apertura velare-epiglottica senza forzare. In caso contrario, interrompere la procedura per evitare potenziali danni all'animale. È possibile visualizzare la laringe a distanza, con la punta dell'endoscopio nell'ipofaringe. Tuttavia, questo approccio richiede in genere la retrazione manuale dell'epiglottide, del velo e/o della lingua per una migliore visualizzazione della laringe. Tuttavia, parti della laringe in genere rimangono oscurate alla vista e i dispositivi di retrazione possono limitare il movimento laringeo, che può essere scambiato per disfunzione.
2. Continuare ad avanzare l'endoscopio per ottenere una visione ravvicinata senza ostacoli di tutte le dimensioni ventrale-dorsali e laterali della laringe in un unico campo visivo (Figura 5C).
   NOTA: La commessura ventrale può essere ostruita dall'epiglottide, in particolare nei topi più giovani/più piccoli. In questi casi, il tentativo di manipolare in modo più aggressivo la punta dell'endoscopio per visualizzare la commessura ventrale può limitare il movimento laringeo, che può essere scambiato per disfunzione. Può anche bloccare il flusso d'aria laringeo con conseguente asfissia.
3. Osservare il movimento oscillatorio della laringe mentre il roditore inspira (allargamento della glottide) ed espira (restringimento della glottide) durante ogni ciclo respiratorio.
   NOTA: La velocità e l'entità del movimento laringeo/glottidale possono variare con la profondità dell'anestesia; Tuttavia, un gap glottidale (cioè lo spazio d'aria tra gli aritenoidi sinistro/destro e le corde vocali) rimane tipicamente visibile durante tutto il ciclo respiratorio nei roditori sani.
   1. Se si nota un marcato restringimento glottico, regolare la posizione dell'endoscopio per garantire un flusso d'aria senza ostacoli attraverso le vie aeree superiori. Ad esempio, evitare di esercitare pressione sul velo, che può causare l'ostruzione dei tessuti molli delle vie aeree nasali. Evitare inoltre di inserire la punta dell'endoscopio nello spazio glottidale, che può bloccare il flusso d'aria laringeo portando all'asfissia. Se in rari casi la respirazione cessa, eseguire diverse compressioni toraciche medio-sternali (usando un dito) o ventilazione a pressione positiva (usando una "sacca di rianimazione" in miniatura) dopo aver rimosso l'endoscopio.
4. Videoregistrare il movimento respiratorio laringeo per 30-60 s a scopo di valutazione post hoc.
5. Con la laringe ancora in vista ravvicinata, regolare leggermente la punta dell'endoscopio all'interno dell'ingresso laringeo per applicare la stimolazione meccanica alla mucosa sovrastante il velo e/o l'epiglottide ed evocare la deglutizione in roditori anestetizzati in modo ottimale.
   1. Utilizzare regolazioni di livello micro della punta dell'endoscopio (ad es. ~1 mm in qualsiasi direzione) per prevenire lesioni alla mucosa e/o ostruzione delle vie aeree.
   2. Fai attenzione alle deglutizioni evocate, che possono essere facilmente identificate come eventi di chiusura glottica improvvisa che si verificano in sincronia con la depressione visibile della mascella, l'attività di scoppio EMG della lingua e l'apnea breve (<1/2 s) visibile nel tratto respiratorio.
      NOTA: Possono verificarsi eventi di chiusura glottica senza movimento concomitante della mascella; Tuttavia, la chiusura glottica è in genere incompleta per questi casi. Sospettiamo che questi possano essere altri riflessi protettivi delle vie aeree (ad esempio, il riflesso dell'adduttore laringeo) che emergono quando l'anestesia inizia a svanire; tuttavia, si tratta di eventi rari/incoerenti che richiedono ulteriori indagini.
   3. Ripetere fino a quando non vengono evocate 5-10 rondini e viene registrato un video per animale. Se la deglutizione viene abolita, rimuovere l'endoscopio e attendere 5-10 minuti affinché si verifichi il metabolismo della ketamina prima di procedere.
6. Ritrarre con cautela, ma non rimuovere, l'endoscopio nell'orofaringe e centrare l'ipofaringe nel campo visivo per visualizzare l'epiglottide e il velo.
7. Riaccoppiare il velo e l'epiglottide per riprendere la respirazione nasale utilizzando un micro-tampone per applicare una leggera pressione contro la base della lingua per evocare la deglutizione e il reintrappolamento dell'epiglottide sotto la membrana velare. Se il riaccoppiamento non avviene entro pochi tentativi, procedere con il recupero in anestesia senza riaccoppiamento per evitare il rischio di lesioni laringee.
8. Interrompere la registrazione endoscopica (ed elettrofisiologica).
9. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina per inumidire la lingua e gli incisivi centrali e riportare la lingua nella sua posizione anatomica all'interno della cavità orale.
10. Staccare le barre auricolari e rimuovere la sonda di temperatura, il sensore respiratorio e gli elettrodi EMG dal roditore per procedere con il recupero dell'anestesia.

