Method Article
Этот протокол описывает последовательный подход к трансоральной ларингоскопии у мышей и крыс, который позволяет беспрепятственно визуализировать гортань крупным планом во время дыхания и глотания с использованием оптимизированного режима анестезии и тонко настроенных эндоскопических техник манипуляций.
Гортань является важным органом у млекопитающих с тремя основными функциями - дыханием, глотанием и вокализацией. Известно, что широкий спектр расстройств нарушает функцию гортани, что приводит к затруднению дыхания (одышка), нарушению глотания (дисфагия) и/или нарушению голоса (дисфония). Дисфагия, в частности, может привести к аспирационной пневмонии и связанной с ней заболеваемости, повторной госпитализации и ранней смертности. Несмотря на эти серьезные последствия, существующие методы лечения дисфункции гортани в основном направлены на хирургические и поведенческие вмешательства, которые, к сожалению, обычно не восстанавливают нормальную функцию гортани, что подчеркивает острую потребность в инновационных решениях.
Чтобы восполнить этот пробел, мы разрабатываем экспериментальный эндоскопический подход к исследованию дисфункции гортани на моделях мышей (т.е. мышей и крыс). Тем не менее, эндоскопия у грызунов является довольно сложной задачей из-за их небольшого размера по сравнению с современной технологией эндоскопов, анатомических различий в верхних дыхательных путях и необходимости анестезии для оптимального доступа к гортани. В этой статье мы описываем новый подход к трансоральной ларингоскопии, который позволяет беспрепятственно визуализировать движение гортани крупным планом у мышей и крыс. Важнейшие шаги в протоколе включают точное управление анестезией (для предотвращения передозировки, которая приводит к отмене глотания и/или риску смертности, связанной с респираторным дистрессом) и управление эндоскопом с помощью микроманипулятора (для стабильной видеозаписи движения гортани одним исследователем для последующей количественной оценки).
Важно отметить, что протокол может быть выполнен в течение определенного времени на одних и тех же животных для изучения влияния различных патологических состояний, в частности, на функцию гортани. Новым преимуществом этого протокола является возможность визуализировать защиту дыхательных путей во время глотания, что невозможно у людей из-за эпиглоттической инверсии над входом в гортань, которая закрывает голосовую щель от обзора. Таким образом, грызуны предоставляют уникальную возможность специально исследовать механизмы нормальной и патологической защиты дыхательных путей гортани с конечной целью поиска методов лечения для эффективного восстановления нормальной функции гортани.
Гортань — это хрящевой орган, расположенный на пересечении дыхательных и пищеварительных путей в горле, где он функционирует как клапанный механизм для точного контроля потока и направления воздуха (например, во время дыхания и вокализации) по сравнению с пищей и жидкостью (например, во время глотания). Известно, что гортань поражает широкий спектр заболеваний, включая врожденные (например, ларингомаляция, подсвязочный стеноз), опухолевые (например, папилломатоз гортани, плоскоклеточный рак), неврологические (например, идиопатический паралич гортани, инсульт, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз) и ятрогенные (например, непреднамеренная травма во время операции на голове или шее). Независимо от этиологии, дисфункция гортани обычно приводит к триаде симптомов: одышка (затрудненное дыхание), дисфония (нарушение голоса) и дисфагия (нарушение глотания), которые негативно влияют на экономическое и социальное благосостояние человека 1,2,3,4.
Кроме того, дисфагия, особенно у ослабленных с медицинской точки зрения людей, может привести к аспирационной пневмонии (из-за попадания пищи или жидкости через не полностью закрытую гортань в легкие) и связанной с ней заболеваемости, повторной госпитализации и ранней смертности. Несмотря на эти серьезные последствия, существующие методы лечения дисфункции гортани в основном направлены на хирургические и поведенческие вмешательства, которые обычно не восстанавливают нормальную функцию гортани 1,2,7,8,9,10, что подчеркивает острую потребность в инновационных решениях. С этой целью мы разработали экспериментальный эндоскопический подход к исследованию дисфункции гортани на моделях мышей (т.е. мышей и крыс).
В медицине человека золотым стандартом для оценки дисфункции гортани является эндоскопическая визуализация, называемая ларингоскопии11,12. Как правило, гибкий эндоскоп вводится через нос для осмотра гортани, особенно голосовых складок и прилегающих надгортанных и подсвязочных структур гортани. Жесткий эндоскоп также может быть использован для визуализации гортани через ротовую полость. Любой из подходов позволяет тщательно изучить анатомию гортани и может быть использован для оценки подвижности и функции гортани во время дыхания, фонации и различных защитных рефлексов дыхательных путей, таких как кашель и аддукторный рефлексгортани 13,14,15,16. Однако во время глотания гортань полностью закрыта надгортанником, поскольку она выворачивается, чтобы закрыть вход в гортань, защищая его от пути проглатывания пищевой/жидкой жидкости. В результате, прямая визуализация движения гортани во время глотания невозможна у людей и поэтому должна быть косвенно выведена с помощью других диагностических подходов (например, рентгеноскопии, электромиографии, электроглоттографии).
