최소 침습적 쥐 후두경(Minimally Invasive Murine Laryngoscopy)은 호흡과 삼킴 중 후두 움직임을 클로즈업하여 촬영합니다.

이 프로토콜은 최적화된 마취 요법과 미세하게 조정된 내시경 조작 기술을 사용하여 호흡 및 삼키는 동안 후두의 클로즈업, 방해받지 않는 비디오 이미징을 허용하는 마우스와 쥐를 위한 연속 경구강 후두경 접근 방식을 설명합니다.

후두는 포유류의 필수 기관으로 호흡, 삼키기, 발성의 세 가지 주요 기능을 가지고 있습니다. 광범위한 장애는 후두 기능을 손상시켜 호흡 곤란(호흡 곤란), 삼킴 장애(삼킴곤란) 및/또는 음성 장애(발성곤란)를 초래하는 것으로 알려져 있습니다. 특히 삼킴곤란은 흡인성 폐렴 및 관련 이환율, 재발성 입원 및 조기 사망으로 이어질 수 있습니다. 이러한 심각한 결과에도 불구하고, 후두 기능 장애에 대한 기존 치료법은 불행히도 일반적으로 정상적인 후두 기능을 회복하지 못하는 외과적 및 행동 중재를 주로 목표로 하고 있으며, 따라서 혁신적인 해결책의 시급한 필요성을 강조하고 있습니다.

이 간극을 메우기 위해 우리는 쥐(즉, 마우스 및 쥐) 모델에서 후두 기능 장애를 조사하기 위한 실험적 내시경 접근 방식을 개발하고 있습니다. 그러나 설치류의 내시경 검사는 현재 내시경 기술에 비해 크기가 작고, 상기도의 해부학적 차이, 후두에 최적으로 접근하기 위한 마취의 필요성으로 인해 상당히 어렵습니다. 여기에서는 생쥐와 쥐의 후두 움직임을 클로즈업하고 방해받지 않는 비디오 이미징을 허용하는 새로운 경구강 후두경 접근 방식에 대해 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 정확한 마취 관리(과다 투여를 방지하여 삼킴 및/또는 호흡 곤란 관련 사망의 위험을 없애기 위해) 및 내시경의 미세 조작기 제어(후속 정량화를 위해 단일 연구원이 후두 움직임을 안정적으로 비디오로 기록하기 위해)가 포함됩니다.

중요한 것은 이 프로토콜이 시간이 지남에 따라 동일한 동물에서 수행되어 다양한 병리학적 상태가 특히 후두 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 새로운 장점은 삼키는 동안 기도 보호를 시각화할 수 있는 기능인데, 이는 성문이 시야를 가리는 후두 입구를 통한 외피구 반전으로 인해 인간에게는 불가능합니다. 따라서 설치류는 정상적인 후두 기능을 효과적으로 회복하기 위한 치료법을 발견하는 궁극적인 목적을 위해 정상 후두 기도 보호와 병리학적 후두 기도 보호의 메커니즘을 구체적으로 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다.

후두는 목구멍의 호흡관과 소화관의 교차점에 위치한 연골 기관으로, 음식과 액체(즉, 삼키는 동안)에 비해 공기의 흐름과 방향(즉, 호흡 및 발성 중)을 정확하게 제어하는 밸브 메커니즘으로 기능합니다. 후두에 영향을 미치는 질환은 선천성(예: 후두연화증, 성문하협착증), 종양성(예: 후두 유두종증, 편평세포암), 신경학적(예: 특발성 후두 마비, 뇌졸중, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증) 및 의인성(예: 두경부 수술 중 부주의한 부상) 등 다양한 질환이 후두에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 병인에 관계없이 후두 기능 장애는 일반적으로 호흡곤란(호흡곤란), 발성곤란(음성 장애), 삼킴곤란(삼킴곤란)의 세 가지 증상을 초래하며, 이는 개인의 경제적 및 사회적 복지에 부정적인 영향을 미칩니다 1,2,3,4.

더욱이, 특히 의학적으로 허약한 사람의 삼킴곤란은 흡인성 폐렴(음식물이나 액체가 불완전하게 닫힌 후두를 통해 폐로 빠져나가기 때문에) 및 관련 이환율, 재발성 입원 및 조기 사망으로 이어질 수 있습니다 ^5,6. 이러한 심각한 결과에도 불구하고, 후두 기능 장애에 대한 기존 치료법은 주로 정상적인 후두 기능을 회복시키지 못하는 외과적 및 행동적 중재를 목표로 하고 있으며^{, 1,2,7,8,9,10} 따라서 혁신적인 해결책이 시급히 필요하다는 점을 강조하고 있다. 이 목표를 달성하기 위해 우리는 쥐(즉, 마우스 및 쥐) 모델에서 후두 기능 장애를 조사하기 위한 실험적 내시경 접근 방식을 개발해 왔습니다.

인간 의학에서 후두 기능 장애를 평가하기 위한 황금 표준은 후두경 검사라고 하는 내시경 시각화입니다^11,12. 일반적으로 유연한 내시경을 코를 통과시켜 후두, 특히 성대와 인접한 성대 및 성문하 후두 구조를 검사합니다. 단단한 내시경을 사용하여 구강을 통해 후두를 시각화할 수도 있습니다. 두 접근법 모두 후두 해부학적 구조를 전체적으로 검사할 수 있으며, 호흡, 발성, 기침 및 후두 내전근 반사와 같은 다양한 기도 보호 반사 중 후두 이동성 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다 ^13,14,15,16. 그러나 삼키는 동안 후두는 후두 입구를 덮기 위해 뒤집히기 때문에 후두개에 의해 완전히 가려져 음식물/액체 덩어리를 삼키는 경로로부터 보호합니다. 그 결과, 인간에서는 삼키는 동안 후두 움직임을 직접 시각화할 수 없으므로 다른 진단 방법(예: 형광투시법, 근전도, 전기성조영술)을 사용하여 간접적으로 추론해야 합니다.

이 논문은 가벼운 마취 하에 삼키는 동안 호흡 및 기도 보호를 클로즈업하고 방해받지 않고 이미징할 수 있는 마우스와 쥐를 위한 혁신적인 후두 내시경 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 시중에서 판매되는 다양한 내시경 시스템과 호환되며, 시술 전반에 걸쳐 마취된 설치류를 고정시키는 맞춤형 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다. 중요한 것은 각 실험실의 사용 가능한 자원과 연구 의제에 따라 내시경 플랫폼의 수많은 설계/구성이 실제로 가능하다는 것입니다. 여기서 우리의 의도는 연구자가 연구의 맥락에서 고려할 수 있는 지침을 제공하는 것입니다. 또한, 우리는 이 후두경 프로토콜이 어떻게 후두 기능 장애 및 재생에 대한 우리의 이해에 새로운 통찰력을 촉발할 수 있는 풍부한 객관적인 데이터로 이어질 수 있는지 보여주는 것을 목표로 합니다.

이 쥐 후두경 검사서에 요약된 모든 단계의 결합된 효과는 성체 쥐 후두에 대한 최소 침습적 검사로 이어지며, 이는 동일한 동물에서 반복하여 의인성 손상, 질병 진행 및/또는 기도 보호와 관련된 치료 개입에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 후두 기능 장애를 감지하고 특성화할 수 있습니다. 참고로, 이 프로토콜은 발성과 관련된 후두 기능을 평가하지 않습니다.

쥐 후두경 검사 프로토콜은 승인된 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 프로토콜 및 NIH(National Institutes of Health) 지침을 따릅니다. 100마리 이상의 성체 C57BL/6J 마우스와 50마리 이상의 성체 Sprague Dawley 쥐와 함께 사용하기 위해 개발되었으며, 두 종 모두 성별이 거의 같고 6주-12개월입니다. 더 어리고 작은 설치류에 적응하기 위해 추가 프로토콜 개발이 필요합니다. 동물들은 집단 수용되었다(성별과 배설물에 따라 우리당 최대 4마리의 쥐 또는 2마리의 쥐). 표준 사육장 조건에는 주변 온도(20-26°C), 습도(30%-70%) 및 표준 12시간 광 주기의 엄격한 규제를 통한 정적 케이지가 포함되었습니다. 모든 동물은 매주 케이지를 교체할 때 신선한 강화 재료(예: 오두막/파이프, 치과 치료제, 둥지)를 받았습니다. 음식과 물에 대한 무제한 접근은 아래에 설명된 대로 마취 전 짧은(최대 4-6시간) 음식 제한 기간을 제외하고 제공되었습니다. 수의사와 연구진은 매일 동물들을 모니터링했다.

