前臨床大動物モデルにおける腎臓調達

ここでは、その後の機械灌流または移植のための前臨床豚モデルにおける腎臓調達の外科的モデルについて詳しく説明するプロトコルを紹介します。

機械灌流は、 ex vivo 臓器の評価、モニタリング、治療、最適化、および保存期間の延長のための実行可能な戦略として進化してきました。大型動物モデルは、これらの技術の開発と最適化にとって最も重要でした。しかし、移植片の品質とデータの再現性を確保するためには、臓器や組織の調達のための標準化された臨床的に翻訳可能な外科技術に従う必要があります。したがって、ここでは、前臨床豚モデルにおける腎臓調達のための最適化されたプロトコルについて説明します。腎臓の回復は、混合品種(ヨークシャークロス/ミックス)豚を使用して行われます。簡単に言うと、滅菌消毒と手術野のドレープに続いて、両方の腎臓への最適なアクセスを得るために、完全な正中線切開が行われます。尿管、腎静脈、および動脈は、それぞれ下大静脈と大動脈から起源になるまで解剖されます。完全な腎解剖後、尿管を結んで遠位に切断します。その後、ドナー動物は体重あたり 100 IU で完全にヘパリン化されます。次に、腎動脈を大動脈の近くに固定し、腎静脈をサチンスキー血管クランプを使用して大静脈の近くに固定します。その後、腎臓移植片を切除し、腎動脈をすぐにテーブルに戻してカニューレを挿入します。その後、腎臓は氷冷保存液で洗い流され、機械灌流または移植のいずれかまで氷上に保存されます。最後に、腎動脈断端を2-0シルク結紮糸で結紮し、大静脈を6-0ポリプロピレン縫合糸で閉じます。この手法は、腎臓を回復し、生きているドナー(単一の腎臓)または死亡した(二重腎臓)ドナーの設定をシミュレートします。単一の腎臓の回復は、その後の自家移植を行うための利点を提供します。死亡したドナーモデルでは、安楽死前に血液バッグの針を直接大動脈に挿入することで血液を採取し、それによって動物を抜血し、 ex vivo マシン灌流のための血液を提供することができます。

腎移植は、末期腎疾患(ESRD)の最適な治療法であり、透析と比較して生活の質と長期的な転帰を改善します¹。臓器保存の進歩にもかかわらず、腎臓移植の順番待ちリストに載っている間に、毎日何十人もの人々がESRDで亡くなっ^{ています2。}機械灌流は、保存期間を延長し、ドナーネットワークの拡大とより効率的な臓器割り当てを可能にする成長分野です。また、この技術により、ex vivo臓器のモニタリングと最適化が可能になり、虚血再灌流障害(IRI)の影響を最小限に抑えることができます。静的冷蔵(SCS)と比較すると、機械灌流は遅延グラフト機能の発生率を大幅に減少させることが示されています^3,4。機械灌流はまた、移植の基準を満たさなかったであろう辺縁移植片の活性化を実証しています⁵。技術の進歩にもかかわらず、最も一般的な保存技術は氷上のSCSのままです。さらなる前臨床実験とデータは、機械灌流を腎臓保存の主力にするのに役立ちます。

腎臓移植のブタモデルは十分に確立されており、腎臓保存技術、特に機械灌流の開発に不可欠でした。単葉性のげっ歯類の腎臓とは異なり、ブタとヒトの腎臓はどちらも多葉性で、サイズが似ており、動脈、静脈、および尿の解剖学的構造が類似しています^6,7。したがって、ブタの腎臓は、特に医療機器や薬物療法の観点から、臨床現場への直接的な翻訳を促進します。さらに、ブタの腎臓は、^{ヒトの腎臓}と同様のIRIの病態生理学を示す8ため、腎臓温存研究に最適です。

移植片の品質とデータの再現性を確保するためには、臓器や組織の調達のための標準化された臨床的に翻訳可能な外科的技術に従う必要があります。したがって、ここでは、前臨床豚モデルにおける腎臓調達のための最適化されたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、腎臓の回復を可能にし、生きている(単一の腎臓)または死亡した(二重の腎臓)ドナーの設定をシミュレートします。単一の腎臓の回復には、その後の自家移植を行うという利点があります。二重腎臓回復モデルでは、血液バッグの針を直接大動脈に挿入することで、安楽死前の採血が可能になり、それによって動物を放血し、 ex vivo 機械灌流のための血液を提供します。

記載されているすべての手順は、米国農務省(USDA)の認可を受け、実験動物福祉局(OLAW)の保証を受けたジョンズホプキンス大学の施設管理および使用委員会、および実験動物ケアの評価と認定認定協会(AAALAC)の認定機関によって承認されました。動物は、米国農務省の動物福祉法、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイド、および米国公衆衛生局の実験動物の人道的ケアと使用に関する方針に従って飼育されました。

1. 動物と住居

1. このプロトコルには、生後3〜6か月の臨床的に健康な20〜40 kgのヨークシャー豚(Sus scrofa domesticus)または同等の豚を使用してください。
2. スラットの床でチェーンリンクのフェンスランで動物を収容します。

2. 術前処置と麻酔

1. 鎮静時間の少なくとも12時間前に動物を絶食します。.
2. 手術の少なくとも12時間前にシメチコン(20 mg / kg)を経口投与し、鎮静の少なくとも1時間前に繰り返し投与して、腸の拡張を減らします。.
3. ケタミン(20-30 mg / kg)とキシラジン(2-3 mg / kg)を1つのシリンジで筋肉内投与して、複数回の注射を避けます。.
4. ブタを術前の病期分類エリアに移します。静脈内カテーテルを辺縁耳静脈に留置します。手順全体を通して、3〜10 mg / kg / hの0.9%生理食塩水または乳酸リンゲル溶液を投与します。.
5. ブタが十分に鎮静されたら、気管内チューブ(20〜30 kgの動物には6.0〜6.5 mmのカフ付き気管内チューブ、30〜40 kgには6.5〜7.0 mmのカフ付き)を配置し、ガス麻酔と機械的換気を行います。.必要に応じて、プロポフォール(0.8-1.66 mg / kg)を静脈内投与して効果を発揮します。.
6. 動物を手術室に移動する前に、バリカンを使用して手術部位とその周囲の毛を取り除き、手術部位の汚れたスクラブを取り除きます。
7. 動物を手術台に移します。セファゾリン (20-22 mg/kg) を手術開始の 10 分前に静脈内投与し、術中に 90 分ごとに再度投与します。手術開始時にパントプラゾール(0.5-1 mg / kg)を静脈内投与します。.
8. リドカイン(最大2 mg / kg)で局所ブロックを皮下投与して、切開前の追加の鎮痛を促進します。.
9. クロルヘキシジンまたはベタジンと70%エタノールまたは生理食塩水を交互に少なくとも3回、手術部位を無菌的に準備します。
10. 体液量、心拍数、血圧、パルスオキシメトリー、カプノグラフィー、心電図、直腸温を継続的に監視します。これらの値を10〜15分ごとに記録します。温めた足回りパッドと温風ブランケットを使用して、低体温症を防ぎます。
11. 手術を開始する前に、顎の緊張、眼瞼反射、および前のステップでリストされたパラメーターの組み合わせを利用して、動物が外科的麻酔の適切な平面内にあることを確認します。

3.腎臓採取手順

1. セクション2に記載されている手順に従って、動物を手術用に準備します。
2. 滅菌消毒と手術野のドレープに続いて、開腹術の中央値(25〜30cm)を行い、両方の腎臓への最適なアクセスを確保します。標準的な腹部リトラクターを挿入します。
3. 結腸と小腸を温かい生理食塩水に浸したタオルで覆います。腸を右側に引っ込めて左腎臓にアクセスするか、左側に引っ込めて右腎臓にアクセスします。
4. 腎臓の上にある腹膜を開き、腎臓の周りを解剖して癒着を取り除きます。長さが10〜12cmになるまで尿管を解剖します。
5. 腎静脈と動脈を、それぞれ下大静脈と大動脈から起源になるまで解剖します。
6. 完全な腎解剖後、尿管を2-0シルク結紮糸で遠位に結び、結束物に近位に切ります。尿のドレナージを可能にするために、近位尿管の端を開いたままにします。.
7. 静脈内ヘパリン(100 IU / kg)で動物をヘパリン化し、腎臓の適切なヘパリン化を確保するために2分間待ちます。.この手順は、各腎臓の切除前に繰り返す必要があります。
8. 2つのSatinsky血管クランプを使用して、腎動脈と腎静脈をそれぞれ大動脈と下大静脈の近くにクランプします。クランプの近くで腎動脈と静脈を切断することにより、腎臓移植片を取り除きます。
9. すぐに3mmの鈍い先端灌流カニューレで腎動脈をカニューレします。氷冷したウィスコンシン大学(UW)溶液またはCustodiol Histidine-トリプトファン-ケトグルタル酸(HTK)保存溶液で腎臓を洗い流します。.
10. UWまたはHTKで洗い流した後、灌流カニューレを取り外し、腎臓の洗い流しに使用されたのと同じ氷冷保存溶液で満たされた滅菌臓器バッグに腎臓を入れます。このバッグを2番目の滅菌臓器バッグに入れます。その後、臓器を保管するか、機械灌流を開始します。
11. 腎動脈の切り株を2-0シルク結紮糸で結紮します。6-0ポリプロピレンを使用した2層ランニング縫合糸で腎静脈断端を閉じます。

4.採血手順

1. 処置が末期的で、他のすべての外科的介入が行われている場合は、機械灌流のための採血と放血による安楽死に進みます。
2. 腸を右側に引っ込め、腹部下大動脈を特定します。血管を覆っている大きな癒着物や組織を取り除きます。
3. 採血バッグの針を直接大動脈に挿入します。袋を動物の下に吊るして、詰めやすくします。バッグがいっぱいになったら(約450 mLの血液)、大動脈から針を取り外し、穿刺部位に圧力をかけます。
4. 2番目の血液バッグの場合は、新しい針を前の穿刺部位から近位に1〜2cm挿入します。必要に応じて複数の血液バッグで繰り返し、各針で近位に1〜2cm移動します。
5. 必要な血液がすべて収集された後、ペントバルビタールナトリウム/フェニトインナトリウムを少なくとも78 mg / kgのペントバルビタール成分の用量で静脈内注射して心停止を誘発します。.ペントバルビタールが腎臓のその後のアッセイを妨げる懸念がある場合は、麻酔下で豚に投与される場合、代替の化学的安楽死方法として塩化カリウム(KCl)(75-100 mg / kg IV)を使用してください。.心拍の欠如、角膜反射の欠如、および体温の大幅な低下による死亡を確認します。
   注:犠牲にされたブタの残りの臓器と組織は、3Rの原則に従って他の研究または教育目的に使用できます。

私たちの研究グループは、固形臓器移植と血管新生複合同種移植の両方のブタモデルについて、15年近くにわたる幅広い経験を持っています9,10,11,12,13,14,15,16,17 .ここでは、ブタの腎臓回復実験(n = 139)の結果について説明します。今回、調達した腎臓を移植、機械灌流、初代細胞培養に利用していますが、これまでのところ、この手術モデルによる合併症は発生していません(図1)。腎臓回収の成功とは、技術的な失敗がなく、解剖学や手術技術に関連する有害な結果がないことと定義しています。腎臓移植片の全体的な外観の例を図2に示し、機械灌流または移植による腎臓再灌流の成功を表しています。

トレーニングの背景と、研究室の豚モデルに関する知識にもよりますが、手順に関与するすべての人員に対して少なくとも1〜3回の予備実験を行うことをお勧めします。現在の一連の研究では、正中線切開から安楽死までの平均総手続き時間は88分でした(表1)。正中線切開から両方の腎移植片の回収までの平均時間は73分でした。獣医師と1人または2人の獣医技術者を含む獣医スタッフからのサポートに加えて、少なくとも3人の追加の外科および検査要員が必要です。経験レベルにもよりますが、移植片の回収、臓器の洗浄、採血の効率を確保するために、もう一人の外科助手と1人または2人の追加のサポートスタッフ(博士課程の学生や検査技師を含む)が推奨される場合があります。

ヒトと同様に、ブタの腎臓でも解剖学的な変化が考えられます(図3、 表2)。標準的な解剖学的構造(1つの腎動脈と1つの腎静脈)は、腎臓の64%で見られました。最も一般的なバリエーションは、1つの動脈と2つの静脈(26%)、2つの動脈と1つの静脈(5%)、1つの動脈と3つの静脈(4%)、2つの動脈と2つの静脈(1%)でした。ブタの約半数(46%)は、両側に典型的な解剖学的構造を持っていました。非定型解剖学的構造は、片側性(22%が左非定型、14%が右非定型)と両側性(19%)の両方で見られました。移植用の腎臓を選択するときは、非定型の解剖学的構造を避けることをお勧めします。両方の腎臓に2つの静脈がある場合は、静脈が長い腎臓を選択し、移植前に背面のテーブルで1つの内腔に再建します。機械灌流用の腎臓を選択する場合、機械がプールされた静脈ドレナージを利用する場合、静脈の解剖学的構造はそれほど重要ではありません。シングルポンプマシンの灌流では、動脈間の抵抗の違いにより循環が不均一になるため、2本の動脈の解剖学的構造を避けることをお勧めします。

図1:移植、機械灌流、および初代細胞培養実験の成功腎賦活率の要約。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:腎臓移植片の全体的な外観の例(A)ネイティブの右腎臓のその場。(B)氷冷保存液で洗い流した後の腎臓移植片。(C)機械再灌流後の腎臓移植。(D)移植および再灌流後の腎臓移植。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ブタの腎臓の解剖学的構造のバリエーション。 (A,B)腎臓ごとに1つの腎動脈と1つの腎静脈を持つ典型的な解剖学的構造。(C)1本の腎動脈と2本の腎静脈を持つ非定型解剖学的構造。(D)1本の腎動脈と3本の腎静脈を持つ非定型解剖学的構造。(E)2つの腎動脈と1つの腎静脈を持つ非定型解剖学的構造。(F)2つの腎動脈と2つの腎静脈を持つ非定型解剖学的構造。使用される略語:RK-右腎臓;IVC-下大静脈;AO-大動脈;LK-左腎臓。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ブタ腎臓調達手術を実施するための人的資源と時間要件。

表2:ブタの腎臓に見られる解剖学的変異の要約。

腎臓移植のためのブタモデルは、機械灌流技術の開発と最適化に不可欠でした。解剖学的、免疫学的、および病理生理学的にヒトの腎臓^と類似している^6,7,8を考慮すると、ブタの腎臓は臨床検査および臨床診療への容易な翻訳を提供する。

ブタの腎臓調達のモデルは、さまざまな前臨床実験に利用できます。生体ドナーモデルでは、単一の腎臓を回収して保存し、その後、自家移植と対側腎臓の除去を行うことができます^18,19。死亡したドナーモデルでは、両方の腎臓を調達し、保存研究、機械灌流研究、または同種移植に使用できます。セクション4で概説した採血手順は、全血または血液製剤を含む灌流物、特に灌流水交換を必要とする拡張機械灌流を利用する機械灌流研究の鍵です20,21,22。大動脈を直接カニューレ挿入することにより、一貫した急速な血液の流れが得られ、最小限の時間で動物を完全に排泄します。各針を前の針に近位に挿入することで、複数の血液バッグを充填できるため、前の穿刺部位からの血液漏れを最小限に抑えることができます。

低体温マシン灌流(HMP)と常温マシン灌流(NMP)はどちらも、腎臓の保存と最適化のための新たな方法です。SCSと比較すると、HMPとNMPの両方が転帰を改善し、遅延グラフト機能の発生率を低下させることが示されています^3,4,5。最適な方法を決定するにはさらなる研究が必要ですが、いくつかの前臨床試験では、NMPがより良い結果を提供することが示されています²³。機械灌流は、限界移植片²¹の生存率試験および予測の機会を提供するとともに、以前には使用できなかった移植片²⁴を修復する可能性を提供する。さらなる研究では、幹細胞の送達²⁵やヒト内皮細胞²⁶によるブタ腎臓の再細胞化など、薬物送達およびバイオエンジニアリングの場としての機械灌流が実証されている。ブタからヒトへの腎臓異種移植は最近のブレークスルーであり^27,28、さらなる進歩は機械灌流にあるかもしれません。

腎臓の解剖学的構造のばらつきは、複数の腎臓の回復を行う際に避けられないハードルです。2つの腎動脈を持つ腎臓は珍しい変異体です。私たちの経験では、反対側の腎臓は正常な動脈解剖学的構造を持っており、非定型腎臓の代わりに使用できます。静脈の異常は動脈の異常よりも一般的ですが、再建にも適しています。静脈解剖学の潜在的な変化と再構築の可能性は以前に説明されており^19,29 、この論文の範囲を超えています。

その有効性にもかかわらず、上記のプロトコルは、人員、手術機器、動物の飼育、術前および術後のケアなど、複雑な大型動物手術を成功裏に完了するために必要な時間とリソースによって制限されています。さらに、若くて健康なブタの腎臓は、高齢者のドナー、基礎疾患のあるドナー、高血圧や糖尿病などの併存疾患のあるドナーを評価するための限定的なモデルです。

ブタの腎臓調達のためのこの最適化され再現性のあるプロトコルは、腎臓移植、保存、および機械灌流における翻訳可能な前臨床研究を可能にします。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

著者は、ジョンズホプキンス大学医学部の多くの獣医技術者の技術支援に感謝したいと思います。また、ジェシカ・イッツィ博士とアマンダ・マクスウェル博士、そしてマロリー・ブラウン博士、ジェシカ・プランカード博士、アレクシス・ローチ博士を含む多数の獣医研修医の方々にも、動物たちに優れた臨床ケアと獣医の監督を提供してくださったことに感謝いたします。最後に、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の血管新生複合同種移植(VCA)研究所のすべてのメンバーに感謝したいと思います。これらのメンバーは、当研究所で実施される腎臓調達またはその他の臓器調達手順を何らかの形で支援してきました。この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)の助成金R44DK136396の支援を受けました。