Klinik Öncesi Büyük Hayvan Modelinde Böbrek Alımı

Burada, müteakip makine perfüzyonu veya transplantasyonu için klinik öncesi bir domuz modelinde böbrek alımı için cerrahi bir modeli detaylandıran bir protokol sunuyoruz.

Makine perfüzyonu, ex vivo organ değerlendirmesi, izleme, tedavi, optimizasyon ve koruma sürelerini uzatmak için uygun bir strateji olarak gelişmiştir. Büyük hayvan modelleri, bu teknolojilerin geliştirilmesi ve optimizasyonu için çok önemli olmuştur. Bununla birlikte, greft kalitesini ve veri tekrarlanabilirliğini sağlamak için, organ ve doku alımı için standardize edilmiş ve klinik olarak çevrilebilir cerrahi teknikler izlenmelidir. Bu nedenle, burada, klinik öncesi bir domuz modelinde böbrek tedariki için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz. Böbrek geri kazanımı, karışık cins (Yorkshire çapraz/karışım) domuzlar kullanılarak gerçekleştirilir. Kısaca, cerrahi alanın steril dezenfeksiyonu ve örtülmesini takiben, her iki böbreğe optimum erişim sağlamak için tam bir orta hat insizyonu yapılır. Üreter, renal ven ve arter, sırasıyla inferior vena kava ve aorttan köken alana kadar diseke edilir. Tam böbrek diseksiyonundan sonra üreter bağlanır ve distal olarak kesilir. Donör hayvan daha sonra kg / vücut ağırlığı başına 100 IU ile tamamen heparinize edilir. Daha sonra, renal arter aorta yakın klemplenir ve renal ven, bir Satinsky vasküler klempi kullanılarak vena kavaya yakın klemplenir. Böbrek grefti daha sonra rezeke edilir ve renal arter hemen arka masaya kanüle edilir. Böbrek daha sonra buz gibi bir koruma solüsyonu ile yıkanacak ve makine perfüzyonu veya transplantasyon olana kadar buz üzerinde saklanacaktır. Son olarak renal arter güdüğü 2-0 ipek ligatür ile bağlanır ve vena kava 6-0 polipropilen sütür ile kapatılır. Bu teknik böbrekleri kurtarır ve canlı (tek böbrek) veya ölmüş (çift böbrek) donör ayarını simüle eder. Tek böbrek iyileşmesi, sonraki bir ototransplantasyon gerçekleştirmek için avantaj sunar. Ölen donör modelinde, ötenaziden önce kan torbası iğneleri doğrudan aort içine sokularak kan toplanabilir, böylece hayvanın kan cezası alınması ve ex vivo makine perfüzyonu için kan sağlanması sağlanabilir.

Böbrek nakli, diyalize kıyasla daha iyi yaşam kalitesi ve uzun vadeli sonuçlar sağlayan son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) için en uygun tedavi yöntemidir¹. Organ korumadaki ilerlemelere rağmen, böbrek nakli için bekleme listesindeyken her gün düzinelerce insan SDBY'den ölmektedir². Makine perfüzyonu, koruma sürelerini artıran, genişletilmiş donör ağları ve daha verimli organ tahsisi sağlayan büyüyen bir alandır. Bu teknoloji aynı zamanda ex vivo organ izleme ve optimizasyonuna izin verir, böylece iskemi-reperfüzyon hasarının (IRI) etkilerini en aza indirir. Statik soğuk hava deposu (SCS) ile karşılaştırıldığında, makine perfüzyonunun gecikmiş greft fonksiyonu insidansını önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir ^3,4. Makine perfüzyonu ayrıca, aksi takdirde nakil⁵ kriterlerini karşılamayacak olan marjinal greftlerin yeniden canlandırıldığını göstermiştir. Teknolojik gelişmelere rağmen, en yaygın koruma tekniği buz üzerinde SCS olmaya devam ediyor. Daha fazla klinik öncesi deneyler ve veriler, makine perfüzyonunu böbrek korumanın temel dayanağı haline getirmeye yardımcı olabilir.