1. 삼키는 것을 폐지하지 않는 동물 마취

1. 설치류와 함께 작업하는 동안 알레르겐 노출을 최소화하기 위해 적절한 개인 보호 장비(예: 장갑, 마스크)를 착용하십시오.
2. 음식은 내시경 시각화를 방해하거나 시술 중 음식 흡인을 초래할 수 있는 구강과 인두에 음식물의 저류를 최소화하기 위해 마취 전 최대 4-6시간 전에 각 설치류 케이지를 제한합니다.
   참고: 구강 내 음식 보유는 음식이 제한되지 않은 경우 삼킴곤란이 없는 설치류에서 정상적인 발견입니다.
3. 동물의 유도 / 회복을위한 "온난화 스테이션"을 준비하십시오.
   1. 물을 순환하는 가열 패드를 벤치탑 표면에서 37°C로 예열합니다.
   2. 테스트 중인 종에 적합한 크기의 유도/회수 케이지를 선택합니다. 예를 들어, 필터 상단 뚜껑이 있는 마우스 신발 상자 케이지는 마우스와 랫드의 유도/회복에 적합한 크기입니다. 실험 중인 각 동물에 대해 새로운 유도/회복 케이지를 사용하십시오. 단일 케이지를 동일한 동물의 유도 및 회복 케이지로 사용하십시오.
   3. 인덕션/회복 케이지 바닥에 가벼운 흡수성 물질(예: 아스펜 부스러기, 종이 타월, 강아지 패드)을 깔아 마취 유도 및 회복 중에 신체 분비물을 따뜻하게 흡수합니다.
   4. 마취 유도 전에 준비된 케이지(필터 상단 뚜껑 포함)를 30-60분 동안 가열 패드에 완전히 놓습니다.
      참고: 이 미세환경은 유도 및 회복 중에 안정적인 마취 대사를 촉진하기 위해 충분한 보조 열을 제공합니다.
4. 마취 유도 전에 약 30분 동안 예열된 37°C 가열 패드에 동물의 가정용 케이지를 반쯤 놓습니다.
   참고: 시술 전에 보조 열을 제공하면 마취 유도를 앞당길 수 있으며 저체온증으로 인한 마취 대사의 느려지거나 지연된 마취로 인한 우발적인 과다 투여를 방지할 수 있습니다.
5. 종과 체중에 따라 케타민-자일라진(KX) 마취를 준비합니다.
   1. 마우스의 경우: 90mg/kg 케타민과 11mg/kg 자일라진의 혼합물은 남녀 모두의 성인 C57BL/6 배경 마우스에서 경구강 후두경 검사에 충분합니다. 다른 마우스 균주 및 연령에 맞게 복용량을 조정하십시오.
   2. 쥐의 경우: 60mg/kg 케타민과 6mg/kg 자일라진의 혼합물은 남녀 모두의 성인 Sprague Dawley 쥐의 경구강 후두경 검사에 충분합니다. 다른 쥐 균주 및 연령에 맞게 복용량을 조정하십시오.
6. 차가운 액체를 주입할 때 발생하는 동물의 열 손실을 방지하기 위해 37°C 보온 스테이션에서 주사기로 채워진 마취제를 예열합니다.
7. 적절한 크기의 주사기(예: 1mL)와 바늘(예: 26 G1/2)을 사용하여 계산된 KX 용량을 설치류에 주입합니다.
   1. 생쥐의 경우: 피하(SC) 주사를 1회 투여합니다.
      참고: 우리의 경험에 비추어 볼 때, 마우스에 대한 SC 주사는 복강내(IP) 주사에 비해 마취 관련 사망률을 줄이거나 폐지합니다.
   2. 쥐의 경우: 단일 SC 또는 IP 주사를 투여합니다. 원하는 경우, KX 주입 직전에 유도 챔버에서 이소플루란(ISO)(3-5%)으로 쥐를 진정시킵니다.
      알림: KX가 적용될 때까지 짧은 기간(일반적으로 <1분) 동안 자발적인 신체 움직임이 재개될 수 있습니다.
8. 경구강 내시경 검사 중 후두의 시각화를 방해할 수 있는 과도한 타액 분비물을 줄이기 위해 KX 주사 직후 글리코피롤레이트(항콜린제)를 투여하거나 마취 회복 중 상기도를 기계적으로 막을 수 있습니다.
   참고 : 투여 량과 전달 경로는 마우스와 쥐 (0.01-0.02 mg / kg SC)에서 동일하며 효과는 거의 즉각적이며 몇 시간 동안 지속됩니다.
9. 글리코피롤레이트 주사 후, 마취된 설치류를 온난화 스테이션의 예열된 유도 케이지에 놓고 수술용 드레이프로 케이지를 덮어 10분 동안 방해받지 않고 시각적 자극을 최소화하는 어두운 환경을 제공합니다.
   1. 설치류가 초기 KX 투여 후 10분 동안 보행 가능 상태를 유지하면 절차를 종료합니다.
      참고: 추가 마취(KX 또는 케타민 유지)를 제공하려는 시도는 무의미할 수 있습니다.
10. 10분 후, 케타민의 유지 용량(뒷다리 반사가 감소한 경우 초기 용량의 1/4, 뒷다리 반사가 활발한 경우 초기 용량의 1/2)을 투여합니다. 쥐의 경우 SC, 쥐의 경우 SC/IP)를 사용하여 마취를 유지합니다.
11. 후두경 검사 중 각막 건조 및 관련 외상을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
12. 마취된 설치류를 맞춤형 내시경 플랫폼으로 옮겨 후두경 절차를 시작합니다.
    참고: 당사는 내시경 검사가 반드시 필요하지 않은 다양한 설치류 수술 및 전기생리학 접근법과 함께 사용할 수 있는 여러 기능을 갖도록 내시경 플랫폼(그림 1)을 설계했습니다. 따라서 순전히 내시경 용도로 과도하게 제작되었습니다. 해당되는 경우, 이 후두경 프로토콜에 필수적인 기능/구성 요소를 강조할 것입니다.
13. 이 시점부터 전체 절차에 걸쳐 15-20분마다 뒷다리 반사를 확인하고 필요에 따라 최소 20분 간격으로 추가 케타민 유지 용량을 제공합니다. 이 절차는 비교적 짧기 때문에(일반적으로 마취 상태에서 <45분) 초기 유지 투여 후 추가 케타민이 거의 필요하지 않습니다.

