Stabil Transfekte Melanom Hücre Klonlarının İzolasyonu

Cam silindirler kullanılarak stabil bir şekilde transfekte edilmiş melanom hücre klonlarını izole etmek için bir protokol tanımlanmıştır. Tüm prosedürün başarısı için belirleyici olabilecek pratik tavsiyelere odaklanıyoruz.

Genomik bilgilerinde stabil değişikliklere sahip hücre popülasyonları, bilim adamları tarafından bir araştırma modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Heterojen bir hücre popülasyonuna ve tekrarlanabilirliği etkileyen değişken transfeksiyon verimliliğine yol açabileceğinden, tekrarlanan hücre transfeksiyonu gerektirmezler. Ayrıca, büyük ölçekli analizler için tercih edilirler. Kararlı hücre klonlarının oluşturulması, gen fonksiyonları ve rekombinant protein üretimi üzerine araştırmalar gibi çok çeşitli uygulamalar için yararlıdır. İlk geçici transfeksiyon üzerine homojen bir hücre popülasyonu elde etmenin birkaç yöntemi vardır. Burada, tek hücreli klonların cam silindirlerle izolasyonunu açıklıyoruz. Bu yöntem bir süredir bilinmesine rağmen, birkaç önemli adım vardır ve bunları ihmal etmek başarısızlığa yol açabilir. Bu yöntemi, ilgilenilen bir proteini (POI) kararlı bir şekilde aşırı eksprese eden veya ilgilenilen bir genin nakavtıyla (GOI) klonları elde etmek için başarıyla kullandık. İlaç konsantrasyonlarının seçilmesinin optimizasyonu, cam silindirlerin hazırlanması ve elde edilen klonların PCR, western blot analizi, immün boyama veya gDNA dizilimi (türetilmiş klonların türüne bağlı olarak) ile GOI ekspresyonunda istenen değişikliğe sahip olup olmadığının doğrulanması gibi hazırlık adımlarını açıklıyoruz. Ayrıca, iyi kurulmuş hücre hatlarının fenotipik heterojenliğini de tartışıyoruz, çünkü bu, kararlı hücre klonlarının elde edilmesinde bir sorun olabilir.

Memeli hücrelerinin stabil transfeksiyonu, kanser araştırmaları da dahil olmak üzere çeşitli hücre kültürü uygulamalarında rutin olarak kullanılan bir yöntemdir. Geçici transfeksiyona göre avantajı, sokulan yabancı genetik materyalin çevresel faktörler (örneğin, hücre birleşmesi veya replikasyon aşaması) ve hücre bölünmesi nedeniyle kaybolmamasıdır, çünkü konakçı^1'in genomuna entegre edilmiştir. Kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatlarının geliştirilmesi zahmetli ve zorlu olabilir, ancak uzun bir süre boyunca sürekli bir gen ekspresyonu gerekiyorsa, kararlı hücre hatlarının türetilmesi tercih edilen bir seçenektir. Transfeksiyonun en yaygın amacı, belirli bir genin veya gen ürününün işlevlerini, ekspresyonunun aşırı üretilmesi veya aşağı regülasyonu yoluyla incelemektir. Bununla birlikte, rekombinant proteinlerin üretimi ve genetik tedaviler de hücre^2'ye yabancı genetik materyalin girmesini gerektirir.

Bir klon, tek bir hücreden türetilen bir hücre popülasyonu olarak tanımlanır. Tek hücre klonlarının izolasyonu, genotipik ve fenotipik değişkenliğe sahip hücreleri incelerken hücre biyolojisinin çok önemli bir yönüdür. Hücre klonlarını türetmek için üç ana teknik kullanılır: seyreltme tekniği, klonlama halkası tekniği³ ve hücre sıralama tekniği⁴. Her birinin avantajları ve dezavantajları vardır. Cam silindir tekniğini kullanarak melanom hücre klonlarını izole etmek için bir yöntemin ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Bu yöntemin avantajı, hücrelerin düşük yoğunluklu hücre kültürlerinden orta derecede klonal büyüme göstermesidir. Ayrıca, seçilen hücreler zaten koloniler oluşturdukları için çoğalma kabiliyeti göstermişlerdir⁵. Bu prosedür, transfekte edilmiş hücrelerin seyrek olarak, ancak seyreltmeyi sınırlamadan, büyük bir kaba tohumlanmasını ve seçici bir antibiyotik varlığında 2-3 hafta boyunca genişlemelerine ve koloniler oluşturmalarına izin verilmesini içerir. Bireysel koloniler daha sonra kolonilerin üzerine yerleştirilen ve silikon gres kullanılarak kaba yapıştırılan cam silindirler kullanılarak izole edilebilir. Daha sonra, hücreler tripsin ile ayrılır ve daha sonra seçici bir ortamın varlığında daha fazla kültür için çok kuyulu plakalara aktarılır.