4. Recupero dell'anestesia

1. Posizionare l'animale in una gabbia di recupero preriscaldata (cioè la stessa della gabbia di induzione) sulla "stazione di riscaldamento" per riprendersi dall'anestesia.
2. Riapplicare il lubrificante per gli occhi per evitare che si secchi.
3. Somministrare soluzione salina riscaldata SC per l'idratazione dei liquidi: fino a 5 ml per i ratti e fino a 0,5 ml per i topi.
4. Somministrare atipamezolo SC per l'inversione della xilazina e per aumentare l'impulso respiratorio: 1-2 mg/kg per ratti e topi.
   1. Iniziare con 2 mg/kg di atipamezolo, immediatamente seguito da una stimolazione manuale lungo la schiena e lo stomaco del roditore per accelerare il recupero.
      NOTA: Utilizzando questo approccio, il movimento spontaneo della testa inizia in genere entro 1-3 minuti. Tuttavia, il ritorno allo stato ambulatoriale richiede in genere una media di 2 ore (da 1 a 5 ore) dopo la laringoscopia in anestesia KX, a causa delle differenze individuali.
   2. Fornire ulteriore atipamezolo alla dose di 1 mg/kg (almeno 15 minuti dopo la prima iniezione) se il movimento spontaneo del corpo sta diminuendo invece di aumentare entro i primi 15-30 minuti dal recupero dell'anestesia, nonostante fornisca una frequente stimolazione manuale.
   3. Procedere con la somministrazione di doxapram (5 mg/kg IP per ratti e topi) se l'attività spontanea continua a diminuire. Ridosare con questo agente di "salvataggio di emergenza" a intervalli di 10-15 minuti (fino a cinque dosi) fino a quando non emerge un movimento spontaneo. Se i roditori rimangono moribondi, sopprimere gli animali utilizzando metodi di eutanasia approvati (ad esempio, un'overdose di ketamina seguita da un metodo secondario come la decapitazione).
5. Monitorare attentamente i roditori in via di guarigione a intervalli di 15-20 minuti per rilevare cambiamenti avversi nello stato respiratorio, nella mobilità e nella termoregolazione e fornire l'intervento necessario (ad esempio, stimolazione manuale, ossigeno supplementare, coperta termica, iniezioni di atipamezolo o doxapram). Fornire un monitoraggio più frequente per i roditori che richiedono un intervento.
   1. Fornire ossigeno supplementare (ad es. 1-2 L/min in una camera di induzione riscaldata, senza ISO) per intervalli di 10 minuti, se necessario per i roditori con tempi di recupero dell'anestesia KX prolungati. In alternativa, applicare una stimolazione frequente lungo le superfici dorsali e ventrali dell'animale per normalizzare i livelli di SpO₂ (>94%).
   2. Posiziona i compagni di gabbia in via di recupero nella stessa gabbia di recupero (fino a due roditori per gabbia) per promuovere una maggiore attività spontanea e un recupero più rapido.
6. Riportano i roditori nella loro gabbia domestica riscaldata quando sono in grado di muoversi spontaneamente all'interno della gabbia di recupero.
   1. Rimetti la borraccia standard per cibo e acqua nella gabbia di casa. Non fornire sistemazioni speciali per l'accesso a cibo/acqua mentre l'anestesia sta ancora svanendo per ridurre al minimo il rischio di soffocamento/aspirazione.
   2. Osservare l'attività della gabbia domestica e rimuovere eventuali ostacoli che impediscono la deambulazione (ad es. capanna, tubo in PVC).
   3. Posizionare la gabbia domestica per metà sopra e per metà fuori dalla stazione di riscaldamento per le successive 12-16 ore (cioè durante la notte).
      NOTA: L'interruzione anticipata del calore supplementare può causare mortalità a causa dell'ipotermia.
7. Esegui i controlli sanitari standard la mattina successiva. Riportare gli animali con la ripresa dell'attività normale/basale, delle funzioni corporee (ad esempio, termoregolazione, mangiare, bere, urinare, defecare) e del peso stabile (ad esempio, mantenere o aumentare) le condizioni standard del vivaio con il monitoraggio quotidiano della salute di routine. Nel raro caso in cui i roditori abbiano diminuito l'attività, le funzioni corporee o il peso corporeo, continua il calore supplementare per un altro giorno.
   NOTA: Per i ratti, è comune che la colorazione della porfirina appaia improvvisamente intorno a entrambi gli occhi ~3-6 ore nel periodo di recupero dell'anestesia. La colorazione si risolve tipicamente entro 24 ore.