В этой статье описывается инновационный протокол ларингоскопии для мышей и крыс, который позволяет беспрепятственно визуализировать дыхание и защиту дыхательных путей во время глотания под легкой анестезией. Протокол совместим с различными коммерчески доступными эндоскопическими системами в сочетании с индивидуальной платформой для иммобилизации обезболенного грызуна на протяжении всей процедуры. Важно отметить, что действительно возможны различные конструкции/конфигурации эндоскопических платформ, в зависимости от доступных ресурсов и программы исследований каждой лаборатории. Наша цель состоит в том, чтобы предоставить исследователям руководство, которое они могут учитывать в контексте своих исследований. Кроме того, мы стремимся продемонстрировать, как протокол ларингоскопии может привести к обилию объективных данных, которые могут привести к новому пониманию нашей дисфункции и регенерации гортани.
Комбинированный эффект всех этапов, описанных в данном протоколе ларингоскопии мышей, приводит к минимально инвазивному исследованию гортани взрослых мышей, которое может быть повторено на тех же животных для выявления и характеристики дисфункции гортани с течением времени в ответ на ятрогенное повреждение, прогрессирование заболевания и/или вмешательство в лечение в отношении защиты дыхательных путей. Следует отметить, что этот протокол не оценивает функцию гортани, связанную с вокализацией.
Протокол ларингоскопии мышей соответствует утвержденному протоколу Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) и рекомендациям Национальных институтов здравоохранения (NIH). Он был разработан для использования с более чем 100 взрослыми мышами C57BL/6J и более чем 50 взрослыми крысами Sprague Dawley, примерно равного пола и в возрасте от 6 недель до 12 месяцев для обоих видов. Для адаптации к более молодым/мелким грызунам необходима разработка дополнительного протокола. Животные содержались в группах (до четырех мышей или двух крыс в клетке, в зависимости от пола и помета). Стандартные условия вивария включали в себя статическое содержание в клетке со строгим регулированием температуры окружающей среды (20-26 °C), влажности (30%-70%) и стандартный 12-часовой световой цикл. Все животные получали свежие материалы для обогащения (например, хижину/трубу, зубные лакомства, гнездо) при еженедельной смене клеток. Был обеспечен неограниченный доступ к пище и воде, за исключением короткого (до 4-6 ч) ограничения приема пищи перед анестезией, как описано ниже. Ветеринарный и научный персонал ежедневно следил за животными.
1. Животная анестезия, которая не отменяет глотание
2. Трансоральный проход эндоскопа для визуализации гортани
3. Крупная, беспрепятственная видеосъемка движения гортани во время дыхания и вызванного глотания
ПРИМЕЧАНИЕ: Синхронная электрофизиологическая запись дыхания, глотания и координации глотания и дыхания также является опцией.
4. Восстановление после анестезии
5. Объективная количественная оценка движения гортани при дыхании в сравнении с глотанием
Успешное использование этого протокола ларингоскопии мышей приводит к визуализации гортани крупным планом во время спонтанного дыхания и вызванного глотания в здоровых и больных условиях, как показано на рисунке 6. Более того, этот протокол может быть повторен несколько раз на одних и тех же грызунах, чтобы можно было исследовать функцию/дисфункцию гортани с течением времени. Как показано на рисунке 7, мы успешно повторили этот протокол ларингоскопии 6 раз в течение 4 месяцев для изучения модели спонтанного восстановления в хирургической модели повреждения RLN у крыс (данные еще не опубликованы). Попытки использовать анестезию ISO вместо KX привели к практически полной отмене глотания (рис. 8) у грызунов, подвергавшихся прямой электрической стимуляции правого верхнего гортанного нерва для стимуляции глотания, как описано в наших предыдущих экспериментах31,32. Это произошло при ISO на уровне всего 2%; снижение ISO ниже этого уровня приводило к возвращению спонтанного движения и, следовательно, было предотвращено. Этот сбивающий с толку эффект ISO подчеркивает важность выбора анестезии для успешного использования этого протокола.