Klonların izolasyonunu anlatan bir dizi çalışma var, ancak biz 2 haftalık seçimden sonra klonların boyutu olması gerektiği, izolasyonları sırasında klonların konumunun nasıl işaretleneceği ve seçim için uygun bir antibiyotik konsantrasyonunun nasıl seçileceği gibi detayları göstermeye odaklanıyoruz. Tüm prosedürün başarısı için belirleyici olabilecek pratik tavsiyelere odaklanıyoruz. Sunulan protokol, 2-4 hafta içinde kararlı hücre klonları elde etmemizi sağlar. Yöntem kolay ve ucuzdur ve karmaşık ekipman gerektirmez. GSN KO klonları ^6,7,8 dahil olmak üzere birçok araştırma modeli elde etmemizi sağlayan bir tekniği paylaşıyoruz.

1. İlaç konsantrasyonu optimizasyonu için hücre alt kültürü ve tohumlama

1. Hücre kültürü ortamını (bu durumda, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın besiyerini azaltılmış konsantrasyonda (1.5 g / L) NaHCO₃,% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS),% 1 (h / h) L-glutamin ve% 1 (h / h) antibiyotik-antimikotik) ve tripsin çözeltisini bir su banyosunda 37 ° C'ye ısıtın.
2. Bir T25 hücre kültürü şişesinde büyüyen A735 hücrelerinden hücre kültürü ortamını aspire edin ve atın. Hücre hattı ticari kaynaklardan elde edilir.
3. Şişeyi 1 mL tripsin veya PBS çözeltisi ile yıkayarak hücrelerden kalan hücre kültürü ortamını yıkayın.
4. Tripsin veya PBS çözeltisini hücrelerden aspire edin ve atın.
5. Şişeye 1 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin ayrılmasını dikkatlice gözlemleyin.
6. 3 mL taze tam hücre kültürü ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini durdurun ve hücreler ayrıldığında hücre kültürü şişesini bununla durulayın.
7. Hücre süspansiyonunu şişeden 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
8. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
9. Süpernatanı aspire edin ve atın.
10. Taze hücre kültürü ortamının 1 mL'sindeki hücreleri yeniden süspanse edin.
11. Hücre yoğunluğunu hesaplamak için, hücreleri otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ile sayın.
12. Uygun büyüklükte bir kültür kabına uygun sayıda hücre tohumlayın.
    NOT: Bu deneyde, A375 hücre hattının 450.000 hücresi, 35 mm'lik bir kültür kabında 2 mL hücre kültürü ortamına ekildi.