2. 후두를 시각화하기 위한 내시경의 경구강 통로

1. 동물을 마취하기 전에 비디오 녹화 기능이 있는 적절한 크기의 내시경을 준비하십시오.
   참고: 우리는 일반적으로 1.9mm 샤프트 직경과 10cm 샤프트 길이를 가진 0도 검이경을 맞춤형 금속 피복(그림 2)과 함께 사용하며, 이는 이 프로토콜 전체에서 사용되는 대표적인 내시경입니다.
   1. 내시경을 광원 및 내시경 기록 시스템에 연결하여 실시간으로 보기 및 최소 30fps (초당 프레임)로 비디오 녹화를 할 수 있습니다.
   2. 최적의 이미지 품질을 위해 카메라의 초점과 화이트 밸런스를 맞춥니다.
   3. 내시경을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.
      참고: 후두 움직임 추적을 위해 내시경을 내시경 플랫폼의 마이크로 매니퓰레이터에 고정하여 안정적인 비디오 캡처를 위한 정확한 내시경 제어를 허용합니다.
2. 설치류를 가열된 플랫폼에서 등쪽 누운 상태로 고정합니다. 이어바(ear bar)로 머리를 고정하여 머리를 고정하고 고정시킵니다.
   1. 설치류의 머리가 이어바에서 미끄러지지 않고 위/아래(좌우는 아님)로 자유롭게 회전할 수 있는지 확인합니다. 이러한 자유도는 경구강 삽입과 내시경의 전진이 후두에 도달하는 것을 용이하게 합니다.
3. 내시경 검사 중 호흡, 삼킴 및 삼킴-호흡 협응에 대한 동기식 전기생리학적 기록이 필요한 경우 이를 위해 적절한 센서를 적용하십시오(그림 3).
   1. 수술용 테이프를 사용하여 호흡기 센서를 복부 정중선에 고정하고 즉시 자이포이드 과정으로 꼬리를 맞춥니다.
   2. 감염을 방지하기 위해 바늘 전극을 삽입하기 전에 알코올 물티슈로 피부를 면도하고 청소/소독하십시오.
   3. 근전도(EMG) 바늘 손상을 방지하기 위해 바늘 전극을 삽입하기 전에 22G 바늘을 사용하여 피부를 통해 작은 구멍을 뚫습니다.
   4. 멸균 동심원 EMG 바늘 전극(예: 25mm x 0.3mm/30G)을 정중선의 정신하피를 통해 혀 기저부(예: 바늘 삽입 깊이에 따라 게니오설수스 또는 게니오히오이드 근육)에 삽입합니다.
   5. 접지 전극(예: 27G 스테인리스강)을 엉덩이(양쪽)에 피하로 삽입합니다.
   6. 호흡 센서와 EMG 바늘 전극을 전기 생리학 기록 시스템(예: 동기식 비디오 캡처 기능이 있는 생체 증폭기 및 데이터 수집 시스템)에 연결하고 진행하기 전에 두 채널에서 깨끗한 전기 생리학 신호를 확인합니다.
   7. 전극 연결 부위를 알루미늄 호일로 감싸 전기 노이즈를 방지하고 해당 전기 생리학적 기록에서 신호 대 잡음비를 개선합니다.
   8. 두 채널에서 깨끗한 전기생리학 신호를 얻기 위해 필요에 따라 호흡 센서 위치와 EMG 바늘 전극 깊이를 조정합니다. 이 프로토콜을 따르려면 호흡에 1k 샘플링 속도를 사용하고 EMG에 대해 20k 샘플링 속도 및 대역 통과 필터(예: 150-3,000Hz)를 사용합니다.
4. 설치류의 몸통(및 호흡 센서)을 투명한 담요로 덮어 체온 조절을 용이하게 하는 동시에 호흡 중 복부 움직임을 시각화할 수 있습니다. 뒷다리와 하복부는 반사 검사 및 케타민 유지 관리 재투여 중에 접근할 수 있도록 자유롭게 노출시킵니다. 담요가 호흡 중 복부 움직임을 제한하지 않는지 확인하십시오.
5. 경구강 내시경 검사를 진행합니다(그림 4).
   1. 턱에 수직인 중앙 앞니 뒤에 가늘어지고 솜 끝이 있는 어플리케이터를 삽입하여 설치류의 입을 엽니다. 면봉을 혀의 등 표면에 대고 회전시켜 입에서 살짝 돌출시킵니다.
6. 가벼운 손가락 그립을 사용하여 내시경 끝을 구강에 삽입하면서 혀를 입에서 중앙 앞니의 한쪽으로 부드럽게 당깁니다(그림 4A, B).
   1. 설치류의 눈에 잠재적으로 해를 끼치지 않도록 내시경 팁을 입에 삽입한 후 광원을 켜십시오.
   2. 내시경을 움푹 들어간 혀와 같은 쪽의 앞니 옆으로 삽입합니다. 중앙 앞니는 내시경이 정중선에 삽입되는 것을 방지하므로 이러한 측면 삽입 방법이 필요합니다.
7. 내시경 검사(및 전기 생리학) 기록 시스템을 시작합니다. 사후 분석을 위한 충분한 데이터를 확보하거나 연구의 필요에 따라 선택한 시간에 기록하기 위해 전체 절차에 걸쳐 지속적으로 기록합니다.
8. 내시경을 조심스럽게 전진시켜 구인두를 시각화하고, 입천장을 긁거나 혀에 과도한 압력을 가하여 부상을 입을 수 없도록 주의하십시오.
   1. 절차가 진행됨에 따라 흡인 위험을 최소화하기 위해 적절한 크기의 면봉(예: 1.5mm 마이크로 브러시)을 사용하여 눈에 보이는 음식물 입자 및/또는 과도한 타액 분비물을 제거합니다.
   2. 하인두가 모니터의 시야 내 중앙에 배치되고 주요 해부학적 구조를 식별할 수 있을 때까지 내시경 위치를 계속 전진/조정합니다(그림 4C). 이 시점에서 모든 구조는 카메라 시야 내에서 해부학적으로 정렬/대칭으로 나타나야 합니다. 그렇지 않으면 필요에 따라 내시경의 위치를 조정하십시오.
   3. 내시경 전진 중 유발된 턱/혀의 움직임을 관찰하십시오. 없는 경우 추가 케타민 재투여 없이 진행하십시오. 존재하는 경우 두 번째 케타민 유지 용량(케타민 초기 용량의 1/4 - 1/2)을 투여하고 진행하기 전에 효과가 나타날 때까지 약 5분 동안 기다립니다. 과잉 진정 및 삼킴 폐지를 피하기 위해 이전 주사 후 최소 20분이 경과한 경우에만 재복용하십시오.
   4. 시술 내내 5분마다 설치류의 혀를 검사하여 허혈을 나타내는 짙은 변색이 있는지 확인합니다. 이를 방지하려면 필요에 따라 내시경의 위치를 조정하십시오.
9. 내시경과 함께 삽입된 마이크로 프로브(예: 금속 주걱)로 벨럼에 가벼운 압력을 가하여 연구개와 후두개를 분리하여 멀리서 후두를 시각화합니다(그림 4D). 가해진 압력으로 인해 연조직이 손상되거나 내시경 샤프트가 영구적으로 구부러지거나 손상될 수 있으므로 디커플링을 위해 내시경 팁을 사용하지 마십시오.
   참고: 인간과 달리 쥐 후두는 경구강 관점에서 직접 볼 수 없습니다. 대신, 후두개는 벨럼 위에 있는 점막막 아래에 기계적으로 갇혀 있으며, 이로 인해 막다른 골목 하인두 공간이 형성됩니다. 벨럼에 가벼운 압력을 가하면 벨라막에서 후두개가 방출되어 후두를 부분적으로 볼 수 있습니다.
10. velum/epiglottis 디커플링 동안 유발된 제비를 관찰합니다.
    1. 제비를 경구개 쪽으로 갑작스럽고 짧은 후방 혀 변위로 식별합니다. 이 움직임은 일반적으로 짧은 하악 움직임/함몰과 동시에 발생하며, 따라서 내시경 시야에서 뒤쪽 혀가 쉽게 보이지 않을 때 삼킴을 식별하기 위한 대용품을 제공합니다.
    2. 또한 전기생리학 기록에서 짧은 무호흡 에피소드와 함께 혀 EMG 파열 활동을 통해 제비를 식별하며, 둘 다 내시경 비디오의 성문 폐쇄 이벤트와 동기화되어 발생합니다.
       1. 마취가 불충분하다는 징후(즉, 너무 가볍음)를 나타내는 급격한 반복 삼킴의 경우 다시 투여하고 진행하기 전에 ~5-10분을 기다립니다. 이전 케타민 유지 주사 후 최소 20분 동안 기다렸다가 과잉 진정 및 삼킴 폐지를 방지하십시오.
       2. 마취 깊이는 velar-epiglottic 디커플링 중에 소수의 제비만 유발될 때 최적이라고 간주합니다.
       3. 삼키는 것이 폐지되면 마취가 너무 깊어 후두 기도 보호를 평가할 수 없습니다. 이 경우 후두의 클로즈업 시각화를 진행하기 전에 케타민 대사가 나타날 때까지 5-10분 정도 기다립니다.

3. 호흡 중 후두 움직임과 삼킴을 유발하는 클로즈업, 방해받지 않는 비디오 녹화

참고: 호흡, 삼킴 및 삼킴-호흡 조정에 대한 동기식 전기 생리학적 기록도 옵션입니다.