Böbrek nakli için domuz modeli iyi kurulmuştur ve böbrek koruma teknolojisinin, özellikle de makine perfüzyonunun geliştirilmesinin ayrılmaz bir parçası olmuştur. Tek lobüler kemirgen böbreklerinin aksine, domuz ve insan böbreklerinin her ikisi de çok lobürdür, boyut olarak benzerdir ve benzer arteriyel, venöz ve idrar anatomisini paylaşır ^6,7. Bu nedenle, domuz böbreği, özellikle tıbbi cihazlar ve ilaç tedavileri açısından klinik ortama doğrudan bir çeviri kolaylaştırır. Ek olarak, domuz böbrekleri, insan böbrekleriyle benzer bir IRI patofizyolojisi gösterir⁸, bu da onları böbrek koruma çalışmaları için ideal kılar.

Greft kalitesini ve veri tekrarlanabilirliğini sağlamak için, organ ve doku alımı için standardize edilmiş ve klinik olarak çevrilebilir cerrahi teknikler izlenmelidir. Bu nedenle, burada, klinik öncesi bir domuz modelinde böbrek tedariki için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol böbreklerin geri kazanılmasına izin verir ve canlı (tek böbrek) veya ölen (çift böbrek) donör ayarını simüle eder. Tek böbrek iyileşmesi, müteakip bir ototransplantasyon gerçekleştirme avantajı sunar. Çift böbrek kurtarma modelinde, ötenazi öncesi kan alımı, kan torbası iğnelerinin doğrudan aort içine sokulması, böylece hayvanın kan durumunun açığa çıkarılması ve ex vivo makine perfüzyonu için kan sağlanması ile mümkündür.

Açıklanan tüm prosedürler, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) lisanslı, Laboratuvar Hayvanları Refahı Ofisi (OLAW) güvencesinde ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir kurum olan Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı'nın Hayvan Refahı Yasası, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı Politikası'na uygun olarak muhafaza edildi.

1. Hayvanlar ve barınma

1. Bu protokol için 3-6 aylık klinik olarak sağlıklı 20-40 kg Yorkshire domuzları (Sus scrofa domesticus) veya karşılaştırılabilir kullanın.
2. Hayvanları, çıtalı döşeme ile zincir bağlantılı çit yollarında barındırın.

2. Ameliyat öncesi prosedür ve anestezi

1. Sedasyon zamanından en az 12 saat önce hayvanı aç bırakın.
2. Ameliyattan en az 12 saat önce oral simetikon (20 mg / kg) uygulayın ve bağırsak genişlemesini azaltmak için sedasyondan en az 1 saat önce dozu tekrarlayın.
3. Birden fazla enjeksiyondan kaçınmak için ketamin (20-30 mg / kg) ve ksilazin (2-3 mg / kg) tek bir şırıngada kas içine uygulayın.
4. Domuzu ameliyat öncesi evreleme alanına aktarın. Marjinal kulak damarına intravenöz bir kateter yerleştirin. Prosedür boyunca 3-10 mg / kg / saat% 0.9 salin veya Emzirilmiş Ringer solüsyonu uygulayın.
5. Domuz yeterince sedasyona tabi tutulduktan sonra, gaz anestezisi ve mekanik ventilasyon için bir endotrakeal tüp (20-30 kg hayvan için 6.0-6.5 mm kelepçeli endotrakeal tüp; 30-40 kg için 6.5-7.0 mm kelepçeli) yerleştirin. Gerekirse, etki etmek için intravenöz olarak uygulanan bir doz propofol (0.8-1.66 mg / kg) ile kolaylaştırın.
6. Hayvanı ameliyathaneye taşımadan önce, ameliyat bölgesindeki ve çevresindeki tüyleri makas kullanarak ve ayrıca cerrahi bölgeyi kirli bir şekilde ovalayarak çıkarın.
7. Hayvanı ameliyat masasına aktarın. Ameliyatın başlamasından 10 dakika önce intravenöz olarak ve intraoperatif olarak her 90 dakikada bir sefazolin (20-22 mg / kg) uygulayın. Ameliyatın başlangıcında pantoprazol (0.5-1 mg / kg) intravenöz olarak uygulayın.
8. İnsizyondan önce ilave analjeziyi kolaylaştırmak için lidokain (2 mg / kg'a kadar) ile deri altından lokal bir blok uygulayın.
9. Cerrahi bölgeyi klorheksidin veya betadin ve% 70 etanol veya salin arasında değiştirerek en az üç kez aseptik olarak hazırlayın.
10. Sıvı hacmini, kalp atış hızını, kan basıncını, nabız oksimetresini, kapnografiyi, elektrokardiyografiyi ve rektal sıcaklığı sürekli olarak izleyin. Bu değerleri her 10-15 dakikada bir kaydedin. Hipotermiyi önlemek için ısıtılmış bir gövde altı pedi ve sıcak hava battaniyesi kullanın.
11. Ameliyata başlamadan önce, çene tonusu, palpebral refleks ve önceki adımda listelenen parametrelerin bir kombinasyonunu kullanarak hayvanın uygun cerrahi anestezi düzleminde olduğunu onaylayın.