2. Seçilen ilaç konsantrasyonunun optimizasyonu

1. Kararlı hücre klonlarını seçmek için kullanılacak ilacın üretici tarafından önerilen konsantrasyon aralığını bulun.
   NOT: Bir genetik vektör ile transfeksiyon yoluyla bir hücreye sokulan bir seçim geni, hücreye seçilim ilacına direnç sağlar. 1 μg/mL konsantrasyonda puromisin, genetik vektörün kararlı ekspresyonunu elde etmek ve transfekte edilmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için bir seçim belirteci olarak kullanıldı.
2. Ertesi gün% 50 birleşmeye ulaşmak için hücreleri 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına tohumlayın. Her ilaç konsantrasyonu ve tedavi edilmemiş bir kontrol için üç kuyu hazırlayın. Kuyu başına 10.000 hücre tohumlayın. Hücre sayısı, kullanılan hücre hattına bağlıdır ve ampirik olarak belirlenmesi gerekir.
3. 24 saat sonra, ilacın 10 seyreltmesini tam ortamda, üretici tarafından önerilen en düşük konsantrasyondan en yüksek konsantrasyona kadar hazırlayın ve hücrelere ekleyin.
   NOT: Bu olguda puromisin kullanılmıştır. Konsantrasyon aralığı 0-10 μg/mL idi. Her 3 günde bir veya ortamda çok sayıda ölü hücre görüldüğünde, taze ortama geçin.
4. Hücreleri bir hafta boyunca günlük olarak gözlemleyin ve kontrol plakasına göre birleşmeleri, çoğalmaları ve ölümleri ile ilgili notlar alın.
   NOT: Uygun bir konsantrasyon, hücrelerin çoğalmayı durdurduğu ve hemen hücre ölümüne neden olmadığı, ancak tedavi edilen tüm hücreleri 48-120 saat sonra öldürdüğü bir konsantrasyondur. Bununla birlikte, bazı hücre dizileri ve ilaç kombinasyonları için, hücrelerin çoğalmayı durdurduğu, ancak öldüğü bir aşama olmayabilir. Böyle bir durumda, tüm hücreleri öldüren en düşük ilaç konsantrasyonu seçim için uygun olacaktır.

3. Hücre tohumlama ve transfeksiyon

1. Hücreleri altı oyuklu bir plakanın kuyusuna tohumlayın.
   NOT: Hücre kültürü ortamındaki hücre süspansiyonunun son hacmi 2.5 mL olmalıdır. Bu deney için oyuk başına 450.000 hücre tohumlandı. Hücre sayısının ampirik olarak belirlenmesi gerekir, böylece birleşmeleri 48 saatlik tohumlamadan sonra% 90'ı geçemez.
2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 24 saat boyunca kültürleyin.
   NOT: Hücreler, transfeksiyondan önce 24 saat boyunca yetiştirildi. Bununla birlikte, tohumlamadan 48 saat sonra, hücrelerin daha verimli bir şekilde transfekte edildiği gözlendi.
3. Hücrelerin üzerindeki hücre kültürü ortamını aspire edin ve atın.
4. Atılan ortamı önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen hücre kültürü ortamı (%10 (h/h) FBS, glutamin takviyeli DMEM) ile değiştirin.
   NOT: Hücre kültürü ortamını değiştirme ihtiyacı, bazı transfeksiyon reaktiflerinin neden olduğu artan hücre geçirgenliğinden kaynaklanmaktadır, bu da hücrelere artan antibiyotik akışına neden olarak hücre ölümüne neden olabilir.
5. Transfeksiyon reaktiflerini antibiyotik ve serum içermeyen DMEM'de seyreltin. Polietilenimin (PEI), lipid bazlı transfeksiyon reaktifi veya elektroporasyon kullanın. Hücre transfeksiyonu için, 4 μg DNA için 1: 2.175 ağırlık oranında 2 mg / mL polietilenimin çözeltisi kullanın.
   NOT: Bir DNA çözeltisi olarak, CRISPR/Cas9 (D10A) sisteminde aşağıdaki gRNA dizileri ile iki plazmitin bir karışımı kullanıldı: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' ve 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
6. Transfeksiyon karışımını RT'de 30 dakika inkübe edin.
7. İnkübasyondan sonra, transfeksiyon karışımını altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarında büyüyen hücrelere damla damla dikkatlice ekleyin.
8. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 2-6 saat boyunca kültürleyin.
9. Ortamı tam hücre kültürü ortamına değiştirin.
10. Hücreleri 37 ° C'de, sonraki 24 saat boyunca% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde kültürleyin.