1. 후두를 시야 중앙에 유지하면서 벨럼과 후두개 사이의 내시경을 천천히 전진시킵니다(그림 5A-C).
   알림: 내시경 팁은 힘 없이 벨라-에피글로틱 개구부를 쉽게 통과합니다. 그렇지 않으면 동물에게 잠재적인 해를 끼치지 않도록 절차를 중단하십시오. 멀리서 후두를 시각화할 수 있으며, 내시경 끝은 하인두에 있습니다. 그러나 이 접근법은 일반적으로 후두의 시각화를 향상시키기 위해 후두개, 벨럼 및/또는 혀를 수동으로 후퇴해야 합니다. 그러나 후두의 일부는 일반적으로 시야에서 가려져 있으며 수축 장치는 후두 움직임을 제한할 수 있으며, 이는 기능 장애로 오인될 수 있습니다.
2. 내시경을 계속 진행하여 단일 시야에서 후두의 전체 복부-등쪽 및 측면 치수를 방해받지 않고 클로즈업하여 볼 수 있습니다(그림 5C).
   참고: 복부 커미셔(ventral commissure)는 후두개염(epiglottis)에 의해 막힐 수 있으며, 특히 더 어리거나 작은 마우스에서 그렇습니다. 이러한 경우, 복부 관절을 시각화하기 위해 내시경 끝을 보다 공격적으로 조작하려고 하면 후두 움직임이 제한될 수 있으며, 이는 기능 장애로 오인될 수 있습니다. 또한 후두 공기 흐름을 차단하여 질식을 유발할 수 있습니다.
3. 설치류가 각 호흡 주기 동안 숨을 들이쉬고(성문 확장) 숨을 내쉴 때(성문 좁아짐) 후두의 진동 운동을 관찰합니다.
   참고: 후두/성문 운동의 속도와 크기는 마취 깊이에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나 성문 갭(즉, 왼쪽/오른쪽 아티테노이드와 성대 사이의 공기 공간)은 일반적으로 건강한 설치류의 호흡 주기 전반에 걸쳐 볼 수 있습니다.
   1. 현저한 성문 협착이 관찰되면 상기도를 통한 공기 흐름이 방해받지 않도록 내시경 위치를 조정합니다. 예를 들어, 비강기도의 연조직을 막을 수 있는 벨럼에 압력을 가하지 마십시오. 또한 후두 공기 흐름을 차단하여 질식할 수 있는 성문 공간에 내시경 팁을 삽입하지 마십시오. 드문 경우지만 호흡이 멈추는 경우, 내시경을 제거한 후 흉골 중간 흉부 압박(한 손가락 사용) 또는 양압 환기(소형 "소생술 백 사용")를 여러 번 실시합니다.
4. 사후 평가 목적으로 30-60초 동안 후두 호흡 움직임을 비디오로 기록합니다.
5. 후두를 클로즈업한 상태에서 후두 입구 내의 내시경 팁을 약간 조정하여 벨럼 및/또는 후두개 위에 있는 점막에 기계적 자극을 가하고 최적으로 마취된 설치류에서 삼키는 것을 유발합니다.
   1. 내시경 팁의 미세 조정(즉, 모든 방향으로 ~1mm)을 사용하여 점막 손상 및/또는 기도 폐쇄를 방지합니다.
   2. 눈에 보이는 턱 함몰, 혀 EMG 파열 활동, 호흡 흔적에서 볼 수 있는 짧은(<1/2초) 무호흡과 동시에 발생하는 갑작스러운 성문 폐쇄 사건으로 쉽게 식별할 수 있는 유발된 제비를 관찰하십시오.
      참고: 턱의 움직임이 동시에 발생하지 않는 성문 폐쇄 사건이 발생할 수 있습니다. 그러나 이러한 경우 성문 폐쇄는 일반적으로 불완전합니다. 우리는 이것이 마취가 사라지기 시작하면서 나타나는 다른 기도 보호 반사(예: 후두 내전근 반사)일 수 있다고 의심합니다. 그러나 추가 조사가 필요한 드물거나 일관성 없는 경우입니다.
   3. 동물당 5-10마리의 제비가 불러오고 비디오가 녹화될 때까지 반복합니다. 삼킴이 없어지면 내시경을 제거하고 케타민 대사가 일어날 때까지 5-10분 정도 기다렸다가 계속 진행하십시오.
6. 내시경을 구인두로 조심스럽게 집어넣되 제거하지는 말고 시야에서 하인두를 중앙에 두어 후두개와 벨럼을 시각화합니다.
7. 마이크로 면봉을 사용하여 혀 바닥에 가벼운 압력을 가하여 벨라막 아래의 후두개염을 삼키고 다시 갇히게 함으로써 코 호흡 재개를 위해 벨럼과 후두개를 다시 결합합니다. 몇 번의 시도 내에 재결합이 발생하지 않으면 후두 손상 위험을 피하기 위해 재결합 없이 마취 회복을 진행하십시오.
8. 내시경 검사(및 전기 생리학) 기록을 중지합니다.
9. 식염수를 적신 면봉을 사용하여 혀와 중앙 앞니를 적시고 혀를 구강 내의 해부학적 위치로 되돌립니다.
10. 이어바를 분리하고 설치류에서 온도 프로브, 호흡 센서 및 EMG 전극을 제거하여 마취 회복을 진행합니다.

4. 마취 회복

1. 마취에서 회복하기 위해 "보온 스테이션"의 예열된 회복 케이지(즉, 유도 케이지와 동일)에 동물을 놓습니다.
2. 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 다시 바르십시오.
3. 체액 수화를 위해 데운 식염수 SC를 투여합니다: 쥐의 경우 최대 5mL, 마우스의 경우 최대 0.5mL.
4. 자일라진 역전을 위해 아티파메졸 SC를 투여하고 호흡 드라이브를 증가시키십시오: 쥐와 쥐의 경우 1-2mg/kg.
   1. 아티파메졸 2mg/kg으로 시작한 다음 즉시 설치류의 등과 위를 따라 수동으로 자극하여 회복을 가속화합니다.
      참고: 이 방법을 사용하면 일반적으로 1-3분 이내에 자발적인 머리 움직임이 시작됩니다. 그러나 보행 상태로 복귀하는 데는 개인차로 인해 KX 마취 하에 후두경 검사 후 일반적으로 평균 2시간(1시간에서 5시간 사이)이 소요됩니다.
   2. 빈번한 수동 자극을 제공함에도 불구하고 마취 회복 후 처음 15-30분 이내에 증가하지 않고 자발적인 신체 움직임이 감소하는 경우 1mg/kg(첫 번째 주사 후 최소 15분)으로 추가 아티파메졸 투여량을 제공합니다.
   3. 자발적 활성이 계속 감소하는 경우 독사프람(쥐 및 마우스의 경우 5mg/kg IP) 투여를 진행합니다. 자발적인 움직임이 나타날 때까지 10-15분 간격(최대 5회 투여)으로 이 "응급 구조" 에이전트를 다시 투여합니다. 설치류가 시사 상태로 남아 있는 경우, 승인된 안락사 방법(예: 케타민 과다 투여 후 참수와 같은 2차 방법)을 사용하여 동물을 안락사시킵니다.
5. 15-20분 간격으로 회복 중인 설치류를 면밀히 모니터링하여 호흡 상태, 이동성 및 체온 조절의 부정적인 변화를 감지하고 필요에 따라 개입(예: 수동 자극, 산소 보충, 열 담요, 아티파메졸 또는 독사프람 주사)을 제공합니다. 개입이 필요한 설치류에 대해 더 자주 모니터링합니다.
   1. KX 마취 회복 시간이 긴 설치류에 대해 필요에 따라 10분 간격으로 보조 산소(예: ISO 없이 가열된 유도 챔버에서 1-2L/분)를 제공합니다. 또는 동물의 등쪽과 배쪽 표면을 따라 자주 자극을 가하여 SpO₂ 수준(>94%)을 정상화합니다.
   2. 회복 중인 케이지 동료를 동일한 회복 케이지(케이지당 최대 2마리의 설치류)에 배치하여 자발적 활동을 증가시키고 더 빠른 회복을 촉진합니다.
6. 설치류는 회복 케이지 주위를 자발적으로 이동할 수 있을 때 따뜻한 집 케이지로 되돌려 보냅니다.
   1. 표준 음식과 물병을 가정용 케이지에 다시 넣으십시오. 질식/흡인 위험을 최소화하기 위해 마취가 아직 끝나가는 동안 음식/물에 접근할 수 있는 특별한 편의를 제공하지 마십시오.
   2. 가정용 케이지 활동을 관찰하고 보행을 방해하는 장애물(예: 오두막, PVC 파이프)을 제거합니다.
   3. 다음 12-16시간(즉, 밤새) 동안 홈 케이지를 반은 켜고 반은 온난화 스테이션에서 떨어뜨립니다.
      알림: 보조 가열을 조기에 중단하면 저체온증으로 인한 사망을 초래할 수 있습니다.
7. 다음 날 아침에 표준 상태 점검을 수행합니다. 정상/기준선 활동이 재개되면 동물, 신체 기능(예: 체온 조절, 식사, 음주, 소변, 배변) 및 안정적인 체중(즉, 유지 또는 증가)을 일상적인 일상적인 건강 모니터링을 통해 표준 사육장 상태로 되돌립니다. 드물게 설치류의 활동량, 신체 기능 또는 체중이 감소하는 경우 하루 더 보충 열을 계속하십시오.
   참고: 쥐의 경우 포르피린 염색이 마취 회복 기간 ~3-6시간 후에 양쪽 눈 주위에 갑자기 나타나는 것이 일반적입니다. 염색은 일반적으로 24시간 이내에 해결됩니다.