5. Quantificazione oggettiva del movimento laringeo durante la respirazione rispetto alla deglutizione

1. Utilizza un software di editing video con una funzione di analisi fotogramma per fotogramma per visualizzare i video dell'endoscopia.
   1. Identificare almeno un episodio rappresentativo di respirazione spontanea di 10-20 s per animale.
   2. Identificare 3-5 eventi di deglutizione rappresentativi per animale.
   3. Assicurarsi che gli episodi/eventi di respirazione e deglutizione selezionati soddisfino i seguenti criteri di analisi: laringe centrata nel campo visivo della telecamera con tutte le strutture/bordi laringei visibili (cioè non oscurati dal velo, dall'epiglottide o dalle secrezioni salivari in eccesso), illuminazione sufficiente (cioè in grado di vedere tutte le strutture/bordi laringei) e senza artefatti di movimento della telecamera (cioè l'endoscopio non si muove).
2. Analizzare gli episodi/eventi di respirazione e deglutizione identificati utilizzando approcci soggettivi e/o oggettivi.
   1. Per l'analisi soggettiva: utilizza una scala Likert per valutare soggettivamente il movimento laringeo durante la visualizzazione in tempo reale e fotogramma per fotogramma utilizzando un software di editing video. Per seguire questo protocollo, utilizzare una scala Likert espansa che va da -2 a +2, dove i valori negativi indicano il movimento laringeo nella direzione opposta a quella prevista. Stimare la protezione delle vie aeree laringee durante la deglutizione, dove 0 = nessuna riduzione della dimensione della fessura glottidale (cioè, nessuna protezione delle vie aeree laringee), 1 = una certa riduzione della fessura glottidale (cioè, protezione incompleta delle vie aeree) e 2 = completa adduzione degli aritenoidi, con solo una piccola fessura glottidale ventrale tra le corde vocali (cioè, protezione completa delle vie aeree), con valori negativi che indicano un movimento laringeo paradosso.
      NOTA: Una scala Likert che va da 0 a 2 è comunemente usata negli studi sui roditori, dove 0 = nessun movimento, 1 = un po' di movimento e 2 = movimento normale 17,18,19,20,21,22. Tuttavia, questa scala non tiene conto del movimento laringeo paradossale che spesso si verifica a seguito di lesioni ricorrenti del nervo laringeo (RLN)¹⁰.
   2. Per un'analisi obiettiva: identificare quattro fotogrammi video chiave: 1) il fotogramma a riposo che precede direttamente l'inizio dell'adduzione laringea (cioè il fotogramma prima dell'addotto delle corde vocali), 2) il fotogramma in cui le corde vocali hanno completato l'adduzione, 3) il fotogramma immediatamente precedente l'abduzione delle corde vocali (questo può sovrapporsi a #2) e 4) il fotogramma in cui le corde vocali sono state completamente abdotte e sono tornate in posizione di riposo per riprendere a respirare. Usa il timestamp di questi quattro fotogrammi chiave per calcolare la durata dell'adduzione delle corde vocali (dal fotogramma 1 al fotogramma 2), dalla chiusura glottica (dal fotogramma 2 al fotogramma 3), dall'abduzione delle corde vocali (dal fotogramma 3 al fotogramma 4) e dalla durata totale della deglutizione (dal fotogramma 1 al fotogramma 4). In alternativa, utilizzare altri software commerciali esistenti²³ per misurare l'angolo glottidale (cioè tra gli aritenoidi dorsalmente o le corde vocali ventralmente) durante la massima abduzione e la massima adduzione utilizzando immagini fisse 17,18,24. Chiedi ad almeno due revisori addestrati di eseguire questo processo in modo indipendente in modo cieco, identificare le discrepanze tra i revisori e raggiungere un consenso congiunto per ogni discrepanza.
      NOTA: In precedenza abbiamo eseguito questa analisi manuale fotogramma per fotogramma degli eventi di temporizzazione della chiusura glottica (ad esempio, durante i riflessi protettivi delle vie aeree) utilizzando software di editing video commerciali nei roditori e negli esseri umani¹⁴. Tuttavia, questo approccio è inefficiente e fornisce solo una quantificazione limitata della dinamica del movimento laringeo. Attualmente utilizziamo un software di tracciamento laringeo costruito internamente per eseguire una quantificazione oggettiva più ampia del movimento laringeo durante la respirazione e dei riflessi protettivi delle vie aeree 22,25,26,27,28,29,30. Il software è dotato di funzionalità di tracciamento automatizzato fotogramma per fotogramma per la quantificazione oggettiva della distanza (ampiezza) e della temporizzazione (frequenza) del movimento laringeo sinistro rispetto a quello destro. Utilizziamo questi parametri per ricavare una varietà di misurazioni basate sul movimento per rilevare/quantificare la disfunzione laringea (ad esempio, angolo glottidale massimo/minimo/intervallo, simmetria del movimento laringeo e sincronia) durante la respirazione, la deglutizione e altri riflessi protettivi delle vie aeree (ad esempio, riflesso dell'adduttore laringeo). Questo software è ancora in fase di perfezionamento e non è ancora disponibile in commercio/al pubblico.

L'uso efficace di questo protocollo di laringoscopia murina consente una visualizzazione ravvicinata della laringe durante la respirazione spontanea e la deglutizione evocata in condizioni di salute e malattia, come mostrato nella Figura 6. Inoltre, questo protocollo può essere ripetuto più volte negli stessi roditori per consentire lo studio della funzione/disfunzione laringea nel tempo. Come mostrato nella Figura 7, abbiamo ripetuto con successo questo protocollo laringoscopia 6 volte in un arco di tempo di 4 mesi per studiare il modello di recupero spontaneo in un modello chirurgico di lesione RLN nel ratto (dati non ancora pubblicati). I tentativi di utilizzare l'anestesia ISO invece di KX hanno portato alla quasi abolizione della deglutizione (Figura 8) nei roditori sottoposti a stimolazione elettrica diretta del nervo laringeo superiore destro per evocare la deglutizione, come descritto nei nostri precedenti esperimenti^31,32. Ciò si è verificato con ISO a partire dal 2%; la riduzione degli ISO al di sotto di questo livello ha comportato il ritorno del movimento spontaneo ed è stato quindi evitato. Questo effetto confondente dell'ISO evidenzia l'importanza della selezione dell'anestesia per il successo dell'uso di questo protocollo.