3. Böbrek toplama prosedürü

1. Bölüm 2'de açıklanan adımları izleyerek hayvanı ameliyata hazırlayın.
2. Cerrahi alanın steril dezenfeksiyonu ve örtülmesinin ardından, her iki böbreğe de optimum erişim sağlamak için medyan laparotomi (25-30 cm) yapın. Standart bir abdominal ekartör yerleştirin.
3. Kolonu ve ince bağırsağı ılık tuzlu suya batırılmış havlularla örtün. Sol böbreğe erişim için bağırsakları sağ tarafa veya sağ böbreğe erişim için sol tarafa geri çekin.
4. Böbreğin üzerindeki peritonu açın ve herhangi bir yapışmayı serbest bırakmak için böbreğin etrafını inceleyin. Üreteri 10-12 cm uzunluk elde edilene kadar diseksiyon yapın.
5. Renal ven ve arteri, sırasıyla inferior vena kava ve aorttan kökenlerine kadar inceleyin.
6. Tam renal diseksiyondan sonra, üreteri distal olarak 2-0 ipek ligatür ile bağlayın ve bağa proksimal olarak kesin. İdrar drenajına izin vermek için proksimal üreter ucunu açık bırakın.
7. Hayvanı intravenöz heparin (100 IU / kg) ile heparinize edin ve böbreğin yeterli heparinizasyonunu sağlamak için 2 dakika bekleyin. Bu adım, her böbreğin rezeksiyonundan önce tekrarlanmalıdır.
8. Renal arter ve renal veni sırasıyla aort ve inferior vena kavaya yakın iki Satinsky vasküler klempi ile klempleyin. Böbrek atardamarını ve toplardamarını klemplere yakın keserek böbrek greftini çıkarın.
9. Renal arteri hemen 3 mm künt uçlu perfüzyon kanülü ile kanül edin. Böbreği buz gibi Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonu veya Custodiol Histidin-triptofan-ketoglutarat (HTK) koruma solüsyonu ile yıkayın.
10. UW veya HTK ile yıkadıktan sonra perfüzyon kanülünü çıkarın ve böbreği yıkamak için kullanılan aynı buz gibi soğuk koruma solüsyonu ile doldurulmuş steril bir organ torbasına yerleştirin. Bu torbayı ikinci bir steril organ torbasına yerleştirin. Daha sonra organı saklayın veya makine perfüzyonunu başlatın.
11. Renal arter kütüğünü 2-0 ipek ligatür ile bağlayın. Renal ven kütüğünü 6-0 polipropilen içeren iki katmanlı bir koşu ipliği ile kapatın.