4. Hücre klonlarının üretilmesi

1. Transfekte edilmiş hücreleri, protokolün 1. bölümündeki talimatlara göre 20 mm kalıplanmış bir ızgaraya sahip 150 mm çapında bir kültür kabına tripsnize edin ve aktarın.
   NOT: Yüksek yoğunluk durumunda hücrelerin birbiriyle birleşmesi nedeniyle, hücrelerin iki hücre kültürü kabına eşit şekilde aktarılması önerilir. Kültür kabındaki ızgara, klonların bulunmasına ve göçlerinin izlenmesine yardımcı olur. Basılı bir tabak planında, daha sonra klonların yeri işaretlenebilir (Şekil 1B). Ek olarak, ortamın uzaklaştırılmasını ve havaya maruz kalmayı tolere etmeyen (ölüm/geri dönüşü olmayan hasarla sonuçlanan) hücreler için, bir tabaktan daha az koloniyi izole etmek için daha küçük bir yüzey alanına sahip daha fazla tabak kullanmak daha iyi olacaktır. Bu, klon izolasyonu sırasında havaya maruz kalma süresini azaltabilir ve hücre dehidrasyonu olasılığını azaltabilir.
2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 24 saat boyunca kültürleyin.
3. Hücre kültürü ortamını seçici bir antibiyotik içeren bir ortama değiştirin.
   NOT: Bu noktadan sonra, hücreleri seçici bir antibiyotik varlığında kültürlemek önemlidir; Aksi takdirde, entegre transgeni genden kesme şansı vardır.
4. Ortamı her 3 günde bir veya ortamda yüzen çok sayıda ölü hücre olduğunda değiştirin.
   NOT: Bu deneyde, hücreler 1 μg/mL konsantrasyonda puromisin ile inkübe edildi. Hücre klonu seçim aşaması yaklaşık 2 hafta sürer. Klonların oluşumu, büyümeleri ters mikroskop altında gözlemlenerek izlenmelidir, çünkü büyümemeleri ve komşu hücre klonları ile temas etmemeleri gerekir. Bir koloniden gelen hücrelerin başka bir koloni ile göç etmesi ve büyümesi engellenemez. Bu nedenle, klonlardan hücre göçü için plakayı gözlemlemek ve bununla ilgili bilgileri yemek planına not etmek önemlidir.

5. İzolasyon için klonların seçilmesi

1. Hücre klonları için hücre kültürü çanağını 10x veya 20x objektifli ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyin.
   NOT: Klonlar yaklaşık 500-30.000 hücreden oluşur. Ancak, kullanılan hücre hattına bağlıdır. Tatmin edici bir koloni diğer hücre kolonilerinden ayrılmalı ve ortalama büyüklükte olmalıdır, çünkü çok büyük ve olağanüstü klonlar birden fazla hücreden ortaya çıkabilir (Şekil 1B).
2. Çanağı dikkatlice inceleyerek ve bulunan klonları değerlendirerek ters çevrilmiş mikroskobu kullanarak uygun bir koloni bulun. İşaretleyiciyi, alttaki çanağın üzerine gelecek şekilde seçilen klonun konumuna yerleştirin. Eşzamanlı olarak, koloni lokalizasyonunu basılı tabak planında işaretleyin (Şekil 1B).
   NOT: Çanak yapraktan yaklaşık 20-30 koloni seçilmelidir. Bazen daha az hücre klonu elde edilir ve bu gibi durumlarda hepsinin izole edilmesi gerekir.

6. Cam silindirlerin hazırlanması

1. Klonların izolasyonundan önce, cam silindirleri (6.4 mm çapında ve 8 mm yüksekliğinde) (Şekil 1C) ilk cam Petri kabına yerleştirin ve otoklavlayın.
2. İkinci cam Petri kabını otoklavlayın.
3. İkinci otoklavlanmış cam Petri kabının altına ince bir tabaka silikon gres sürün. Çanağı laminer akış kabininin altına yerleştirin ve silikon yağını sterilize etmek için 30 dakika boyunca UV ışığı uygulayın.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, silikon gres otoklavlanabilir.
4. Otoklavlanmış silindirleri silikon gres kaplı bir Petri kabına daldırın. Şimdi klonları izole etmeye hazırlar.
5. Klonları izole ettikten sonra, silindirleri, işlendikleri hücresel malzeme için geçerli olan kurallara uygun olarak temizleyin. Genetik modifikasyon durumunda, sterilizasyon için sodyum hipoklorit kullanın.
6. Silindirleri silikon yağından arındırmak için gece boyunca ksilen ile yıkayın.
7. Ksilen çözeltisini çıkarmak için silindirleri kimyasal bir başlık altında deiyonize su ile yıkayın.
8. Silindirleri bir kağıt havlu üzerine koyun ve kurumasını bekleyin.
9. Silindirleri bir cam Petri kabında saklayın.
10. Bu kılavuzun 1. noktasından başlayarak silindirleri bir sonraki kullanımdan önce hazırlayın.