Quando la qualità dell'immagine endoscopica è buona, è possibile analizzare video rappresentativi della respirazione e della deglutizione utilizzando un software di tracciamento del movimento, come mostrato nella Figura 9. Le misure di esito rappresentative generate automaticamente dal nostro software di tracciamento laringeo personalizzato sono elencate nella Tabella 1. Si noti che diverse misure di esito correlate alla respirazione e alla deglutizione erano marcatamente diverse tra il basale e la successiva transsezione RLN nello stesso ratto rappresentativo. Mentre gli angoli glottidali durante la respirazione erano simili tra il basale e la transsezione post-RLN, i rapporti tra l'ampiezza del movimento laringeo destro/sinistro (cioè il rapporto medio dell'intervallo di movimento o MMRR) e la frequenza (rapporto del ciclo aperto-chiuso o OCCR) durante la respirazione erano inferiori dopo la transezione. Allo stesso modo, la durata della deglutizione è stata più breve dopo la transezione RLN.

Se vengono acquisite registrazioni elettrofisiologiche sincrone (ad esempio, pneumogramma respiratorio ed EMG genioglosso), diverse misure di esito oggettive aggiuntive sono quantificabili per la correlazione con i dati laringoscopia. Esempi di misure di esito basate sull'elettrofisiologia di interesse per la nostra ricerca sono riassunti nella Figura 10. Attualmente stiamo sviluppando algoritmi per la quantificazione automatizzata di queste misure di esito.