При хорошем качестве эндоскопического изображения репрезентативные видеоклипы дыхания и глотания могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения для отслеживания движения, как показано на рисунке 9. Репрезентативные показатели исходов, автоматически сгенерированные нашим специализированным программным обеспечением для отслеживания гортани, перечислены в таблице 1. Обратите внимание, что некоторые критерии исходов, связанных с дыханием и глотанием, заметно различались между исходным уровнем и после транссекции RLN у одной и той же репрезентативной крысы. В то время как гортанные углы во время дыхания были схожими между исходным уровнем и после РЛН, соотношения амплитуды движения правой и левой гортани (т.е. отношение среднего диапазона движения или MMRR) и частоты (отношение открытого и закрытого цикла или OCCR) во время дыхания были ниже после пересечения. Аналогичным образом, продолжительность глотания была короче после пересечения RLN.
Если получены синхронные электрофизиологические записи (например, респираторная пневмограмма и ЭМГ гениоглоссуса), можно количественно оценить несколько дополнительных объективных показателей исходов для корреляции с данными ларингоскопии. Примеры основанных на электрофизиологии показателей исходов, представляющих интерес для нашего исследования, обобщены на рисунке 10. В настоящее время мы разрабатываем алгоритмы для автоматизированной количественной оценки этих показателей результатов.
Рисунок 1: Мышиная эндоскопическая платформа. (A) Боковой и (B) Вид сверху специальной мышиной эндоскопической платформы с маркировкой основных компонентов. Обратите внимание, что столешница под грелкой регулируется по размеру. Здесь показаны размеры столешницы и грелки, используемые с крысами, которые легко снимаются, чтобы обнажить столешницу размером с мышь, которая вмещает меньшую грелку (не показана). Специальный адаптер крепит эндоскоп к микроманипулятору, который крепится к основанию платформы. Такая стратегическая конструкция позволяет перемещать всю платформу как единое целое во время эндоскопической процедуры, не рискуя травмировать животное из-за непреднамеренного/неконтролируемого движения эндоскопа. Микроманипулятор позволяет выполнять грубую и микрорегулировку наконечника эндоскопа в нескольких направлениях, включая x (влево/вправо), y (вперед/назад), z (вверх/вниз), а также вращение вокруг y (шаг) и z (рыскание). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Отоскоп и специальная оболочка для мышиной ларингоскопии. (A) Разобранные компоненты коммерческого отоскопа и изготовленная на заказ оболочка из нержавеющей стали с адаптером для мышиной ларингоскопии. (B) В собранном виде наконечник отоскопа выступает на 1 мм за пределы металлической оболочки, но при необходимости регулируется до 5 мм. Такая стратегическая конструкция способствует продвижению узкого наконечника отоскопа в входное отверстие гортани грызуна, в то время как металлическая оболочка немного большего диаметра (2,4 мм) достаточно удерживает велум и надгортанник открытыми для оптимальной визуализации всей гортани во время дыхания и глотания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Минимально инвазивная электрофизиологическая запись во время эндоскопии. Дыхательный датчик приклеивается к брюшной полости грызуна; электрод ЭМГ вводится через кожу в гениоглоссусную мышцу языка; А заземляющий электрод вводится подкожно в тазобедренный сустав. Этот подход позволяет исследовать глотание, дыхание и координацию глотания и дыхания синхронно с эндоскопией. Обратите внимание, что кожа сбривается и очищается/дезинфицируется в местах введения электродов. Желтая звезда = алюминиевая фольга, обернутая вокруг мест подключения электродов, для улучшения соотношения сигнал/шум в электрофизиологических записях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Трансоральная эндоскопия для визуализации гортани на расстоянии. (A) После осторожного втягивания языка легким захватом пальцами, эндоскоп вводится между языком и центральными резцами в месте красной звезды (т.е. на той же стороне, что и втянутый язык, для поддержания анатомического выравнивания со стержнем эндоскопа). (В) Когда эндоскоп продвигается за твердое нёбо, (В) в поле зрения появляются надгортанник и велум. (D) Чтобы визуализировать голосовую щель, велум и надгортанник должны быть «разъединены» путем приложения давления на поверхность голосовой щели (в месте расположения черной очерченной звезды на изображении C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Эндоскопическая визуализация гортани крупным планом. (A) Наконечник эндоскопа мягко направляется с помощью микроманипулятора между разъединенным велумом и надгортанником (в месте расположения звезды, обведенной черным цветом). По мере продвижения эндоскопа (B) гортань становится видимой, а гортанное пространство (желтая звезда) центрируется в поле зрения камеры с помощью регулировки микроманипулятора. (C) Продолжительное продвижение эндоскопа с помощью микроманипулятора приводит к визуализации всего вентрально-дорсального и латерального размеров гортани. Сокращения: VC = вентральная комиссура гортани (т.