7. Klonların izolasyonu

1. Her oyukta 0.5 mL önceden ısıtılmış tam hücre kültürü ortamı içeren 24 oyuklu bir plaka hazırlayın.
2. 150 mm'lik bir tabakta büyüyen transfekte edilmiş hücreleri 15 mL ılık, steril PBS ile üç kez dikkatlice yıkayın. PBS'yi dikkatlice aspire edin ve atın.
3. Bir tarafında gres bulunan silindirleri aktarmak için steril cımbız kullanın. Tek hücreli klon kökenli büyüyen kolonilerin etrafında izole kuyular oluşturmak için işaretli klonların bulunduğu yerlerde bir kültür kabının altındaki silindirlere bastırın.
   NOT: Sıvıların sızmasını önlemek için silindir tabana iyi yapışmalıdır.
4. Her silindire 50 μL tripsin çözeltisi ekleyin ve birkaç dakika inkübe edin. Hücrelere enzimatik olarak zarar vermemeye dikkat edin. Kolonileri tek tek işleyin. Kolonileri diğerleriyle kirletmemek için her silindirin pipet ucunu değiştirmeyi unutmayın.
   NOT: Kuluçka süresi, kullanılan hücre hattına bağlıdır ve ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Tripsin çözeltisi, hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için yukarı ve aşağı pipetlenebilir. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre ayrılmasını dikkatlice izleyin. Hücre ayrılmasını takiben, her silindire 50 μL hücre kültürü ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini durdurun.
5. Hemen 100 μL hücre süspansiyonunu 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğunda ortama aktarın.
   NOT: Burada, klon büyümesi 0.5 μg / mL konsantrasyonda seçici bir antibiyotik ile devam ettirildi.
6. Hücre klonlarının 24 oyuklu plakadaki büyümesini izleyin ve %90 birleşime ulaştıklarında bunları altı oyuklu bir plakaya aktarın. Protokolün 1. bölümündeki talimatları izleyin; sadece tripsin (0.5 mL) ve durdurma ortamı (1.5 mL) hacimlerini değiştirin.
7. Altı oyuklu bir plakada büyüyen hücre klonlarını izleyin ve birleştiklerinde bunları T12.5 hücre kültürü şişesine aktarın.
8. T12.5 hücre kültürü şişesindeki hücre klonlarını gözlemleyin ve birleşime ulaştıklarında alt kültür oluşturun ve bunları otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanmak gibi uygun bir yöntemle sayın. Seçici antibiyotik,% 20 (h / v) FBS ve% 10 (h / h) DMSO ile% 70 tam ortam içeren ortamdaki hücrelerin yarısını dondurun. Hücrelerin geri kalanını, immünoboyama için lameller (12 mm x 12 mm) üzerine ve gDNA izolasyonu ve lizat hazırlığı için altı oyuklu bir plakanın iki kuyusuna tohumlayın.
   NOT: A375 hücre hattı söz konusu olduğunda, lamel başına 45.000 hücre ve altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 450.000 hücre tohumlayın.

8. Oluşturulan hücre klonlarının doğrulanması

1. İmmün boyama
   NOT: İlgilenilen proteinin (POI) ekspresyon seviyesini belirlemek için hücreler üzerinde immün boyama yapın. POI'nin ekspresyon seviyelerini karşılaştırabilmek için vahşi tip hücreleri veya kontrol klonlarını aynı anda bir kontrol olarak boyamak önemlidir (Şekil 2A).
   1. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve atın.
   2. Lameller üzerinde büyüyen hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
   3. Her bir oyuğa 0.5 mL% 4 formaldehit çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Farklı antikorlar farklı fiksasyon yöntemleri gerektirebilir.
   4. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
   5. Hücrelere nüfuz etmek için, lamelleri RT'de 5 dakika boyunca PBS'de% 0.1 Triton X-100 içinde inkübe edin.
      NOT: Farklı antikorlar farklı geçirgenleştirme yöntemleri gerektirebilir.
   6. Lamelleri PBS ile iki kez yıkayın.
   7. Lamelleri bir boyama odasına^{yerleştirin 9}.
   8. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için lamelleri %1 (a/h) BSA'da %0.1 (h/h) Triton X-100'de PBS çözeltisinde 30 dakika inkübe edin.
   9. Lameli kenarı bir iğne ve cımbız kullanarak bir lignin parçasının üzerine yerleştirerek çözeltiyi çıkarın.
   10. PBS'de% 1 (a / h) BSA ve% 0.1 (h / h) Triton X-100'de birincil antikorlardan oluşan bir boyama çözeltisi hazırlayın. Her lamel üzerine 30 μL çözelti damlatın ve nemli bir nem odasında 4 ° C'de 24 saat inkübe edin.
       NOT: Bu deneyde 1:200 seyreltmede fare anti-GSN antikoru kullanılmıştır.
   11. Lamelleri kenarları bir iğne ve cımbız kullanarak bir lignin parçasının üzerine yerleştirerek çözeltiyi çıkarın. Lamelleri 24 oyuklu bir tabağa yerleştirin.
   12. Lamelleri RT'de 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
   13. PBS çözeltisinde% 1 (a / h) BSA ve% 0.1 (h / h) Triton X-100'de ikincil antikorlar ve boyalar hazırlayın. Her lamel üzerine 30 μL çözelti damlatın ve karanlıkta RT'de 1 saat inkübe edin.
       NOT: 1:200 seyreltmede eşek anti-fare-floresan etiketli ikincil antikorlar 488 kullanın. F-aktin ve hücre çekirdeklerini tespit etmek için 1:200 seyreltmede phalloidin-Alexa Fluor 568 ve 1:1000 seyreltmede Hoechst 33342 kullandık.
   14. Lamelleri kenarları bir iğne ve cımbız kullanarak bir lignin parçasının üzerine yerleştirerek çözeltiyi çıkarın. Lamelleri 24 oyuklu bir tabağa yerleştirin.
   15. Lamelleri karanlıkta RT'de 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
   16. Lamelleri bir kez deiyonize su ile yıkayın.
   17. Lamelleri mikroskop camı üzerine montaj ortamı kullanarak monte edin.
   18. Türetilmiş klonlarda ifade edilen POI seviyesini belirlemek için konfokal bir mikroskop kullanarak hücre boyamayı görselleştirin (Şekil 2A).
2. Western Blot analizi
   NOT: Türetilmiş klonlarda POI ekspresyonunun eksikliğini, yüksek seviyesini veya düşük seviyesini doğrulamak için, standart koşullar¹⁰ altında western blot analizini gerçekleştirin. Yabani tip hücreleri veya kontrol klonlarını aynı anda analiz edin (Şekil 2B,C).
   1. Altı oyuklu bir plakanın kuyusunda büyüyen hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
   2. Hücreleri bir kazıyıcı kullanarak tercih ettiğiniz bir tampona hasat edin ve 20 saniye boyunca hafifçe girdap yapın. Numunenin dondurulması (-80 °C'de) ve çözülmesi (4 °C'de) olmak üzere üç döngü gerçekleştirin.
      NOT: Hücre iskeletine bağlı protein ekstraksiyon tamponu kullanın [10 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM etilen glikol-bis (2-aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na₄P₂O₇, 2 mM Na₃VO₄,% 1 (h / v) Triton X-100,% 10 (h / h) gliserol, % 0.1 (a / h) SDS,% 0.5 sodyum deoksikolat] veya üre tamponu [50 mM TRIS-HCl pH 7,% 5 (a / h) SDS,% 8.6 (a / h) sükroz, 74 mM üre, 1 mM DTT], her ikisi de 1: 100 proteaz inhibitörü kokteyli, 1: 100 serin fosfataz inhibitörü ve 1: 100 tirozin fosfataz inhibitörü ilavesiyle.
   3. Lizatları 12.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Numunelerdeki protein konsantrasyonunu belirleyin (ör., BCA testi ile).
      NOT: Tahlil, tampon bileşimi ile uyumluluğa bağlıdır.
   5. Numunelerin western blot analizini yapmak için, poliakrilamid jel (% 7 -% 15) üzerindeki her bir oyuğa 30 μg protein yükleyin.
   6. SDS-PAGE elektroforezi gerçekleştirin ve proteinleri bir nitroselüloz membrana aktarın.