Figura 1: Piattaforma per endoscopia murina. (A) Vengono mostrate le viste laterali e (B) dall'alto della piattaforma per endoscopia murina personalizzata, con i componenti essenziali etichettati. Si noti che il piano del tavolo sotto il termoforo è regolabile. Qui sono mostrate le dimensioni del piano del tavolo e del termoforo utilizzate con i ratti, che possono essere facilmente rimosse per esporre un piano del tavolo delle dimensioni di un mouse che ospita un termoforo più piccolo (non mostrato). Un adattatore personalizzato fissa un endoscopio a un micromanipolatore collegato alla base della piattaforma. Questo design strategico consente di spostare l'intera piattaforma come un'unità durante la procedura endoscopica, senza rischiare lesioni all'animale a causa del movimento involontario o incontrollato dell'endoscopio. Il micromanipolatore consente regolazioni grossolane e micro della punta dell'endoscopio in più direzioni, tra cui x (sinistra/destra), y (avanti/indietro), z (su/giù), nonché la rotazione attorno a y (beccheggio) e z (imbardata). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Otoscopio e guaina personalizzata per laringoscopia murina. (A) Componenti smontati di un otoscopio commerciale e guaina personalizzata in acciaio inossidabile con adattatore per laringoscopia murina. (B) Una volta assemblata, la punta dell'otoscopio si estende di 1 mm oltre la guaina metallica, ma è regolabile fino a 5 mm secondo necessità. Questo design strategico facilita l'avanzamento della punta stretta dell'otoscopio nell'ingresso laringeo del roditore, mentre la guaina metallica di diametro leggermente più grande (2,4 mm) tiene sufficientemente aperti il velo e l'epiglottide per una visualizzazione ottimale dell'intera laringe durante la respirazione e la deglutizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Registrazione elettrofisiologica minimamente invasiva durante l'endoscopia. Un sensore respiratorio è fissato all'addome del roditore; un elettrodo EMG viene inserito attraverso la pelle nel muscolo genioglosso della lingua; e un elettrodo di terra viene inserito per via sottocutanea all'anca. Questo approccio consente di studiare la deglutizione, la respirazione e la coordinazione deglutizione-respirazione in sincronia con l'endoscopia. Si noti che la pelle viene rasata e pulita/disinfettata nei siti di inserimento dell'elettrodo. Stella gialla = foglio di alluminio avvolto attorno ai siti di connessione dell'elettrodo per migliorare il rapporto segnale/rumore nelle registrazioni elettrofisiologiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Endoscopia transorale per visualizzare la laringe a distanza. (A) Dopo aver ritratto delicatamente la lingua con una leggera presa per le dita, l'endoscopio viene inserito tra la lingua e gli incisivi centrali nella posizione della stella rossa (cioè lo stesso lato della lingua retratta per mantenere l'allineamento anatomico con l'asta dell'endoscopio). (B) Quando l'endoscopio viene fatto avanzare oltre il palato duro, (C) l'epiglottide e il velum diventano visibili. (D) Per visualizzare la glottide, il velo e l'epiglottide devono essere "disaccoppiati" applicando una pressione contro la superficie del velo (nella posizione della stella nera delineata nell'immagine C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Visualizzazione endoscopica ravvicinata della laringe. (A) La punta dell'endoscopio viene guidata delicatamente tramite il controllo del micromanipolatore tra il velo disaccoppiato e l'epiglottide (nella posizione della stella delineata di nero). Man mano che l'endoscopio avanza, (B) la laringe entra in vista e lo spazio glottidale (stella gialla) viene centrato nel campo visivo della fotocamera tramite regolazioni del micromanipolatore. (C) Il continuo avanzamento dell'endoscopio da parte del micromanipolatore consente di visualizzare l'intera dimensione ventrale-dorsale e laterale della laringe. Abbreviazioni: VC = commessura ventrale della laringe (cioè il punto di giunzione ventrale tra le corde vocali); DC = commessura dorsale della laringe (cioè il punto di giunzione dorsale tra gli aritenoidi); VF = corde vocali; A = aritenoide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Visualizzazione della laringe murina durante la respirazione e la deglutizione. Immagini endoscopiche rappresentative che ritraggono il movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione in un ratto Sprague Dawley adulto (A-C) prima e (D-F) dopo la trassezione chirurgica del RLN destro. Si noti che la postura di riposo della laringe appare invariata (D) dopo la lesione RLN rispetto al basale (A). (B,E) Durante la massima inspirazione, l'asimmetria laringea diventa evidente dopo una lesione RLN. Invece di entrambi gli aritenoidi che abducono per allargare lo spazio glottidale (stella gialla), (B) come mostrato al basale, (E) l'aritenoide omolaterale (destra) (asterisco nero) e la corda vocale appaiono immobilizzati durante tutto il ciclo respiratorio dopo la lesione RLN. L'asimmetria del lato destro è evidente anche durante la deglutizione. (C) Al basale, gli aritenoidi si avvicinano alla linea mediana durante la deglutizione, lasciando un piccolo spazio glottidale ventrale tra le corde vocali. (F) A seguito di una lesione RLN, l'aritenoide omolaterale e la FV si muovono paradossalmente (cioè nella stessa direzione del lato non interessato, freccia rossa) durante la deglutizione, lasciando un ampio spazio glottidale (stella gialla) che si estende dalle commessure laringee ventrali a quelle posteriori. (F) Questa immagine fornisce la prova diretta di una compromissione della protezione delle vie aeree laringee in un modello di ratto di lesione iatrogena RLN. (C,F) Si noti che la laringe si avvicina all'endoscopio durante la deglutizione, come indicato dall'epiglottide e dal velum che non sono più visibili nel campo visivo della telecamera. Le frecce nere indicano la direzione del normale movimento laringeo mentre la freccia rossa indica il movimento paradossale; stella gialla = spazio glottidale. Abbreviazioni: VFs = corde vocali; A = aritenoide; RLN = nervo laringeo ricorrente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Utilizzo della laringoscopia seriale per studiare la disfunzione laringea durante la respirazione e la deglutizione in un modello di ratto di lesione iatrogena da RLN. Una scala Likert che