е. точка вентрального соединения между голосовыми складками); DC = дорсальная комиссура гортани (т.е. точка дорсального соединения между крыльевыми краями); VF = голосовые складки; А = эритеноид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Визуализация гортани мыши во время дыхания и глотания. Репрезентативные эндоскопические изображения, изображающие движение гортани во время дыхания и глотания у взрослой крысы Sprague Dawley (A-C) до и (D-F) после хирургической транссекции правой RLN. Обратите внимание, что положение гортани в состоянии покоя остается неизменным (D) после травмы RLN по сравнению с исходным уровнем (A). (В,Э) Во время максимального вдоха асимметрия гортани становится очевидной после травмы RLN. Вместо того, чтобы оба эритеноида отведены для увеличения гортанного пространства (желтая звезда), (B), как показано на исходном уровне, (E) ипсилатеральный (справа) аритеноид (черная звездочка) и голосовая связка кажутся обездвиженными на протяжении всего дыхательного цикла после повреждения RLN. Правосторонняя асимметрия также проявляется во время глотания. (C) На исходном уровне перитеноиды приближаются к средней линии во время глотания, оставляя небольшой вентральный гортанный промежуток между голосовыми складками. (F) После повреждения RLN ипсилатеральный перитеноид и VF перемещаются парадоксально (т.е. в том же направлении, что и непораженная сторона, красная стрелка) во время глотания, оставляя большую гортанную щель (желтую звезду), простирающуюся от вентральной до задней спайки гортани. (F) Это изображение является прямым доказательством нарушения защиты дыхательных путей гортани на модели ятрогенного повреждения RLN у крыс. (К,Ж) Обратите внимание, что гортань смещается ближе к эндоскопу во время глотания, о чем свидетельствует то, что надгортанник и велум больше не видны в поле зрения камеры. Черные стрелки указывают направление нормального движения гортани, тогда как красная стрелка указывает на парадоксальное движение; Желтая звезда = гортанное пространство. Сокращения: VFs = голосовые складки; A = черлиновидная оболочка; RLN = возвратный гортанный нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: Использование серийной ларингоскопии для исследования дисфункции гортани во время дыхания и глотания на модели ятрогенного повреждения RLN у крыс. Шкала Лайкерта в диапазоне от -2 до +2 была использована для оценки расстояния и направления движения гортани у восьми взрослых крыс Спрэг-Доули в течение 4-месячного периода. После исходной ларингоскопии крысам была проведена хирургическая процедура по пересечению правой RLN, за которой последовала серийная ларингоскопия через 1 неделю после операции, а затем снова с интервалом в 1 месяц от 1 до 4 месяцев после операции. Все восемь крыс выжили после процедуры, тем самым продемонстрировав эффективность нашего режима анестезии для серийной ларингоскопии. (A) Видеозаписи анализировались в режиме реального времени и покадрово/в замедленном темпе для количественной оценки движения гортани во время дыхания, где 0 = отсутствие движения, 1 = некоторое движение, а 2 = нормальное расстояние движения пораженной (правой) стороны по сравнению с неповрежденной (левой) стороной. (В) При глотании размер гортанной щели оценивался следующим образом: 0 = отсутствие уменьшения размера гортанной щели (т.е. отсутствие защиты гортанных дыхательных путей), 1 = некоторое уменьшение гортанной щели (т.е. неполная защита дыхательных путей) и 2 = полное приведение перитеноидов с небольшим вентральным голосовым зазором между голосовыми складками (т.е. полная защита дыхательных путей). Отрицательные значения для дыхания и глотания указывают на движение гортани в направлении, противоположном ожидаемому (т.