   7. Membranı uygun antikorlarla boyayarak POI ekspresyonunun seviyesini görselleştirin (Şekil 2B,C).
      NOT: 1:2000 seyreltmede fare anti-GSN antikorları ve 1:200 seyreltmede fare anti-GAPDH antikorları kullanıldı. Ayrıntılar için kağıtlarımıza bakın ^2,11. Maruz kalma süresi, zayıf sinyallerin gözden kaçırılmaması için yeterince uzun olmalıdır (Şekil 2C).
3. gDNA analizi
   NOT: Türetilmiş klonlarda POI ekspresyon seviyesinin mikroskobik ve western blot teknikleri ile tahmin edilmesinden sonra, genomik DNA analiz edilmelidir. Elde edilen klonların gDNA şablonu üzerinde elde edilen PCR reaksiyon ürününün uzunluğunun karşılaştırılması, GOI dizisinin düzenlenip düzenlenmediği hakkında bilgi sağlar (Şekil 2D).
   1. Altı oyuklu bir plakanın kuyusunda büyüyen hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
   2. Hücreleri 1 mL PBS'de bir kazıyıcı kullanarak hasat edin.
   3. Hücreleri 5000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanları aspire edin ve atın.
      NOT: Peletler -80 °C'de birkaç ay saklanabilir.
   5. Ticari olarak temin edilebilen bir gDNA ekstraksiyon kiti kullanarak türetilmiş klonların peletlerinden gDNA'yı izole edin.
   6. CRISPR/Cas9 gen düzenleme bölgesinde gRNA hedefinin en az 300 bp yukarı ve aşağı akışını tavlayarak PCR primerleri tasarlayın.
      NOT: Aşağıdaki primerler kullanılmıştır: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
   7. Üreticinin talimatlarına göre DNA Polimeraz Master Mix kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      NOT: PCR reaksiyon karışımının bileşimi Tablo 1'de gösterilmiştir ve PCR reaksiyonu için termosikler ayarları Tablo 2'de sunulmuştur.
   8. PCR ürünlerini Tris-asetat-EDTA tamponunda (40 mM Tris pH 8.0, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) %1 veya %2 (a/h) agaroz jel içinde analiz edin.
   9. GSN KO klonlarının PCR ürün amplikon uzunluğunu, CTRL KO klonlarının PCR ürün uzunluğu (203 bp; Şekil 2D).
4. gDNA dizilimi
   1. CRISPR/Cas9(D10A) plazmitleri tarafından kodlanan gRNA'lar tarafından tanınan dizilerden yukarı ve aşağı akıştaki dizilere tavlayarak PCR primerleri tasarlayın.
      NOT: Astarları aşağıdaki gibi tasarlayın: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattgaacaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcagatcaattcaccagaacaggactaggc3'.
   2. Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz (böyle bir analiz, DNA amplifikasyonu sırasında yüksek doğruluk gerektirir) ve şablon olarak gDNA kullanarak PCR gerçekleştirin.
      NOT: PCR reaksiyon karışımının bileşimi Tablo 3'te gösterilmiştir ve PCR reaksiyonu için termosikler ayarları Tablo 4'te sunulmuştur.
   3. 37 ° C'de 1 saat inkübe ederek plazmidi çoklu klonlama bölgeleri içinde bir kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırın.
      NOT: Kısıtlama sindirim reaksiyonu karışımının bileşimi Tablo 5'te gösterilmiştir. Hangi plazmitin kullanıldığı önemli değildir. pACGFP-C1, EcoRI enzimi ile doğrusallaştırıldı.
   4. Eklerin konsantrasyonunu tahmin edin ve agaroz jel elektroforezi ile plazmidi kesin.
   5. DNA montaj reaksiyonlarını hazırlayın.
      NOT: Geleneksel bir klonlama yöntemi veya başka bir yöntem kullanılabilir.
   6. Yetkili bakterileri dönüştürün (örneğin, ısı şoku prosedürü ile)¹².
   7. Plazmitleri izole edin (örneğin, üreticinin talimatlarına veya belirtilen protokole göre yapı başına altı bakteri kolonisinden)¹³.
   8. Ek parçanın plazmide başarılı bir şekilde klonlanıp klonlanmadığını ve uzunluğunun kısıtlama sindirimi ve DNA elektroforezi ile uygun olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Seçilen koloniler bir eki olan bir plazmit içermiyorsa, plazmitler sonraki bakteri kolonilerinden izole edilmelidir.
   9. Plazmit dizilimi ile gen düzenlemesini onaylayın (Şekil 3).
      NOT: İki gen alelinin varlığı nedeniyle, türetilmiş her hücre klonu için en az iki farklı DNA dizilimi sonucu elde edilmelidir. Multiploid hücre hatları için (2 n'den büyük), elde edilen hücredeki tüm gen kopyalarının dizisini elde etmek için daha fazla plazmit dizilimi gereklidir. Genin tüm kopyalarının klonlanmış dizilerine sahip plazmitler izole edilene kadar gerektiği kadar koloniyi izole edin. İncelenen gen için lokus sayısını tahmin etmek için ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılabilir.
   10. Çoklu dizi hizalama programı kullanarak GSN KO ve CTRL KO klonları için elde edilen gDNA dizilerini karşılaştırın (Şekil 3).

Tablo 1. PCR reaksiyon karışımının bileşimi.

Tablo 2. PCR reaksiyonu için termodöngüleyici ayarları.

Tablo 3. PCR reaksiyon karışımının bileşimi.

Tablo 4. PCR reaksiyonu için termodöngüleyici ayarları.

Tablo 5. Kısıtlama sindirim reaksiyonu karışımının bileşimi.

9. Hücre hattının fenotipik heterojenliğini değerlendirin

1. POI ekspresyonunun seviyesini belirlemek için hücrelerin immün boyamasını gerçekleştirin.
2. Konfokal mikroskopta 60x yağa daldırma lensi kullanarak büyütme olmadan fotoğraf çekin.
3. Farklı seviyelerdeki hücrelerin dağılım oranını belirlemek için, çoğu mikroskobik görüntü analiz programında genellikle bulunan "aşırı / az pozlama" aracını kullanın. Az maruz kalan alanları gösteren hücreleri, POI'yi düşük seviyede üretiyor olarak değerlendirin. Aşırı pozlanmış hücreleri yüksek düzeyde POI ifadesine sahip hücreler olarak ve kalan hücreleri orta düzeyde POI eksprese eden hücreler olarak sınıflandırın.

Sunulan protokolü kullanarak, cam silindir yöntemi ile stabil şekilde transfekte edilmiş melanom hücre klonlarının izolasyonunun ayrıntılı bir gösterimini sağlıyoruz (Şekil 1A). Çalışmalarımız melanom hücre biyolojisi ile ilgilidir ve kullandığımız en yaygın araştırma modeli, yapışık ve oldukça invaziv A375 melanom hattıdır. Araştırmamız, melanom hücrelerinin diğer kanser türlerine kıyasla yüksek düzeyde jelsolin (GS...

Cam silindirlerle stabil şekilde transfekte edilmiş melanom hücre klonlarının izolasyonunun ayrıntılı bir tanımını sağladık. Değiştirilmiş gen ekspresyonu ile klonlar türetilirken kontrol klonlarının elde edilmesi önemlidir, çünkü hedeflenen modifikasyon klonları için elde edilen sonuçlar her zaman kontroller için elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmalıdır. Bu şekilde, transfeksiyonun kendisinin veya seçici bir antibiyotikle kültürün, tanıtılan ...

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklenmiştir (proje #2016/22/E/NZ3/00654, AJM'ye hibe edilmiştir).