va da -2 a +2 è stata utilizzata per stimare la distanza e la direzione del movimento laringeo in otto ratti adulti di Sprague-Dawley per un periodo di 4 mesi. Dopo la laringoscopia basale, i ratti sono stati sottoposti a una procedura chirurgica per sezionare il RLN destro, seguita da laringoscopia seriale a 1 settimana dopo l'intervento, quindi di nuovo a intervalli di 1 mese da 1 a 4 mesi dopo l'intervento. Tutti e otto i ratti sono sopravvissuti alla procedura, dimostrando così l'efficacia del nostro regime di anestesia per la laringoscopia seriale. (A) I video sono stati analizzati in tempo reale e fotogramma per fotogramma/slow motion per quantificare il movimento laringeo durante la respirazione, dove 0 = nessun movimento, 1 = un po' di movimento e 2 = distanza di movimento normale del lato interessato (destro) rispetto al lato intatto (sinistro). (B) Per la deglutizione, la dimensione della fessura glottidale è stata stimata come segue: 0 = nessuna riduzione della dimensione della fessura glottidale (cioè, nessuna protezione delle vie aeree laringee), 1 = una certa riduzione della fessura glottidale (cioè, protezione incompleta delle vie aeree) e 2 = completa adduzione degli aritenoidi, con solo una piccola fessura glottidale ventrale tra le corde vocali (cioè, protezione completa delle vie aeree). Valori negativi per la respirazione e la deglutizione indicano il movimento laringeo nella direzione opposta a quella prevista (cioè paradossale). Si noti che a seguito di una lesione RLN, sia la respirazione che la deglutizione sono state influenzate negativamente. È interessante notare che la protezione delle vie aeree laringee era completa (anche se paradossale) al momento di 1 WPS, ma è peggiorata in seguito, passando da nessuna protezione a protezione incompleta. Abbreviazioni: WPS = settimana post-operatoria; MPS = mesi dopo l'intervento; RLN = nervo laringeo ricorrente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Deglutizione inibita dall'ISO nei roditori. (A) Immagine di un roditore sottoposto a laringoscopia in anestesia ISO, con componenti marcati del sistema di somministrazione ISO personalizzato progettato per questo scopo. Un importante avvertimento di questo approccio innovativo è il rischio di esposizione del personale alle ISO. (B) Un altro aspetto negativo di questo approccio è la soppressione ISO della deglutizione. Questo boxplot e scatterplot fianco a fianco riassumono dati non pubblicati che confrontano l'effetto dell'anestesia ISO rispetto a KX nei topi (9 per gruppo) sottoposti a stimolazione elettrica diretta del nervo laringeo superiore destro per evocare la deglutizione. Qui è mostrato il numero di deglutizioni evocate durante una prova di 5 minuti composta da 20 s di stimolazione a 20 Hz seguiti da 10 s di riposo. Rispetto a KX, i topi anestetizzati con ISO (fino al 2%) hanno avuto significativamente meno deglutizioni (p < 0,001, test t dei campioni indipendenti) e la deglutizione è stata addirittura abolita in 4/9 topi. Risultati simili sono emersi da esperimenti non chirurgici con topi e ratti (dati non mostrati). Abbreviazioni: ISO = isoflurano; KX = ketamina-xilazina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Quantificazione oggettiva del movimento laringeo murino utilizzando un software di tracciamento. Le stesse immagini della Figura 6 che mostrano la respirazione rispetto alla deglutizione in un ratto al basale rispetto alla lesione post RLN sono mostrate qui, con le linee di tracciamento del movimento laringeo aggiunte dal nostro software personalizzato. Le linee di tracciamento sono state aggiunte manualmente al primo fotogramma video lungo il bordo mediale degli aritenoidi per il tracciamento automatico del movimento laringeo sinistro (linea blu) rispetto a quello destro (linea rossa) nei fotogrammi video rimanenti. I corrispondenti grafici del movimento laringeo generati dal nostro software personalizzato a partire da clip video di 2,5 s mostrano il movimento individuale sinistro/destro rispetto al movimento laringeo globale derivato, con etichette corrispondenti alla postura di riposo laringea (A,D), al gap glottidale massimo (B,E) durante l'inspirazione e alla chiusura glottica (C,F) durante la deglutizione. Si noti il movimento paradossale del lato destro (frecce rosse) dopo la lesione RLN, così come l'ampio gap glottidale mostrato nel corrispondente grafico del movimento globale derivato. Le misure di esito rappresentative sono incluse nella Tabella 1. Abbreviazione: RLN = nervo laringeo ricorrente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Misure di esito basate sull'elettrofisiologia per la correlazione con i dati della laringoscopia. (A) Le registrazioni elettrofisiologiche durante la respirazione e la deglutizione sono mostrate per un ratto sano. La finestra superiore mostra una traccia respiratoria (da un sensore respiratorio fissato con nastro adesivo all'addome del roditore), la finestra centrale mostra l'attività EMG nel muscolo genioglosso e la finestra inferiore mostra l'attività EMG filtrata. Notare il modello ritmico respiratorio ed EMG durante la respirazione, che viene interrotto durante gli eventi di deglutizione. Gli eventi di deglutizione sono prontamente rilevabili attraverso un movimento frastagliato nel tracciato respiratorio (frecce nere) che è immediatamente seguito da una breve apnea (asterisco rosso). (B) Una finestra espansa del riquadro rettangolare tratteggiato in A mostra come diverse misure di esito sono quantificate dalle registrazioni elettrofisiologiche. (A) Si noti che durante l'inspirazione (pannelli gialli), il tracciato respiratorio (finestra superiore) è ritardato di ~150 ms (doppia freccia blu) rispetto all'attività di scoppio EMG, il che evidenzia differenze temporali tra i due metodi elettrofisiologici. Le misure di esito rappresentative basate sull'elettrofisiologia includono 1) durata della fase inspiratoria (i); 2) intervallo interrespiratorio (ii, calcolato attraverso i canali EMG respiratorio e filtrato); area di rondine sotto la curva (iii); e apnea deglutitiva (iv; calcolata tramite i canali EMG respiratori e filtrati). Abbreviazione: EMG = elettromiografia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Misure di esito rappresentative generate automaticamente dal software di tracciamento laringeo personalizzato. Abbreviazione: RLN = nervo laringeo ricorrente.