е. парадоксально). Обратите внимание, что после повреждения RLN негативное влияние сказалось как на дыхании, так и на глотании. Интересно, что защита дыхательных путей гортани была полной (хотя и парадоксальной) в момент времени 1 WPS, но после этого ухудшилась, варьируясь от отсутствия защиты до неполной защиты. Сокращения: WPS = неделя после операции; МПС = месяцы после операции; RLN = возвратный гортанный нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8: Глотание, ингибированное ISO у грызунов. (A) Изображение грызуна, проходящего ларингоскопию под анестезией ISO, с маркированными компонентами специальной системы доставки ISO, разработанной для этой цели. Основным предостережением этого инновационного подхода является риск воздействия ИСО на персонал. (B) Еще одним недостатком этого подхода является подавление глотания в соответствии со стандартом ISO. Эта параллельная диаграмма и диаграмма рассеяния обобщают неопубликованные данные, сравнивающие эффект анестезии ISO и KX у мышей (9 в группе), подвергавшихся прямой электрической стимуляции правого верхнего гортанного нерва для вызова глотания. Здесь показано количество глотаний, вызванных во время 5-минутного эксперимента, состоящего из 20 с последовательностей стимуляции 20 Гц с последующим 10 секундами отдыха. По сравнению с KX, мыши, получавшие анестезию ISO (всего 2%), имели значительно меньше глотаний (p < 0,001, t-критерий независимых выборок), а у 4/9 мышей глотание было отменено даже. Аналогичные результаты были получены в результате нехирургических экспериментов на мышах и крысах (данные не показаны). Сокращения: ISO = изофлуран; KX = кетамин-ксилазин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 9: Объективная количественная оценка движения гортани мышей с помощью программного обеспечения для слежения. Здесь показаны те же изображения с рисунка 6 , показывающие дыхание в сравнении с глотанием у крысы на исходном уровне и после травмы RLN, с линиями отслеживания движений гортани, добавленными нашим специальным программным обеспечением. Линии слежения были вручную добавлены к первому видеокадру вдоль медиальной границы перитеноидов для автоматизированного слежения за левым (синяя линия) и правым (красная линия) движением гортани в остальных видеокадрах. Соответствующие графики движения гортани, созданные нашим специальным программным обеспечением из видеоклипов продолжительностью 2,5 с, показывают отдельное движение влево/вправо в зависимости от производного глобального движения гортани, с метками, соответствующими (A,D) положению гортани в состоянии покоя, (B,E) максимальному гортанному промежутку во время вдоха и (C,F) закрытию глотки во время глотания. Обратите внимание на парадоксальное движение правой стороны (красные стрелки) после травмы RLN, а также на большой гортанный зазор, показанный на соответствующем графике полученного глобального движения. Репрезентативные критерии оценки исходов включены в Таблицу 1. Сокращение: RLN = возвратный гортанный нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 10: Основанные на электрофизиологии показатели исходов для корреляции с данными ларингоскопии. (A) Электрофизиологические записи во время дыхания и глотания показаны для здоровой крысы. В верхнем окне отображается след дыхания (от дыхательного датчика, прикрепленного к брюшной полости грызуна), в среднем окне отображается активность ЭМГ в мышце гениоглоссуса, а в нижнем окне отображается отфильтрованная активность ЭМГ. Обратите внимание на ритмичное дыхание и ЭМГ во время дыхания, которое прерывается во время глотания. События глотания легко обнаруживаются по неровным движениям в дыхательном следе (черные стрелки), за которыми сразу же следует кратковременное апноэ (красная звездочка). (B) Развернутое окно пунктирного прямоугольного поля в точке А показывает, как некоторые критерии исхода количественно оцениваются на основе электрофизиологических записей. (A) Обратите внимание, что во время вдоха (желтые панели) дыхательный след (верхнее окно) задерживается на ~150 мс (синяя двойная стрелка) по сравнению с активностью взрыва ЭМГ, что подчеркивает временные различия между двумя электрофизиологическими методами. Репрезентативные показатели исходов, основанные на электрофизиологии, включают: 1) продолжительность фазы вдоха (i); 2) междыхательный интервал (ii, рассчитанный по дыхательному и фильтрованному каналам ЭМГ); площадь ласточки под кривой (iii); и глотательное апноэ (в/в; рассчитывается по дыхательным и фильтруемым каналам ЭМГ). Аббревиатура: ЭМГ = электромиография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Критерии оценки результатов | Базис | После травмы RLN | |
Дыхание | Минимальный угол гортани (градусы) | 34.5 | 34.6 |
Максимальный угол гортани (градусы) | 52.9 | 49.9 | |
Средний угол гортани (градусы) | 43.7 | 42.2 | |
Отношение средней дальности движения (MMRR) | 1.26 | 0.29 | |
Коэффициент открытого цикла закрытия (OCCR) | 1 | 0.11 | |
Глотание | Приведение гортани (мс) | 200 | 233 |
Продолжительность закрытия глоттической связки (мс) | 67 | 0 | |
Отведение гортани (мс) | 233 | 67 | |
Общая продолжительность глотания (мс) | 500 | 300 |
Таблица 1: Репрезентативные показатели исходов, автоматически генерируемые специальным программным обеспечением для отслеживания гортани. Сокращение: RLN = возвратный гортанный нерв.