5. 호흡 대 삼킴 중 후두 움직임의 객관적인 정량화

1. 프레임별 분석 기능이 있는 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 내시경 비디오를 볼 수 있습니다.
   1. 동물당 10-20초 동안 자발적 호흡을 대표하는 에피소드를 하나 이상 식별합니다.
   2. 동물당 3-5개의 대표적인 제비 이벤트를 식별합니다.
   3. 선택한 호흡 및 삼킴 에피소드/이벤트가 다음 분석 기준을 충족하는지 확인합니다: 모든 후두 구조/경계가 보이는 카메라 시야 중앙에 있는 후두(즉, 벨럼, 후두개 또는 과도한 타액 분비물에 의해 가려지지 않음), 충분한 조명(즉, 모든 후두 구조/경계를 볼 수 있음), 카메라 모션 아티팩트가 없음(즉, 내시경이 움직이지 않음).
2. 주관적 및/또는 객관적 접근 방식을 사용하여 식별된 호흡 및 삼킴 에피소드/사건을 분석합니다.
   1. 주관적 분석의 경우: 리커트 척도를 사용하여 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 실시간 및 프레임별로 보는 동안 후두 움직임을 주관적으로 점수를 매깁니다. 이 프로토콜을 따르려면 -2에서 +2 사이의 확장된 리커트 척도를 사용하며, 여기서 음수 값은 예상과 반대 방향의 후두 움직임을 나타냅니다. 삼킴 중 후두 기도 보호를 추정하며, 여기서 0 = 성문 갭 크기의 감소 없음(즉, 후두 기도 보호 없음), 1 = 성문 갭 감소(즉, 불완전한 기도 보호), 2 = 성대 사이의 작은 복부 성문 간격(즉, 완전한 기도 보호)과 함께 아티노이드의 완전한 내전, 음수 값은 역설적인 후두 움직임을 나타냅니다.
      참고: 0에서 2 사이의 리커트 척도는 설치류 연구에서 일반적으로 사용되며, 여기서 0 = 움직임 없음, 1 = 일부 움직임, 2 = 정상 움직임 17,18,19,20,21,22. 그러나 이 척도는 재발성 후두 신경(RLN) 손상 후 자주 발생하는 역설적 후두 운동을 고려하지 않는다¹⁰.
   2. 객관적 분석을 위해: 4개의 주요 비디오 프레임을 식별하십시오 - 1) 후두 내전이 시작되기 직전의 나머지 프레임(즉, 성대가 내전을 하기 전의 프레임), 2) 성대가 내전을 완료한 프레임, 3) 성대가 외전을 하기 직전의 프레임(#2와 중복될 수 있음), 4) 성대가 완전히 외전되어 호흡을 재개하기 위해 휴식 위치로 돌아가는 프레임. 이 4개의 키 프레임의 타임스탬프를 사용하여 성대 내전(프레임 1에서 프레임 2), 성문 폐쇄(프레임 2에서 프레임 3), 성대 외전(프레임 3에서 프레임 4) 및 총 삼킴 시간(프레임 1에서 프레임 4)을 계산합니다. 대안적으로, 다른 기존 상용 소프트웨어(²³)를 사용하여 스틸 프레임 이미지^(17,18,24)를 사용하여 최대 외전 및 최대 내전 동안 성문 각도(즉, 배쪽의 아티테노이드 사이 또는 성대 복부 사이)를 측정합니다. 최소 두 명의 훈련된 검토자가 맹검 방식으로 이 프로세스를 독립적으로 수행하고, 검토자 간의 불일치를 식별하고, 각 불일치에 대해 공동 합의에 도달하도록 합니다.
      참고: 우리는 이전에 설치류와 인간에서 상용 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 성문 폐쇄 타이밍 이벤트(즉, 기도 보호 반사 중)에 대한 이 수동 프레임별 분석을 수행했습니다¹⁴. 그러나 이 접근 방식은 비효율적이며 후두 운동 역학의 제한된 정량화만 제공합니다. 우리는 현재 호흡 및 기도 보호 반사 중 후두 움직임에 대한 보다 광범위한 객관적 정량화를 수행하기 위해 자체 제작 후두 추적 소프트웨어를 사용하고 있습니다 22,25,26,27,28,29,30. 이 소프트웨어는 좌측 및 우측 후두 움직임의 거리(진폭) 및 타이밍(주파수)을 객관적으로 정량화하기 위한 자동화된 프레임별 추적 기능을 갖추고 있습니다. 우리는 이러한 매개변수를 사용하여 호흡, 삼킴 및 기타 기도 보호 반사(예: 후두 내전근 반사) 동안 후두 기능 장애(예: 성문각 최대/최소/범위, 후두 운동 대칭 및 동기화)를 감지/정량화하기 위한 다양한 동작 기반 측정을 도출합니다. 이 소프트웨어는 아직 개선 중이며 아직 상업용/공개되지 않았습니다.

이 쥐 후두경 프로토콜을 성공적으로 사용하면 그림 6과 같이 건강한 상태와 질병 상태에서 자발적 호흡 및 삼킴 중에 후두를 클로즈업하여 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 동일한 설치류에서 여러 번 반복되어 시간 경과에 따른 후두 기능/기능 장애를 조사할 수 있습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이, RLN 손상에 대한 쥐 수술 모델(아직 발표되지 않은 데이터)에서 자연 회복 패턴을 조사하기 위해 이 후두경 프로토콜을 4개월 동안 6회 성공적으로 반복했습니다. KX 대신 ISO 마취를 사용하려는 시도는 이전 실험^31,32에서 설명한 바와 같이 삼킴을 유발하기 위해 오른쪽 상후두 신경에 직접적인 전기 자극을 받는 설치류에서 삼킴(그림 8)을 거의 폐지하는 결과를 낳았습니다. 이것은 ISO가 2%만큼 낮을 때 발생했습니다. ISO를 이 수준 이하로 낮추면 자발적인 움직임이 다시 발생하므로 피할 수 있습니다. ISO의 이러한 교란 효과는 이 프로토콜의 성공적인 사용을 위한 마취 선택의 중요성을 강조합니다.

내시경 이미지 품질이 양호한 경우 그림 9와 같이 모션 추적 소프트웨어를 사용하여 호흡과 삼킴의 대표적인 비디오 클립을 분석할 수 있습니다. 당사의 맞춤형 후두 추적 소프트웨어에 의해 자동으로 생성된 대표적인 결과 측정치는 표 1에 나열되어 있습니다. 여러 호흡 및 삼킴 관련 결과 측정은 동일한 대표 쥐에서 기준선과 RLN 후 교차 간에 현저하게 달랐습니다. 호흡 중 성문각은 기준선과 RLN 절개 후 사이에서 유사했지만, 호흡 중 우/좌 후두 운동 진폭(즉, 평균 운동 범위 비율 또는 MMRR)과 빈도(개폐 주기 비율 또는 OCCR)의 비율은 절제 후 더 낮았습니다. 마찬가지로, RLN 절제 후 삼키는 지속 시간이 더 짧았습니다.

동기 전기생리학적 기록(예: 호흡기 기압도 및 게인설 EMG)을 획득하면 후두경 데이터와의 상관 관계에 대해 몇 가지 추가 객관적인 결과 측정을 정량화할 수 있습니다. 본 연구에서 관심을 끄는 전기생리학 기반 결과 측정의 예가 그림 10에 요약되어 있습니다. 우리는 현재 이러한 결과 측정의 자동화된 정량화를 위한 알고리즘을 개발하고 있습니다.

그림 1: 쥐 내시경 플랫폼. (A) 맞춤형 쥐 내시경 플랫폼의 측면 및 (B) 평면도가 표시되어 있으며 필수 구성 요소가 표시되어 있습니다. 발열 패드 아래의 탁상은 크기를 조절할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 쥐와 함께 사용되는 탁상과 발열 패드 크기이며, 더 작은 발열 패드(표시되지 않음)를 수용하는 마우스 크기의 탁상이 노출되도록 쉽게 제거할 수 있습니다. 맞춤형 어댑터는 플랫폼 베이스에 부착된 micromanipulator에 내시경을 고정합니다. 이 전략적 설계를 통해 내시경 시술 중에 부주의하거나 제어되지 않은 내시경 동작으로 인해 동물이 부상을 입을 위험 없이 전체 플랫폼을 하나의 단위로 이동할 수 있습니다. micromanipulator를 사용하면 x(왼쪽/오른쪽), y(앞/뒤), z(위/아래), y(피치) 및 z(요)를 중심으로 회전하는 등 여러 방향으로 내시경 팁을 전체적으로 미세 조정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 쥐 후두 내시경을 위한 검이경 및 맞춤형 칼집. (A) 상업용 검이경의 분해된 구성 요소 및 쥐 후두경 검사를 위한 어댑터가 있는 맞춤형 스테인리스 스틸 칼집. (B) 조립 시 검이경 팁은 금속 피복을 넘어 1mm 확장되지만 필요에 따라 최대 5mm까지 조정할 수 있습니다. 이 전략적인 설계는 좁은 검이경 끝이 설치류의 후두 입구로 들어가는 것을 용이하게 하며, 약간 더 큰 직경(2.4mm)의 금속 덮개는 호흡과 삼키는 동안 전체 후두를 최적으로 시각화할 수 있도록 벨럼과 후두개를 충분히 열어 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 내시경 검사 중 최소 침습적 전기생리학적 기록. 호흡 센서는 설치류의 복부에 테이프로 붙입니다. EMG 전극은 피부를 통해 혀의 genioglossus muscle으로 삽입됩니다. 그리고 지상 전극이 엉덩이에 피하로 삽입됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 내시경 검사와 동기화하여 삼킴, 호흡 및 삼킴-호흡 협응을 조사할 수 있습니다. 피부는 전극 삽입 부위에서 면도하고 청소/소독합니다. 노란색 별 = 전기 생리학적 기록에서 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 전극 리드 연결 부위를 감싸는 알루미늄 호일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 멀리서 후두를 시각화하기 위한 경구강 내시경 검사. (A) 가벼운 손가락 그립으로 혀를 부드럽게 집어넣은 후, 내시경을 혀와 붉은 별 위치(즉, 내시경 축과 해부학적 정렬을 유지하기 위해 움푹 들어간 혀와 같은 쪽)의 혀와 중앙 앞니 사이에 삽입합니다. (B) 내시경이 경구개를 지나 진행됨에 따라 (C) 후두개와 벨럼이 시야에 들어옵니다. (D) 성문을 시각화하기 위해, 성문과 후두개는 성문 표면에 압력을 가하여 "분리"되어야 합니다(이미지 C에서 검은색 윤곽선이 있는 별의 위치에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 후두의 클로즈업 내시경 시각화. (A) 내시경 팁은 분리된 벨럼과 후두개(검은색 윤곽이 있는 별의 위치) 사이의 미세 조작기 제어를 통해 부드럽게 안내됩니다. 내시경이 진행됨에 따라 (B) 후두가 시야에 들어오고 성문 공간(노란색 별)이 미세 조작기 조정을 통해 카메라 시야의 중앙에 배치됩니다. (C) 내시경의 지속적인 미세 조작기 전진은 후두의 전체 복부-등쪽 및 측면 치수를 시각화하는 결과를 낳습니다. 약어: VC = 후두의 복부 커미셔어(즉, 성대 사이의 복부 접합점); DC = 후두의 등쪽 commissure (즉, arytenoids 사이의 등쪽 접합점); VF = 성대; A = 아리테노이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 호흡과 삼킴 중 쥐 후두의 시각화. 우측 RLN의 수술 절개 전과 후(D-F) 성인 Sprague Dawley 쥐(A-C)의 호흡 및 삼킴 중 후두 움직임을 묘사한 대표적인 내시경 이미지. RLN 손상 후 후두의 휴식 자세는 (A) 기준선에 비해 변하지 않은 것으로 나타납니다(D). (B,E) 최대 흡기 동안에는 RLN 손상 후 후두 비대칭이 분명해집니다. 성문 공간(노란색 별)을 확대하기 위해 두 아리테노이드가 모두 외전하는 대신, (B) 기준선에서 볼 수 있듯이 (E) 동측(오른쪽) 아리테노이드(검은색 별표) 및 성대는 RLN 손상 후 호흡기 주기 전반에 걸쳐 고정된 것처럼 보입니다. 우측 비대칭은 삼키는 동안에도 분명합니다. (C) 기준선에서, 아리테노이드는 삼키는 동안 정중선에 근접하여 성대 사이에 작은 복부 성문 간격을 남깁니다. (F) RLN 손상 후, 동측 아리테노이드와 VF는 삼키는 동안 역설적으로(즉, 영향을 받지 않은 쪽, 빨간색 화살표와 같은 방향으로) 움직여 복부에서 후두까지 확장되는 큰 성문 간격(노란색 별)을 남깁니다. (F) 이 이미지는 의인성 RLN 손상의 랫트 모델에서 후두 기도 보호 손상의 직접적인 증거를 제공합니다. (씨,여) 후두는 삼키는 동안 내시경에 더 가깝게 이동하며, 이는 후두개와 벨럼이 더 이상 카메라 시야에서 보이지 않는 것으로 표시됩니다. 검은색 화살표는 정상적인 후두 운동 방향을 나타내고 빨간색 화살표는 역설적 움직임을 나타냅니다. 노란색 별 = 성문 공간. 약어: VFs = 성대; A = 아리테노이드; RLN = 재발성 후두 신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 연속 후두경을 사용하여 의인성 RLN 손상의 쥐 모델에서 호흡 및 삼킴 중 후두 기능 장애를 조사합니다. -2에서 +2 범위의 리커트 척도를 사용하여 4개월 동안 8마리의 성체 Sprague-Dawley 쥐의 후두 운동 거리와 방향을 추정했습니다. 기준선 후두경 검사 후, 쥐는 우측 RLN을 절제하는 수술을 받은 후 수술 후 1주일에 연속 후두경 검사를 받은 다음 수술 후 1개월에서 4개월 사이에 1개월 간격으로 다시 시행했습니다. 8마리의 쥐 모두 시술에서 살아남았으며, 따라서 연속 후두경 검사에 대한 마취 요법의 효과를 입증했습니다. (A) 호흡 중 후두 움직임을 정량화하기 위해 실시간 및 프레임별/슬로우 모션으로 비디오를 분석했으며, 여기서 0 = 움직임 없음, 1 = 약간의 움직임, 2 = 온전한(왼쪽) 쪽과 비교한 영향 받은 쪽(오른쪽)의 정상 움직임 거리. (B) 삼킴의 경우, 성문 갭 크기는 다음과 같이 추정되었습니다: 0 = 성문 갭 크기의 감소 없음(즉, 후두 기도 보호 없음), 1 = 성문 갭 일부 감소(즉, 불완전한 기도 보호), 2 = 성대 사이의 작은 복부 성문 갭(즉, 완전한 기도 보호)만 있는 아티테노이드의 완전한 내전. 호흡과 삼킴에 대한 음수 값은 예상과 반대 방향의 후두 움직임을 나타냅니다(즉, 역설적). RLN 부상 후에는 호흡과 삼킴 모두에 부정적인 영향을 미쳤습니다. 흥미롭게도, 후두 기도 보호는 1 WPS 시점에서는 (역설적이긴 하지만) 완전했지만, 그 이후에는 보호가 없는 상태에서 불완전한 보호에 이르기까지 악화되었습니다. 약어: WPS = 수술 후 주; MPS = 수술 후 개월; RLN = 재발성 후두 신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 설치류에서 ISO에 의해 삼킴이 억제됨. (A) ISO 마취 상태에서 후두 내시경 검사를 받는 설치류의 이미지로, 이러한 목적을 위해 설계된 맞춤형 ISO 전달 시스템의 라벨이 부착된 구성 요소가 있습니다. 이 혁신적인 접근 방식의 주요 주의 사항은 ISO에 대한 직원 노출의 위험입니다. (B) 이 접근 방식의 또 다른 단점은 삼킴의 ISO 억제입니다. 이 나란히 있는 상자 그림과 산점도는 삼킴을 유발하기 위해 오른쪽 상후두 신경에 직접적인 전기 자극을 받은 마우스(그룹당 9명)에서 ISO와 KX 마취의 효과를 비교하는 미발표 데이터를 요약합니다. 여기에 표시된 것은 20Hz 자극의 20초 트레인과 10초의 휴식으로 구성된 5분 시험 동안 유발된 제비의 수입니다. KX와 비교했을 때, ISO로 마취된 마우스(최저 2%)는 삼키는 횟수가 현저히 적었고(p < 0.001, 독립 샘플 t-test), 4/9 마우스에서는 삼킴이 폐지되기도 했습니다. 생쥐와 쥐를 대상으로 한 비수술적 실험에서도 유사한 결과가 나왔습니다(데이터는 표시되지 않음). 약어: ISO = 이소플루란; KX = 케타민-자일라진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 추적 소프트웨어를 사용한 쥐 후두 움직임의 객관적 정량화. 기준선에서 쥐의 호흡과 RLN 손상 후를 보여주는 그림 6 의 동일한 이미지가 여기에 나와 있으며, 맞춤형 소프트웨어에 의해 후두 모션 추적 라인이 추가되었습니다. 나머지 비디오 프레임에서 왼쪽(파란색 선) 대 오른쪽(빨간색 선) 후두 움직임을 자동으로 추적하기 위해 아테노이드의 내측 경계를 따라 첫 번째 비디오 프레임에 추적 선을 수동으로 추가했습니다. 2.5초 비디오 클립에서 맞춤형 소프트웨어로 생성된 해당 후두 모션 그래프는 (A,D) 후두 휴식 자세, (B,E) 흡기 중 최대 성문 간격, (C,F) 삼킴 중 성문 폐쇄에 해당하는 레이블과 함께 개별 왼쪽/오른쪽 움직임과 파생된 전체 후두 움직임을 보여줍니다. RLN 부상 후 오른쪽(빨간색 화살표)의 역설적인 움직임과 해당 파생된 전역 모션 그래프에 표시된 큰 성문 갭에 주목하십시오. 대표적인 결과 측정은 표 1에 포함되어 있습니다. 약어: RLN = 재발성 후두 신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 후두경 데이터와의 상관관계에 대한 전기생리학 기반 결과 측정. (A) 건강한 쥐에 대한 호흡과 삼킴 중 전기생리학적 기록이 표시됩니다. 상단 창에는 설치류의 복부에 테이프로 붙인 호흡 센서에서 호흡 흔적이 표시되고, 중간 창에는 설근의 EMG 활동이 표시되며, 하단 창에는 필터링된 EMG 활동이 표시됩니다. 호흡하는 동안 리드미컬한 호흡 및 EMG 패턴에 주목하십시오. 이는 삼키는 동안 중단됩니다. 삼키기 이벤트는 호흡 흔적의 들쭉날쭉한 움직임(검은색 화살표)을 통해 쉽게 감지할 수 있으며, 그 직후에는 짧은 무호흡(빨간색 별표)이 뒤따릅니다. (B) A 에 있는 사각 파선 상자의 확장된 창은 전기생리학적 기록에서 여러 결과 측정이 어떻게 정량화되는지 보여줍니다. (A) 흡기(노란색 패널) 동안 EMG 파열 활성에 비해 호흡 추적(상단 창)이 ~150ms(파란색 이중 화살표) 지연되며, 이는 두 전기생리학적 방법 간의 시간적 차이를 강조합니다. 대표적인 전기생리학 기반 결과 측정은 다음과 같습니다: 1) 흡기 단계 지속 시간 (i); 2) 호흡간 간격(ii, 호흡기 및 여과된 EMG 채널을 통해 계산됨); 곡선 아래의 삼킴 영역 (iii); 및 삼킴 무호흡증(iv, 호흡기 및 필터링된 EMG 채널을 통해 계산). 약어 : EMG = 근전도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 맞춤형 후두 추적 소프트웨어에 의해 자동으로 생성된 대표적인 결과 측정치. 약어: RLN = 재발성 후두 신경.

후두경 플랫폼에 대한 보충 텍스트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 호흡과 삼킴 중 후두 움직임을 클로즈업 시각화할 수 있는 복제 가능한 쥐 특이적 후두경 프로토콜을 성공적으로 개발했습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 시간이 지남에 따라 동일한 동물에서 수행되어 다양한 병리학적 상태가 특히 후두 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 지난 10년 동안 개발되었으며 그 과정에서 상당한 수정과 문제 해결을 거쳤습니다. 마취 최적화는 과다 투여를 예방하기 위해 극복해야 할 가장 큰 과제였으며, 삼킴을 없애거나 호흡 곤란과 관련된 사망의 위험을 초래했습니다. 우리는 처음에 ISO를 사용했는데, 그 결과 삼킴, 과도한 타액 생성(내시경 시각화를 방해함) 및 인력 노출 위험이 폐지되었으며, 이는 이 절차에 ISO를 사용하는 것에 대한 심각한 금기 사항으로 간주되었습니다. 따라서 우리는 KX가 일반적으로 사용되는 설치류 마취제이기 때문에 KX에 초점을 맞췄습니다 33,34,35.

우리는 생쥐 14,22,29,30,36으로 프로토콜 개발을 시작했는데, 이는 이 목적에 잠재적으로 적합한 다른 내시경에 비해 축 직경(1.1mm)이 더 작기 때문에 시알내시경을 사용하면서 이루어졌습니다. 중요한 것은 시알내시경에는 작동 채널이 있다는 것인데, 처음에는 후두 내전근 반사¹⁴를 유발/연구하기 위해 공기 펄스를 전달하는 데 사용했습니다. 그러나, 우리는 쥐와 쥐에서 후두 내전근 반사가 종종 감소/폐지된다는 것을 발견했는데, 이는 전신 마취 및/또는 반복적인 공기 펄스 전달로 인한 점막 건조에 이차적으로 발생하는 후두/인두 감각 수용체의 비활성화 때문일 가능성이 가장 높습니다. 우리의 연구에서는 후두 내전근 반사가 신뢰성 있게 유발될 수 없었지만, 삼킴은 놀라울 정도로 지속되었고 후두 입구 또는 그 근처에서 기계적 자극에 의해 쉽게 유발되었습니다. 이러한 이유로 우리는 기계적으로 유발된 삼킴에 대한 내시경 분석으로 초점을 전환했습니다.

이 과정에서 파손되기 쉽고 후두 움직임을 안정적으로 시각화하고 분석하기에 충분한 조명과 이미지 해상도가 있는 반강성 내시경을 포기했습니다. 수많은 대체 내시경을 탐색하는 과정에서 우리는 궁극적으로 생쥐와 쥐를 대상으로 한 후두경 검사에 적합한 특정 검이경을 결정했습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 쥐 후두 내시경에 적합한 내시경을 선택할 때 가장 중요한 특징은 고품질 비디오 캡처를 위해 충분히 밝은 빛을 투과할 수 있는 샤프트 직경이 2mm 미만인 것입니다 . 더 큰 직경의 내시경은 후두 움직임을 근접 시각화하기 위해 마우스와 쥐의 후두 입구를 쉽게 통과할 수 없습니다. 검이경은 우수한 광 투과율, 견고하고 내구성 있는 설계, 다른 유형의 내시경(예: 시알내시경, 유연한 내시경)에 비해 상대적으로 저렴한 비용으로 인해 이러한 목적에 특히 이상적입니다. 또한, 내시경의 수동 제어는 안정적인 손에 의한 옵션이지만, 당사는 미세 조작기 제어가 이 후두경 프로토콜의 필수 기능이라고 생각합니다. 중요한 것은 내시경의 미세 조작기 제어를 통해 후속 정량화를 위해 한 명의 연구원이 후두 움직임을 안정적으로 비디오로 녹화할 수 있다는 것입니다. 지금까지 우리는 이 검이경 기반 프로토콜을 성체 쥐와 쥐에 성공적으로 사용했습니다. 우리는 더 어리고 작은 설치류로 후두경을 수행하기 위해 더 작은 직경의 내시경 옵션이 필수적일 것이라고 생각합니다.

후두경 프로토콜의 새로운 장점은 설치류를 삼키는 동안 기도 보호를 시각화할 수 있다는 것인데, 이는 성문이 시야를 가리는 후두 입구를 통한 피그글로틱 반전으로 인해 인간에게는 불가능합니다. 따라서 설치류는 정상적인 후두 기능을 효과적으로 회복하기 위한 치료법을 발견하는 궁극적인 목적을 위해 정상 후두 기도 보호와 병리학적 후두 기도 보호의 메커니즘을 구체적으로 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이 쥐 후두경 프로토콜의 이러한 독특한 기능은 우리가 지금까지 개발/확인한 수많은 삼킴곤란 모델에서 흡인을 감지하지 못한 비디오 형광투시(즉, 삼킴곤란에 대한 다른 "황금 표준" 테스트)에 비해 주요 이점입니다 30,36,37,38,39,40. 이 부정적인 VFSS 기반 소견은 경구강 내시경 접근 방식을 통해 명백한 설치류의 상부 기도의 여러 해부학적 차이에 기인할 수 있습니다. 첫째, 설치류 후두는 비인두의 높은 곳에 위치하여 단단히 결합된 후두개와 벨럼에 의해 숨겨져 막다른 골목의 구강을 만듭니다. 또한, 휴식 중인 후두개염은 벨럼 위에 있는 점막 덮개 아래에 갇혀 있습니다. 이 해부학적 구성은 설치류가 비강 호흡을 의무화하는 결과를 낳습니다. 따라서 깨어 있는 설치류의 구강 호흡은 호흡기 질환의 징후입니다. 그러나 건강한 설치류를 삼키는 동안에는 후두개가 점막초에서 미끄러져 나와 후두가 덩어리의 경로에서 비인두로 더 올라갈 때 후두 입구를 통해 역전됩니다. 이러한 동적 상부 기도 이벤트는 건강한 설치류와 후두 기능 장애 모델에서 후두경을 통해 직접 시각화/평가할 수 있습니다.

중요한 것은, VFSS 검사 중 흡인을 하지 않았음에도 불구하고 설치류 모델(예: 의인성 RLN 손상)이 실제로 연하곤란과 흡인이 있는 인간 환자에게 번역되는 후두경 검사를 통해 후두 기도 보호 손상(즉, 불완전한 성문 폐쇄)의 증거를 보여주었다는 것입니다. 따라서 이 쥐 후두경 검사 프로토콜은 현재 파악하기 어려운 기도 보호 및 표적 치료 메커니즘을 구체적으로 조사할 수 있는 유용한 번역 플랫폼을 제공합니다. 이 목표를 달성하려면 내시경 팁을 사용하여 후두/인두 점막에 보정되지 않은 기계적 자극을 제공하여 삼킴을 유발하는 현재 방법의 추가 개발/최적화가 필요합니다. 현재 우리 연구실에서는 상후두 신경^32,41에 대한 직접적인 전기 자극과 후두/인두 점막의 화학적(예: 구연산⁴²) 자극을 포함하여 삼킴을 유발하기 위한 보다 엄격하고 정밀하게 제어되는 방법을 연구하고 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 설치류의 앙와위 위치이며, 이는 깨어 있고 자연스러운 섭식 행동을 모방하지 않습니다. 초기 프로토콜 개발에는 엎드린 자세가 포함되었으며, 이로 인해 하악 움직임이 제한되고 구강의 가시성이 제한되어 내시경 통과를 현저히 방해했습니다. 내시경 끝이 하인두에 있는 상태에서 멀리서 후두를 시각화하는 것이 가능합니다. 그러나 이 접근법은 일반적으로 후두의 시각화를 향상시키기 위해 후두개, 벨럼 및/또는 혀를 수동으로 후퇴해야 합니다. 당사는 이러한 목적을 위해 다양한 맞춤형 수동 수축 장치(예: 수정된 검이경, 수정된 피펫 팁)를 제작했습니다. 그러나 후두의 일부는 일반적으로 시야에서 가려져 있으며 수축 장치는 후두 움직임을 제한할 수 있으며, 이는 기능 장애로 오인될 수 있습니다. 또한, 내시경 플랫폼의 최근 추가 기능(예: 트렌델렌버그 틸트 및 턱 움직임을 수용하기 위한 이어바 사이의 컷아웃)은 엎드린 자세에서 설치류를 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이어바와 보조 온열은 후두경 프로토콜의 필수 기능입니다. 이어바는 내시경의 경구강 조작 중에 머리가 움직이는 것을 방지합니다. 항온난방 시스템은 체온을 36°C에서 38°C 사이로 유지하여 안정적인 마취를 촉진하고 시술 전반에 걸쳐 저체온증을 예방합니다.

이제 설치류가 숨을 쉬고 삼키는 동안 후두 움직임을 안정적으로 비디오로 기록하는 방법론이 존재하므로 고처리량 정량화는 필수적인 다음 단계입니다. 따라서 맞춤형 소프트웨어로 생성된 결과 측정이 건강한 상태와 질병 상태를 가장 잘 구별할 수 있을 뿐만 아니라 자연적인 질병 진행 또는 치료 개입에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 변화를 감지할 수 있는지 결정하기 위한 비디오 분석 노력이 계속되고 있습니다. 유력한 후보는 비디오 이미징 분석을 가속화하기 위한 후속 머신 러닝 접근 방식의 초점이 될 것입니다. 중요한 것은 최적이 아닌 이미지 품질의 경우(예: 불충분한 조명, 시야 밖의 해부학적 구조, 후두 구조를 가리는 과도한 분비물 등)는 현재 후두 추적에 적합하지 않다는 것입니다. 그러나 이 장벽은 향후 기계 학습 도구를 통해 극복될 수 있습니다. 그때까지는 후두 추적 분석의 기준을 충족하는 비디오 프레임 시퀀스를 신중하게 선택하는 것이 가장 중요합니다(프로토콜 섹션 5에 설명된 대로).

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 1) 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute, NHLBI)의 다중 PI(TL 및 NN) R01 보조금(HL153612)과 2) 국립 청각 및 기타 의사 소통 장애 연구소(National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIDCD)의 R03 보조금(TL, DC0110895)의 두 가지 NIH 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 당사의 맞춤형 후두 모션 추적 소프트웨어 개발은 Coulter Foundation 보조금(TL & Filiz Bunyak)의 일부 자금 지원을 받았습니다. 실험실 설치류를 훌륭하게 돌봐준 Kate Osman, Chloe Baker, Kennedy Hoelscher 및 Zola Stephenson에게 감사드립니다. 또한 MU Physics Machine Shop의 Roderic Schlotzhauer와 Cheston Callais가 맞춤형 내시경 플랫폼의 설계, 입력 및 제작, 그리고 우리의 연구 요구 사항을 충족하기 위해 상업용 내시경 및 미세 조작기에 대한 전략적 수정을 제공한 것에 대해 감사드립니다. 당사의 맞춤형 후두 모션 추적 소프트웨어는 Filiz Bunyak 박사 및 Ali Hamad 박사(MU 전기 공학 및 컴퓨터 과학과)와 공동으로 개발되었습니다. 또한 검이경 선택에 대한 지침을 제공해 주신 Karl Storz Endoscopy의 Jim Marnatti에게도 감사드립니다. 마지막으로, 현재 쥐 후두경 프로토콜의 개발에 기여한 Lever Lab의 수많은 이전 학생/연수생인 Marlena Szewczyk, Cameron Hinkel, Abigail Rovnak, Bridget Hopewell, Leslie Shock, Ian Deninger, Chandler Haxton, Murphy Mastin, Daniel Shu에게 감사를 표합니다.