Testo supplementare sulla piattaforma per laringoscopia. Clicca qui per scaricare questo file.

Abbiamo sviluppato con successo un protocollo di laringoscopia specifico per la topologia che consente la visualizzazione ravvicinata del movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione. È importante sottolineare che il protocollo può essere eseguito nel tempo negli stessi animali per studiare l'impatto di varie condizioni patologiche in particolare sulla funzione laringea. Questo protocollo è stato sviluppato nell'ultimo decennio e ha subito modifiche sostanziali e risoluzione dei problemi nel corso del tempo. L'ottimizzazione dell'anestesia è stata la sfida più grande da superare per prevenire il sovradosaggio che abolisce la deglutizione e/o rischia la mortalità correlata al distress respiratorio. Inizialmente abbiamo utilizzato l'ISO, che ha portato all'abolizione della deglutizione, all'eccessiva produzione di saliva (che ostruisce la visualizzazione endoscopica) e al rischio di esposizione del personale, che sono considerati gravi controindicazioni contro l'uso dell'ISO per questa procedura. Pertanto, ci siamo concentrati su KX perché è un anestetico per roditori comunemente usato 33,34,35.

Abbiamo iniziato lo sviluppo del nostro protocollo con i topi 14,22,29,30,36 utilizzando un sialendoscopio a causa del suo diametro dello stelo più piccolo (1,1 mm) rispetto ad altri endoscopi potenzialmente adatti a questo scopo. È importante sottolineare che il scialendoscopio ha un canale di lavoro, che inizialmente abbiamo utilizzato per fornire impulsi d'aria per evocare/studiare il riflesso dell'adduttore laringeo¹⁴. Tuttavia, abbiamo scoperto che il riflesso dell'adduttore laringeo era spesso diminuito/abolito nei topi e nei ratti, molto probabilmente a causa dell'anestesia generale e/o dell'inattivazione dei recettori sensoriali laringei/faringei secondaria all'essiccazione della mucosa dovuta all'erogazione ripetuta di impulsi d'aria. Sebbene il riflesso adduttore laringeo non potesse essere evocato in modo affidabile nei nostri studi, la deglutizione persisteva sorprendentemente ed era prontamente evocata dalla stimolazione meccanica all'ingresso laringeo o in prossimità dell'ingresso laringeo. Per questo motivo, abbiamo spostato la nostra attenzione sull'analisi endoscopica della deglutizione evocata meccanicamente.

Nel processo, abbiamo abbandonato il sialendoscopio semirigido che era soggetto a rotture e aveva un'illuminazione e una risoluzione dell'immagine insufficienti per visualizzare e analizzare in modo affidabile il movimento laringeo. Nell'esplorazione di numerosi endoscopi alternativi, alla fine abbiamo optato per un otoscopio specifico adatto alla laringoscopia sia con topi che con ratti. Sulla base della nostra esperienza, la caratteristica più essenziale nella scelta di un endoscopio adatto per la laringoscopia murina è un diametro dello stelo inferiore a 2 mm in grado di trasmettere una luce sufficientemente intensa per l'acquisizione di video di alta qualità. Gli endoscopi di diametro maggiore non possono passare facilmente attraverso l'ingresso laringeo nei topi e nei ratti per la visualizzazione ravvicinata del movimento laringeo. Gli otoscopi sono particolarmente ideali per questo scopo, data la loro eccellente trasmissione della luce, il design rigido/durevole e il costo relativamente basso rispetto ad altri tipi di endoscopi (ad esempio, scialendoscopio, endoscopio flessibile). Inoltre, mentre il controllo manuale dell'endoscopio è un'opzione nelle mani stabili, riteniamo che il controllo del micromanipolatore sia una caratteristica essenziale di questo protocollo laringoscopia. È importante sottolineare che il controllo dell'endoscopio da parte del micromanipolatore consente una registrazione video stabile del movimento laringeo da parte di un singolo ricercatore per la successiva quantificazione. Ad oggi, abbiamo utilizzato con successo questo protocollo basato sull'otoscopio con topi e ratti adulti. Sospettiamo che le opzioni di endoscopio di diametro inferiore saranno essenziali per eseguire la laringoscopia con roditori più giovani/più piccoli.

Un nuovo vantaggio del nostro protocollo laringoscopia è la capacità di visualizzare la protezione delle vie aeree durante la deglutizione nei roditori, cosa che non è possibile nell'uomo a causa dell'inversione epiglottica sopra l'ingresso laringeo che ostruisce la glottide alla vista. I roditori offrono quindi un'opportunità unica per studiare in modo specifico i meccanismi di protezione delle vie aeree laringee normali rispetto a quelle patologiche allo scopo ultimo di scoprire trattamenti per ripristinare efficacemente la normale funzione laringea. Questa capacità unica di questo protocollo di laringoscopia murina è un grande vantaggio rispetto alla videofluoroscopia (cioè l'altro test "gold standard" per la disfagia), che non è riuscito a rilevare l'aspirazione nei numerosi modelli di disfagia di roditori che abbiamo sviluppato / identificato finora 30,36,37,38,39,40. Questo risultato negativo basato sulla VFSS può essere attribuito a diverse differenze anatomiche nelle vie aeree superiori dei roditori che sono evidenti attraverso il nostro approccio endoscopico transorale. In primo luogo, la laringe del roditore è posizionata in alto nel rinofaringe, dove è nascosta da un'epiglottide e da un velo strettamente accoppiati che creano una cavità orale cul-de-sac. Inoltre, l'epiglottide a riposo è intrappolata sotto una guaina mucosa sovrastante il velo. Questa configurazione anatomica fa sì che i roditori siano respiratori nasali obbligati; Pertanto, la respirazione orale nei roditori svegli è un segno di morbilità respiratoria. Durante la deglutizione nei roditori sani, tuttavia, l'epiglottide scivola fuori dalla guaina mucosa e si inverte sopra l'ingresso laringeo mentre la laringe si eleva ulteriormente nel rinofaringe, fuori dal percorso del bolo. Questi eventi dinamici delle vie aeree superiori possono essere visualizzati/valutati direttamente tramite laringoscopia in roditori sani e modelli di disfunzione laringea.