Дополнительный текст о платформе ларингоскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Мы успешно разработали воспроизводимый протокол ларингоскопии, специфичный для мыши, который позволяет визуализировать движение гортани крупным планом во время дыхания и глотания. Важно отметить, что протокол может быть выполнен в течение определенного времени на одних и тех же животных для изучения влияния различных патологических состояний, в частности, на функцию гортани. Этот протокол разрабатывался в течение последнего десятилетия и претерпел существенные изменения и устранение неполадок. Оптимизация анестезии была самой большой проблемой, которую необходимо было преодолеть, чтобы предотвратить передозировку, которая отменяет глотание и/или рискует смертностью, связанной с респираторным дистрессом. Первоначально мы использовали ISO, что привело к отмене глотания, избыточной выработке слюны (что затрудняет эндоскопическую визуализацию) и риску контакта с персоналом, что считается серьезным противопоказанием против использования ISO для этой процедуры. Поэтому мы сосредоточились на KX, потому что это широко используемый анестетик для грызунов 33,34,35.
Мы начали разработку протокола с мышей 14,22,29,30,36 при использовании сиалэндоскопа из-за его меньшего диаметра стержня (1,1 мм) по сравнению с другими потенциально подходящими эндоскопами для этой цели. Важно отметить, что сиалендоскоп имеет рабочий канал, который мы изначально использовали для подачи воздушных импульсов для вызова/изучения рефлекса14 приводящей мышцы гортани. Тем не менее, мы обнаружили, что аддукторный рефлекс гортани часто снижался/отменялся у мышей и крыс, скорее всего, из-за общей анестезии и/или инактивации сенсорных рецепторов гортани/глотки на фоне высыхания слизистой оболочки в результате повторной подачи воздушных импульсов. Несмотря на то, что в наших исследованиях не удалось достоверно вызвать приводящий рефлекс гортани, глотание на удивление сохранялось и легко вызывалось механической стимуляцией у входа в гортань или рядом с ним. По этой причине мы переключили наше внимание на эндоскопический анализ механически вызванного глотания.
При этом мы отказались от полужесткого сиалендоскопа, который был склонен к поломке и имел недостаточное освещение и разрешение изображения для надежной визуализации и анализа движения гортани. Изучая многочисленные альтернативные эндоскопы, мы в конечном итоге остановились на конкретном отоскопе, который подходил для ларингоскопии как у мышей, так и у крыс. Исходя из нашего опыта, самым важным признаком при выборе подходящего эндоскопа для ларингоскопии мышей является диаметр стержня менее 2 мм , который может пропускать достаточно яркий свет для высококачественной видеосъемки. Эндоскопы большего диаметра не могут легко пройти через входное отверстие гортани у мышей и крыс для визуализации движения гортани крупным планом. Отоскопы особенно идеально подходят для этой цели, учитывая их отличное светопропускание, жесткую/долговечную конструкцию и относительно низкую стоимость по сравнению с другими типами эндоскопов (например, сиалэндоскопом, гибким эндоскопом). Кроме того, в то время как ручное управление эндоскопом является опцией в стабильных руках, мы считаем управление микроманипулятором важной особенностью этого протокола ларингоскопии. Важно отметить, что управление эндоскопом с помощью микроманипулятора позволяет одному исследователю вести стабильную видеозапись движения гортани для последующей количественной оценки. На сегодняшний день мы успешно применяем этот протокол, основанный на отоскопе, на взрослых мышах и крысах. Мы подозреваем, что варианты эндоскопов меньшего диаметра будут иметь важное значение для проведения ларингоскопии у молодых/мелких грызунов.
Новым преимуществом нашего протокола ларингоскопии является возможность визуализации защиты дыхательных путей во время глотания у грызунов, что невозможно у людей из-за эпиглоттической инверсии над входом в гортань, которая закрывает голосовую щель от обзора. Таким образом, грызуны предоставляют уникальную возможность специально исследовать механизмы нормальной и патологической защиты дыхательных путей гортани с конечной целью поиска методов лечения для эффективного восстановления нормальной функции гортани. Эта уникальная возможность протокола ларингоскопии мышей является основным преимуществом по сравнению с видеофлюороскопией (т.е. другим «золотым стандартом» теста на дисфагию), которая не смогла обнаружить аспирацию в многочисленных моделях дисфагии у грызунов, которые мы разработали/идентифицировали до сих пор 30,36,37,38,39,40. Этот отрицательный результат, полученный с помощью VFSS, можно объяснить несколькими анатомическими различиями в верхних дыхательных путях грызунов, которые очевидны с помощью нашего трансорального эндоскопического подхода. Во-первых, гортань грызуна расположена высоко в носоглотке, где она скрыта плотно прилегающим надгортанником и велумом, что создает тупиковую ротовую полость. Кроме того, надгортанник в состоянии покоя застревает под слизистой оболочкой, находящейся над велумом. Такая анатомическая конфигурация приводит к тому, что грызуны являются облигатными носовыми дышащими; Таким образом, оральное дыхание у бодрствующих грызунов является признаком респираторной заболеваемости. Однако во время глотания у здоровых грызунов надгортанник выскальзывает из слизистой оболочки и заворачивается над входом в гортань, поскольку гортань поднимается дальше в носоглотку, в сторону от пути болюса. Эти динамические события верхних дыхательных путей могут быть непосредственно визуализированы/оценены с помощью ларингоскопии у здоровых грызунов и моделей дисфункции гортани.