4. Kan alımı prosedürü

1. Prosedür terminal ise ve diğer tüm cerrahi müdahaleler yapıldıysa, makine perfüzyonu ve kan kaybı ile ötenazi için kan alımına devam edin.
2. Bağırsakları sağ tarafa çekin ve infrarenal abdominal aortu tanımlayın. Damarı kaplayan büyük yapışıklıkları veya dokuları serbest bırakın.
3. Kan alma torbası iğnesini doğrudan aortun içine yerleştirin. Doldurmayı kolaylaştırmak için torbayı hayvanın altına asın. Torba dolduğunda (yaklaşık 450 mL kan), iğneyi aorttan çıkarın ve delinme bölgesine baskı uygulayın.
4. İkinci bir kan torbası için, yeni iğneyi önceki delinme bölgesine proksimalden 1-2 cm yerleştirin. Gerektiği kadar birden fazla kan torbası ile tekrarlayın, her iğne ile proksimal olarak 1-2 cm hareket edin.
5. Gerekli tüm kan toplandıktan sonra, pentobarbital bileşenin en az 78 mg / kg'lık bir dozunda intravenöz pentobarbital sodyum / fenitoin sodyum enjeksiyonu ile kalp durmasını indükleyin. Pentobarbitalin böbreğin sonraki tahlillerine müdahale edeceği endişesi varsa, anestezi altında domuzlara uygulanırsa alternatif bir kimyasal ötenazi yöntemi olarak potasyum klorür (KCl) (75-100 mg / kg IV) kullanın. Kalp atışı eksikliği, kornea refleksi eksikliği ve vücut ısısında önemli bir azalma ile ölümü doğrulayın.
   NOT: Kurban edilen domuzun kalan organları ve dokusu, 3R prensiplerine uygun olarak başka araştırma veya eğitim amaçları için kullanılabilir.

Araştırma grubumuz, hem katı organ nakli hem de vaskülarize kompozit allotransplantasyonun domuz modelleri ile yaklaşık 15 yıla yayılan geniş bir deneyime sahiptir 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Burada, domuz böbreği kurtarma deneylerimizin sonuçlarını açıklıyoruz (n = 139). Temin edilen böbrekleri transplantasyon, makine perfüzyonu veya primer hücre kültürü için kullandık ve şu ana kadar bu cerrahi işlem modelinde herhangi bir komplikasyon yaşamadık (Şekil 1). Başarılı böbrek alımını, anatomi veya cerrahi teknikle ilgili olumsuz sonuçların olmamasının yanı sıra, teknik bir başarısızlığın olmadığı bir ameliyat olarak tanımlıyoruz. Bir böbrek greftinin brüt görünümünün örnekleri, makine perfüzyonu veya transplantasyon yoluyla başarılı böbrek reperfüzyonunu temsil eden Şekil 2'de gösterilmektedir.

Eğitim geçmişine ve laboratuvarın domuz modellerine olan aşinalığına bağlı olarak, prosedürlerde yer alan tüm personelle en az bir ila üç ön deney yapılmasını öneririz. Mevcut çalışma grubunda, orta hat insizyonundan ötenaziye kadar ortalama toplam işlem süresi 88 dakika idi (Tablo 1). Orta hat insizyonundan her iki böbrek greftinin alınmasına kadar geçen süre ortalama 73 dakika idi. Bir veteriner hekim ve bir veya iki veteriner teknisyeni de dahil olmak üzere veteriner personelinden alınan desteğe ek olarak, en az üç ek cerrahi ve laboratuvar personeli gereklidir. Deneyim düzeyine bağlı olarak, sıcak iskemi süresini ve kan alma sırasında pıhtılaşma riskini en aza indirmek için greft alımı, organ yıkama ve kan alma ile verimliliği sağlamak için başka bir cerrahi asistan ve doktora öğrencileri veya laboratuvar teknisyenleri de dahil olmak üzere bir veya iki ek destek personeli önerilebilir.

İnsanlarda olduğu gibi, domuz böbreklerinde de anatomik farklılıklar mümkündür (Şekil 3, Tablo 2). Standart anatomi - bir renal arter ve bir renal ven - böbreklerin% 64'ünde görüldü. En sık görülen varyasyonlar bir arter ve iki ven (%26), iki arter ve bir ven (%5), bir arter ve üç ven (%4) ve iki arter ve iki ven (%1) idi. Domuzların yaklaşık yarısı (% 46) bilateral olarak tipik anatomiye sahipti. Atipik anatomi hem tek taraflı (%22 sol atipik, %14 sağ atipik) hem de iki taraflı (%19) görüldü. Nakil için bir böbrek seçerken, herhangi bir atipik anatomiden kaçınmanızı öneririz. Her iki böbreğin de iki damarı varsa, daha uzun damarlı böbreği tercih edin ve nakilden önce arka masada tek bir lümene kadar yeniden yapılandırın. Makine perfüzyonu için bir böbrek seçerken, makine havuzlanmış venöz drenaj kullanıyorsa venöz anatomi daha az önemlidir. Tek pompalı makine perfüzyonu için iki arter anatomisinden kaçınmanızı öneririz, çünkü arterler arasındaki direnç farklılıkları düzensiz dolaşım yaratacaktır.

Şekil 1: Transplantasyon, makine perfüzyonu ve primer hücre kültürü deneyleri için başarılı böbrek alma oranlarının özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Böbrek grefti brüt görünüm örnekleri. (A) Yerinde, doğal sağ böbrek. (B) Buz gibi soğuk muhafaza solüsyonu ile yıkandıktan sonra böbrek grefti. (C) Makine reperfüzyonundan sonra böbrek grefti. (D) Transplantasyon ve reperfüzyon sonrası böbrek grefti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Domuz böbrek anatomisindeki varyasyonlar. (A,B) Her böbrek için bir renal arter ve bir renal ven ile tipik anatomi. (C) Bir renal arter ve iki renal ven ile atipik anatomi. (D) Bir renal arter ve üç renal ven ile atipik anatomi. (E) İki renal arter ve bir renal ven ile atipik anatomi. (F) İki renal arter ve iki renal ven ile atipik anatomi. Kullanılan kısaltmalar: RK- sağ böbrek; IVC- inferior vena kava; AO- aort; LK- sol böbrek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Domuz böbreği tedarik ameliyatını gerçekleştirmek için insan kaynakları ve zaman gereksinimleri.

Tablo 2: Domuz böbreklerinde bulunan anatomik varyasyonların özeti.

Böbrek nakli için domuz modeli, makine perfüzyon teknolojisinin geliştirilmesi ve optimizasyonu için hayati önem taşımaktadır. İnsan böbreklerine ^6,7,8 anatomik, immünolojik ve patofizyolojik benzerlikler göz önüne alındığında, domuz böbrekleri klinik test ve uygulamaya kolaylaştırılmış bir çeviri sunar.

Domuz böbreği tedarik modeli, çeşitli klinik öncesi deneyler için kullanılabilir. Canlı bir donör modelinde, tek bir böbrek, daha sonra ototransplantasyon ve kontralateral böbreğin çıkarılması ile kurtarılabilir ve korunabilir^18,19. Ölen bir donör modelinde, her iki böbrek de temin edilebilir ve koruma çalışmaları, makine perfüzyon çalışmaları veya allotransplantasyon için kullanılabilir. Bölüm 4'te özetlenen kan alma prosedürü, tam kan veya kan ürünleri içeren bir perfüzat, özellikle perfüzat değişimi gerektiren uzatılmış makine perfüzyonu kullanan makine perfüzyon çalışmaları için anahtardır 20,21,22. Aortun doğrudan kanülasyonu ile, tutarlı ve hızlı bir kan akışı elde edilir ve hayvanı minimum sürede tamamen kandan arındırır. Her bir iğne bir öncekine proksimal olarak sokularak birden fazla kan torbası doldurulabilir, böylece önceki delinme bölgesinden kan sızıntısı en aza indirilir.

Hem hipotermik makine perfüzyonu (HMP) hem de normotermik makine perfüzyonu (NMP), böbrek koruma ve optimizasyonu için ortaya çıkan yöntemlerdir. SCS ile karşılaştırıldığında, hem HMP hem de NMP'nin sonuçları iyileştirdiği ve gecikmiş greft fonksiyonu insidansını azalttığı gösterilmiştir ^3,4,5. Optimal yöntemi belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır, ancak bazı klinik öncesi çalışmalar NMP'nin daha iyi sonuçlar sağladığını göstermiştir²³. Makine perfüzyonu, marjinal greftlerin²¹ canlılık testi ve tahmini için bir fırsat sağlamanın yanı sıra daha önce kullanılamayan greftleri²⁴ onarma potansiyeli sağlar. Ek çalışmalar, kök hücrelerin²⁵ verilmesi ve bir domuz böbreğinin insan endotel hücreleri²⁶ ile yeniden hücreselleştirilmesi de dahil olmak üzere, ilaç dağıtımı ve biyomühendislik için bir yer olarak makine perfüzyonunu göstermiştir. Domuzdan insana böbrek ksenotransplantasyonu yeni bir atılımdır ^27,28 ve makine perfüzyonunda daha fazla ilerleme olabilir.

Böbrek anatomisindeki varyasyonlar, birden fazla böbrek iyileşmesi gerçekleştirirken kaçınılmaz bir engeldir. İki renal arteri olan bir böbrek nadir görülen bir varyanttır. Deneyimlerimize göre, kontralateral böbrek normal arteriyel anatomiye sahiptir ve atipik olanın yerine kullanılabilir. Venöz anormallikler arteriyel anormalliklerden daha yaygındır, ancak aynı zamanda rekonstrüksiyona daha uygundur. Venöz anatominin potansiyel varyasyonları ve rekonstrüksiyon olasılıkları daha önce tanımlanmıştır ^19,29 ve bu makalenin kapsamı dışındadır.

Etkinliğine rağmen, yukarıdaki protokol, personel, cerrahi ekipman, hayvan barınağı ve ameliyat öncesi ve sonrası bakım dahil olmak üzere karmaşık bir büyük hayvan cerrahisini başarıyla tamamlamak için gereken zaman ve kaynaklarla sınırlıdır. Ek olarak, genç, sağlıklı bir domuz böbreği, yaşlı yetişkin donörleri, altta yatan böbrek hastalığı olan donörleri ve hipertansiyon ve diyabet dahil komorbiditeleri olan donörleri değerlendirmek için sınırlı bir modeldir.

Domuz böbreği tedariki için bu optimize edilmiş ve tekrarlanabilir protokol, böbrek nakli, koruma ve makine perfüzyonunda çevrilebilir klinik öncesi araştırmalara izin verir.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yazarlar, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki birçok veteriner teknisyenine teknik yardımları için teşekkür eder. Ayrıca Dr. Jessica Izzi ve Amanda Maxwell'e ve Dr. Mallory Brown, Jessica Plunkard ve Alexis Roach da dahil olmak üzere çok sayıda veteriner asistanına hayvanlarımıza mükemmel klinik bakım ve veteriner gözetimi sağladıkları için minnettarlığımızı ifade etmek isteriz. Son olarak, Johns Hopkins Tıp Fakültesi'ndeki Vaskülarize Kompozit Allotransplantasyon (VCA) Laboratuvarı'nın tüm üyelerine, laboratuvarımızda gerçekleştirilen böbrek temini veya diğer organ temini prosedürlerinde herhangi bir kapasitede yardımcı olan teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) hibe R44DK136396 tarafından desteklenmiştir.