È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che, nonostante non siano stati aspirati durante i test VFSS, i modelli di roditori (ad esempio, lesioni iatrogene RLN) mostrano effettivamente evidenza di compromissione della protezione delle vie aeree laringee (cioè chiusura glottidale incompleta) tramite laringoscopia che è traslazionale per i pazienti umani con aspirazione correlata alla disfagia. Pertanto, questo protocollo di laringoscopia murina fornisce un'utile piattaforma traslazionale per studiare in modo specifico i meccanismi di protezione delle vie aeree e i trattamenti mirati, che attualmente rimangono sfuggenti. Il raggiungimento di questo obiettivo richiederà un ulteriore sviluppo/ottimizzazione del nostro metodo attuale, che utilizza la punta dell'endoscopio per fornire una stimolazione meccanica non calibrata della mucosa laringea/faringea per evocare la deglutizione. Nel nostro laboratorio sono attualmente in fase di studio metodi più rigorosi e controllati con precisione per evocare la deglutizione, tra cui la stimolazione elettrica diretta del nervo laringeo superiore^32,41 e la stimolazione chimica (ad esempio, acido citrico⁴²) della mucosa laringea/faringea. Un'ulteriore limitazione di questo protocollo è la posizione supina dei roditori, che non imita il comportamento alimentare naturale e da sveglio. Lo sviluppo iniziale del protocollo includeva il posizionamento prono, che comportava un movimento mandibolare limitato e limitava anche la visibilità della cavità orale, impedendo notevolmente il passaggio dell'endoscopio. È possibile visualizzare la laringe a distanza con la punta dell'endoscopio nell'ipofaringe; Tuttavia, questo approccio richiede in genere la retrazione manuale dell'epiglottide, del velo e/o della lingua per una migliore visualizzazione della laringe. A questo scopo abbiamo realizzato una varietà di dispositivi di retrazione manuale personalizzati (ad esempio, speculum per otoscopio modificati, puntali per pipette modificati). Tuttavia, parti della laringe in genere rimangono oscurate alla vista e i dispositivi di retrazione possono limitare il movimento laringeo, che può essere scambiato per disfunzione. Inoltre, le recenti caratteristiche aggiuntive della piattaforma endoscopica (ad esempio, l'inclinazione di Trendelenburg e un ritaglio tra le barre auricolari per adattarsi al movimento della mascella) possono facilitare il test dei roditori in posizione prona. Le barre auricolari e il calore supplementare sono caratteristiche necessarie del protocollo laringoscopia. Le barre auricolari impediscono alla testa di muoversi durante la manipolazione transorale dell'endoscopio. Un sistema di riscaldamento omeotermico mantiene la temperatura corporea tra 36 °C e 38 °C per favorire un'anestesia stabile e prevenire l'ipotermia durante tutta la procedura.

Ora che esiste una metodologia per registrare in modo affidabile il movimento laringeo durante la respirazione e la deglutizione nei roditori, la quantificazione ad alto rendimento è un passo successivo essenziale. Pertanto, i nostri sforzi di analisi video sono in corso per determinare quale misura di esito generata dal nostro software personalizzato può distinguere al meglio le condizioni sane da quelle di malattia, nonché rilevare i cambiamenti nel tempo in risposta alla progressione naturale della malattia o agli interventi di trattamento. I migliori candidati saranno al centro dei successivi approcci di apprendimento automatico per accelerare l'analisi dell'imaging video. È importante sottolineare che i casi di qualità dell'immagine non ottimale (ad esempio, illuminazione insufficiente, strutture anatomiche al di fuori del campo visivo, secrezioni eccessive che oscurano le strutture laringee, ecc.) non sono attualmente suscettibili di tracciamento laringeo; Tuttavia, questa barriera potrebbe essere superata in futuro tramite strumenti di apprendimento automatico. Fino ad allora, rimane fondamentale un'attenta selezione delle sequenze di fotogrammi video che soddisfano i criteri per l'analisi del tracciamento laringeo (come descritto nella sezione 5 del protocollo).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo lavoro è stato finanziato in parte da due sovvenzioni NIH: 1) una sovvenzione R01 multi-PI (TL e NN) (HL153612) dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) e 2) una sovvenzione R03 (TL, DC0110895) dal National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD). Lo sviluppo del nostro software di tracciamento del movimento laringeo personalizzato è stato parzialmente finanziato da una sovvenzione della Coulter Foundation (TL & Filiz Bunyak). Ringraziamo Kate Osman, Chloe Baker, Kennedy Hoelscher e Zola Stephenson per aver fornito un'eccellente cura ai nostri roditori da laboratorio. Ringraziamo anche Roderic Schlotzhauer e Cheston Callais della MU Physics Machine Shop per il loro contributo alla progettazione e alla fabbricazione della nostra piattaforma endoscopica personalizzata e per le modifiche strategiche agli endoscopi commerciali e ai micromanipolatori per soddisfare le nostre esigenze di ricerca. Il nostro software personalizzato di tracciamento del movimento laringeo è stato sviluppato in collaborazione con il Dr. Filiz Bunyak e il Dr. Ali Hamad (MU Electrical Engineering and Computer Science Department). Ringraziamo anche Jim Marnatti di Karl Storz Endoscopy per averci fornito indicazioni sulla scelta dell'otoscopio. Infine, vorremmo ringraziare numerosi ex studenti/tirocinanti del Lever Lab i cui contributi hanno influenzato lo sviluppo del nostro attuale protocollo di laringoscopia murina: Marlena Szewczyk, Cameron Hinkel, Abigail Rovnak, Bridget Hopewell, Leslie Shock, Ian Deninger, Chandler Haxton, Murphy Mastin e Daniel Shu.