Важно отметить, что мы показали, что, несмотря на отсутствие аспирации во время тестирования VFSS, модели грызунов (например, ятрогенное повреждение RLN) действительно демонстрируют признаки нарушения защиты дыхательных путей гортани (т.е. неполное закрытие гортани) с помощью ларингоскопии, которая является трансляционной для пациентов с аспирацией, связанной с дисфагией. Таким образом, этот протокол ларингоскопии мышей обеспечивает полезную трансляционную платформу для конкретного исследования механизмов защиты дыхательных путей и целевого лечения, которые в настоящее время остаются неуловимыми. Достижение этой цели потребует дальнейшего развития/оптимизации нашего текущего метода, который использует наконечник эндоскопа для обеспечения некалиброванной механической стимуляции слизистой оболочки гортани/глотки для вызова глотания. В настоящее время в нашей лаборатории исследуются более строгие, точно контролируемые методы стимуляции глотания, включая прямую электрическую стимуляцию верхнего гортанного нерва32,41 и химическую (например, лимонную кислоту42) стимуляцию слизистой оболочки гортани/глотки. Дополнительным ограничением этого протокола является лежачее положение грызунов на спине, которое не имитирует бодрствующее и естественное пищевое поведение. Первоначальная разработка протокола включала положение лежа на животе, что привело к ограничению движения нижней челюсти, а также к ограничению видимости полости рта, что заметно затрудняло прохождение эндоскопа. Есть возможность визуализировать гортань на расстоянии с помощью наконечника эндоскопа в области гипофаринкса; Однако этот подход обычно требует ручного втягивания надгортанника, велума и/или языка для лучшей визуализации гортани. Для этой цели мы изготовили различные специализированные устройства ручного втягивания (например, модифицированные зеркала отоскопа, модифицированные наконечники для пипеток). Тем не менее, части гортани обычно остаются скрытыми от глаз, а устройства втягивания могут ограничивать движение гортани, что может быть ошибочно принято за дисфункцию. Кроме того, недавние дополнительные функции эндоскопической платформы (например, наклон Тренделенбурга и вырез между ушными планками для приспособления движения челюсти) могут облегчить тестирование грызунов в положении лежа. Ушные планки и дополнительное тепло являются необходимыми элементами протокола ларингоскопии. Ушные планки препятствуют движению головы во время трансоральных манипуляций с эндоскопом. Гомеотермная система нагрева поддерживает температуру тела в диапазоне от 36 °C до 38 °C, чтобы обеспечить стабильную анестезию и предотвратить гипотермию на протяжении всей процедуры.
Теперь, когда существует методология надежной видеозаписи движения гортани во время дыхания и глотания у грызунов, количественная оценка с высокой пропускной способностью является важным следующим шагом. Поэтому мы продолжаем работу по анализу видео, чтобы определить, какой показатель исхода, сгенерированный нашим специализированным программным обеспечением, может наилучшим образом отличить здоровые состояния от больных, а также выявить изменения с течением времени в ответ на естественное прогрессирование заболевания или лечебные вмешательства. Лучшие кандидаты будут в центре внимания последующих подходов к машинному обучению для ускорения анализа видеоизображений. Важно отметить, что случаи неоптимального качества изображения (например, недостаточное освещение, анатомические структуры вне поля зрения, избыток выделений, скрывающих структуры гортани и т. д.) в настоящее время не поддаются отслеживанию гортани; Тем не менее, этот барьер может быть преодолен в будущем с помощью инструментов машинного обучения. До тех пор первостепенное значение имеет тщательный отбор последовательностей видеокадров, отвечающих критериям анализа отслеживания гортани (как описано в разделе 5 протокола).
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Эта работа была частично профинансирована двумя грантами NIH: 1) грантом Multi-PI (TL и NN) R01 (HL153612) от Национального института сердца, легких и крови (NHLBI) и 2) грантом R03 (TL, DC0110895) от Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств (NIDCD). Наша разработка программного обеспечения для отслеживания движения гортани была частично профинансирована грантом Фонда Култера (TL & Filiz Bunyak). Мы благодарим Кейт Осман, Хлою Бейкер, Кеннеди Хелшера и Золу Стивенсон за отличный уход за нашими лабораторными грызунами. Мы также выражаем признательность Родерику Шлотцхауэру и Честону Калле из MU Physics Machine Shop за их вклад в разработку и изготовление нашей специализированной эндоскопической платформы, а также за стратегические модификации коммерческих эндоскопов и микроманипуляторов в соответствии с нашими исследовательскими потребностями. Наше программное обеспечение для отслеживания движений гортани было разработано в сотрудничестве с доктором Филиз Буньяк и доктором Али Хамадом (факультет электротехники и компьютерных наук Университета Миссури). Мы также благодарим Джима Марнатти из клиники Karl Storz Endoscopy за рекомендации по выбору отоскопа. Наконец, мы хотели бы выразить признательность многочисленным бывшим студентам/стажерам лаборатории Lever, чей вклад послужил основой для разработки нашего текущего протокола ларингоскопии мышей: Марлене Шевчик, Кэмерону Хинкелю, Эбигейл Ровнак, Бриджит Хоупвелл, Лесли Шок, Яну Денингеру, Чендлеру Хэкстону, Мерфи Мастину и Даниэлю Шу.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Atipamezole | Zoetis | Antisedan; 5 mg/mL | Parsippany-Troy Hills, NJ |
Bioamplifier | Warner Instrument Corp. | DP-304 | Hamden, CT |
Concentric EMG needle electrode | Chalgren Enterprises, Inc. | 231-025-24TP; 25 mm x 0.3 mm/30 G | Gilroy, CA |
Cotton tipped applicator (tapered) | Puritan Medical Products | REF 25-826 5W | Guilford, ME |
Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 8/30 | Colorado Springs, CO |
DC Temperature Control System - for endoscopy platform | FHC, Inc. | 40-90-8D | Bowdoin, ME |
Electrophysiology recording software | ADInstruments | LabChart 8 with video capture module | Colorado Springs, CO |
Endoscope monitor | Karl Storz Endoscopy-America | Storz Tele Pack X monitor | El Segundo, CA |
Glycopyrrolate | Piramal Critical Care | NDC 66794-204-02; 0.2 mg/mL | Bethlehem, PA |
Ground electrode | Consolidated Neuro Supply, Inc. | 27 gauge stainless steel, #S43-438 | Loveland, OH |
Isoflurane induction chamber | Braintree Scientific, Inc. | Gas Anesthetizing Box - Red | Braintree, MA |
Ketamine hydrochloride | Covetrus North America | NDC 11695-0703-1, 100 mg/mL | Dublin, OH |
Metal spatula to decouple epiglottis and velum | Fine Science Tools | Item No. 10091-12; | Foster City, CA |
Micro-brush to remove food/secretions from oral cavity | Safeco Dental Supply | REF 285-0023, 1.5 mm | Buffalo Grove, IL |
Mouse-size heating pad for endoscopy platform | FHC, Inc. | 40-90-2-07 – 5 x 12.5 cm Heating Pad | Bowdoin, ME |
Ophthalmic ointment (sterile) | Allergan, Inc. | Refresh Lacri-lube | Irvine, CA |
Otoscope | Karl Storz | REF 1232AA | El Segundo, CA |
Pneumogram Sensor | BIOPAC Systems, Inc. | RX110 | Goleta, CA |
Pulse oximetry - Vetcorder Pro Veterinary Monitor | Sentier HC, LLC | Part No. 710-1750 | Waukesha, WI |
Rat-size heating pad for endoscopy platform | FHC, Inc. | 40-90-2 – 12.5X25cm Heating Pad | Bowdoin, ME |
Sterile needles for drug injections | Becton, Dickinson and Company | REF 305110, 26 G x 3/8 inch, PrecisionGlide | Franklin Lakes, NJ |
Sterile syringes for drug injections | Becton, Dickinson and Company | REF 309628; 1 mL, Luer-Lok tip | Franklin Lakes, NJ |
Surgical drape to cover induction cage for dark environment | Covidien LP | Argyle Surgical Drape Material, Single Ply | Minneapolis, MN |
Surgical tape to secure pneumograph sensor to abdomen | 3M Health Care | #1527-0, 1/2 inch | St. Paul, MN |
Transparent blanket for thermoregulation | The Glad Products Company | Press’n Seal Cling Film | Oakland, CA |
Video editing software | Pinnacle Systems, Inc. | Pinnacle Studio, v24 | Mountain View, CA |
Water circulating heating pad - for anesthesia induction/recovery station | Adroit Medical Systems | HTP-1500 Heat Therapy Pump | Loudon, TN |
Xylazine | Vet One | NDC 13985-701-10; Anased, 100 mg/mL | Boise, ID |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены