Isolement de clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable

Un protocole est décrit pour isoler des clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable à l’aide de cylindres de verre. Nous nous concentrons sur des conseils pratiques qui peuvent être décisifs pour le succès de l’ensemble de la procédure.

Les populations cellulaires qui ont des changements stables dans leurs informations génomiques sont largement utilisées par les scientifiques comme modèle de recherche. Ils ne nécessitent pas de transfection cellulaire répétée car cela peut conduire à une population cellulaire hétérogène et à une efficacité de transfection variable, affectant la reproductibilité. De plus, ils sont préférables pour les analyses à grande échelle. La génération de clones cellulaires stables est utile pour un large éventail d’applications, telles que la recherche sur les fonctions des gènes et la production de protéines recombinantes. Il existe plusieurs méthodes pour obtenir une population cellulaire homogène lors de la transfection transitoire initiale. Ici, nous décrivons l’isolement de clones unicellulaires avec des cylindres de verre. Bien que cette méthode soit connue depuis un certain temps, il y a quelques étapes cruciales, et les négliger peut conduire à l’échec. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour obtenir des clones surexprimant de manière stable une protéine d’intérêt (POI) ou avec knock-out d’un gène d’intérêt (GOI). Nous décrivons les étapes de préparation telles que l’optimisation de la sélection des concentrations de médicaments, la préparation des cylindres de verre et la validation de la modification souhaitée de l’expression du GOI par PCR, analyse par transfert Western, immunocoloration ou séquençage de l’ADNg (selon le type de clones dérivés). Nous discutons également de l’hétérogénéité phénotypique des lignées cellulaires bien établies, car cela pourrait être un problème pour obtenir des clones cellulaires stables.

La transfection stable de cellules de mammifères est une méthode couramment utilisée dans plusieurs applications de culture cellulaire, y compris la recherche sur le cancer. Son avantage par rapport à la transfection transitoire est que le matériel génétique étranger introduit ne peut pas être perdu en raison de facteurs environnementaux (par exemple, la confluence cellulaire ou le stade de réplication) et de la division cellulaire, car il est intégré dans le génome de l’hôte¹. Le développement de lignées cellulaires exprimant de manière stable peut être laborieux et difficile, mais si une expression soutenue des gènes est nécessaire sur une période prolongée, la dérivation de lignées cellulaires stables est une option privilégiée. L’objectif le plus courant de la transfection est d’étudier les fonctions d’un gène spécifique ou d’un produit génique par surproduction ou régulation négative de son expression. Cependant, la production de protéines recombinantes et les thérapies géniques nécessitent également l’introduction de matériel génétique étranger dans la cellule².

Un clone est défini comme une population cellulaire dérivée d’une cellule individuelle. L’isolement de clones de cellules uniques est un aspect crucial de la biologie cellulaire lors de l’étude de cellules présentant une variabilité génotypique et phénotypique. Trois techniques principales sont utilisées pour obtenir des clones cellulaires : la technique de dilution, la technique de clonage de l’anneau³ et la technique de tri cellulaire⁴. Chacun a des avantages et des inconvénients. Nous fournissons une description détaillée d’une méthode permettant d’isoler des clones de cellules de mélanome à l’aide de la technique du cylindre de verre. L’avantage de cette méthode est que les cellules présentent une croissance clonale modérée à partir de cultures cellulaires de faible densité. De plus, les cellules sélectionnées ont déjà démontré leur capacité de prolifération puisqu’elles ont déjà formé des colonies⁵. Cette procédure consiste à ensemencer les cellules transfectées de manière clairsemée, mais sans dilution limite, dans un grand vaisseau et à leur permettre de se développer et de former des colonies pendant 2 à 3 semaines en présence d’un antibiotique sélectif. Les colonies individuelles peuvent ensuite être isolées à l’aide de cylindres de verre qui sont placés sur les colonies et collés au récipient à l’aide de graisse de silicone. Ensuite, les cellules sont détachées avec de la trypsine, puis transférées sur des plaques multipuits pour une culture ultérieure en présence d’un milieu sélectif.

Il existe un certain nombre d’études décrivant l’isolement des clones, mais nous nous concentrons sur la présentation de détails tels que la taille des clones après 2 semaines de sélection, comment marquer l’emplacement des clones pendant leur isolement et comment choisir une concentration appropriée d’antibiotique pour la sélection. Nous nous concentrons sur des conseils pratiques qui peuvent être décisifs pour le succès de l’ensemble de la procédure. Le protocole présenté nous permet d’obtenir des clones cellulaires stables en 2 à 4 semaines. La méthode est facile et peu coûteuse et ne nécessite pas d’équipement compliqué. Nous partageons une technique qui nous a permis d’obtenir de nombreux modèles de recherche, y compris les clones GSN KO ^6,7,8.

1. Sous-culture cellulaire et ensemencement pour l’optimisation de la concentration de médicaments

1. Réchauffer le milieu de culture cellulaire (dans ce cas, le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco avec une concentration réduite (1,5 g/L) de NaHCO₃, 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % (v/v) de L-glutamine et 1 % (v/v) d’antibiotique-antimycotique) et une solution de trypsine dans un bain-marie à 37 °C.
2. Aspirez et jetez le milieu de culture cellulaire des cellules A735 qui poussent dans une fiole de culture cellulaire T25. La lignée cellulaire est obtenue à partir de sources commerciales.
3. Laver tout milieu de culture cellulaire restant des cellules en lavant le ballon avec 1 mL de trypsine ou de solution de PBS.
4. Aspirez et jetez la solution de trypsine ou de PBS des cellules.
5. Ajouter 1 mL de solution de trypsine dans le ballon et l’incuber à 37 °C. Observez attentivement le détachement des cellules à l’aide d’un microscope inversé.
6. Arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de culture cellulaire complet frais et rincez le ballon de culture cellulaire avec celui-ci lorsque les cellules se détachent.
7. Transférez la suspension cellulaire du ballon dans un tube à centrifuger de 15 ml.
8. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
9. Aspirez et jetez le surnageant.
10. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture cellulaire frais.
11. Pour calculer la densité cellulaire, comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules ou d’un hémocytomètre.
12. Ensemencez le nombre approprié de cellules dans une boîte de culture de la taille appropriée.
    REMARQUE : Dans cette expérience, 450 000 cellules de la lignée cellulaire A375 ont été ensemencées dans 2 ml de milieu de culture cellulaire dans une boîte de culture de 35 mm.

2. Optimisation de la concentration du médicament sélectionné

1. Trouvez la plage de concentration recommandée par le fabricant du médicament à utiliser pour sélectionner des clones de cellules stables.
   REMARQUE : Un gène de sélection introduit dans une cellule par transfection avec un vecteur génétique confère à la cellule une résistance au médicament de sélection. La puromycine à une concentration de 1 μg/mL a été utilisée comme marqueur de sélection pour obtenir une expression stable du vecteur génétique et éliminer les cellules non transfectées.
2. Ensemencez les cellules dans les puits d’une plaque de 96 puits pour atteindre une confluence de 50 % le lendemain. Préparez trois puits pour chaque concentration de médicament et un témoin non traité. Ensemencez 10 000 cellules par puits. Le nombre de cellules dépend de la lignée cellulaire utilisée et doit être déterminé empiriquement.
3. Après 24 h, préparez 10 dilutions du médicament dans le milieu complet de la concentration la plus faible à la concentration la plus élevée recommandée par le fabricant et ajoutez-les aux cellules.
   REMARQUE : Dans ce cas, la puromycine a été utilisée. La plage de concentration était de 0 à 10 μg/mL. Tous les 3 jours, ou lorsque de nombreuses cellules mortes sont observées dans le milieu, passez au milieu frais.
4. Observez les cellules tous les jours pendant une semaine et prenez des notes concernant leur confluence, leur prolifération et leur mort par rapport à la plaque de contrôle.
   REMARQUE : Une concentration appropriée est une concentration à laquelle les cellules cessent de proliférer et ne provoque pas la mort cellulaire immédiatement, mais tue toutes les cellules traitées après 48 à 120 heures. Cependant, pour certaines combinaisons de lignées cellulaires et de médicaments, il peut ne pas y avoir de phase où les cellules cessent de proliférer mais meurent. Dans une telle situation, la concentration la plus faible de médicament qui tue toutes les cellules serait appropriée pour la sélection.

3. Ensemencement et transfection des cellules

1. Ensemencez les cellules dans un puits d’une plaque à six puits.
   REMARQUE : Le volume final de la suspension cellulaire dans le milieu de culture cellulaire doit être de 2,5 ml. Pour cette expérience, 450 000 cellules par puits ont été ensemencées. Le nombre de cellules doit être déterminé empiriquement afin que leur confluence ne dépasse pas 90 % après 48 h d’ensemencement.
2. Cultivez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   REMARQUE : Les cellules ont été cultivées pendant 24 h avant la transfection. Cependant, 48 h après l’ensemencement, il a été observé que les cellules étaient transfectées plus efficacement.
3. Aspirez et jetez le milieu de culture cellulaire au-dessus des cellules.
4. Remplacez le milieu jeté par un milieu de culture cellulaire préchauffé sans antibiotiques (10 % (v/v) FBS, DMEM supplémenté en glutamine).
   REMARQUE : La nécessité de changer le milieu de culture cellulaire est due à l’augmentation de la perméabilité cellulaire causée par certains réactifs de transfection, ce qui peut provoquer un afflux accru d’antibiotiques dans les cellules, entraînant la mort cellulaire.
5. Réactifs de transfection dilués dans du DMEM sans antibiotiques ni sérum Utilisez de la polyéthylèneimine (PEI), un réactif de transfection à base de lipides ou une électroporation. Pour la transfection cellulaire, utiliser une solution de polyéthylèneimine à 2 mg/mL dans un rapport pondéral de 1:2,175 pour 4 μg d’ADN.
   REMARQUE : Comme solution d’ADN, un mélange de deux plasmides a été utilisé dans le système CRISPR/Cas9(D10A) avec les séquences d’ARNg suivantes : 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' et 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
6. Incuber le mélange de transfection pendant 30 min à RT.
7. Après l’incubation, ajoutez délicatement le mélange de transfection goutte à goutte aux cellules qui se développent dans les puits d’une plaque à six puits.
8. Cultivez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ pendant 2 à 6 h.
9. Remplacez le milieu par le milieu de culture cellulaire complet.
10. Cultivez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ pendant les 24 prochaines heures.

4. Génération de clones cellulaires

1. Trypsiniser et transférer les cellules transfectées dans une boîte de culture de 150 mm de diamètre avec une grille moulée de 20 mm selon les instructions de la section 1 du protocole.
   REMARQUE : En raison de la fusion des cellules les unes avec les autres dans le cas d’une densité élevée, il est recommandé de transférer les cellules uniformément dans deux boîtes de culture cellulaire. La grille sur la parabole de culture aide à localiser les clones et à suivre leur migration. Sur un plan de parabole imprimé, on peut ensuite marquer l’emplacement des clones (Figure 1B). De plus, pour les cellules qui ne tolèrent pas l’enlèvement du milieu et l’exposition à l’air (entraînant la mort ou des dommages irréversibles), il serait préférable d’utiliser plus de boîtes avec une plus petite surface pour isoler moins de colonies d’une seule boîte. Cela pourrait réduire le temps d’exposition à l’air pendant l’isolement des clones et réduire la probabilité de déshydratation cellulaire.
2. Cultivez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ pendant 24 h.
3. Remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu contenant un antibiotique sélectif.
   REMARQUE : À partir de ce moment, il est important de cultiver les cellules en présence d’un antibiotique sélectif ; Sinon, il y a une chance de couper le transgène intégré du gène.
4. Changez de milieu tous les 3 jours ou lorsqu’il y a beaucoup de cellules mortes flottant dans le milieu.
   REMARQUE : Dans cette expérience, les cellules ont été incubées avec de la puromycine à une concentration de 1 μg/mL. L’étape de sélection du clone cellulaire prend environ 2 semaines. La formation des clones doit être surveillée en observant leur croissance au microscope inversé, car ils ne doivent pas croître et entrer en contact avec les clones cellulaires voisins. Les cellules d’une colonie ne peuvent pas être empêchées de migrer et de croître avec une autre colonie. Par conséquent, il est important d’observer la plaque pour la migration cellulaire des clones et de noter les informations à ce sujet sur le plan de la parabole.

5. Choisir les clones pour l’isolement

1. Examinez la boîte de culture cellulaire à la recherche de clones cellulaires au microscope inversé avec un objectif 10x ou 20x.
   REMARQUE : Les clones sont constitués d’environ 500 à 30 000 cellules. Cependant, cela dépend de la lignée cellulaire utilisée. Une colonie satisfaisante doit être séparée des autres colonies cellulaires et être de taille moyenne, car des clones très grands et exceptionnels peuvent provenir de plus d’une cellule (figure 1B).
2. Trouvez une colonie appropriée à l’aide du microscope inversé en examinant soigneusement la boîte et en évaluant les clones trouvés. Placez le marqueur à l’emplacement du clone sélectionné avec le marqueur sur la parabole en dessous. En même temps, marquez l’emplacement de la colonie sur le plan de la parabole imprimé (Figure 1B).
   REMARQUE : Environ 20 à 30 colonies de la boîte doivent être sélectionnées. Parfois, moins de clones cellulaires sont obtenus, et tous doivent être isolés dans de tels cas.

6. Préparation des cylindres de verre

1. Avant d’isoler les clones, placez les cylindres de verre (6,4 mm de diamètre et 8 mm de hauteur) (Figure 1C) dans la première boîte de Pétri en verre et autoclavez-les.
2. Autoclave la deuxième boîte de Pétri en verre.
3. Appliquez une fine couche de graisse silicone au fond de la deuxième boîte de Pétri en verre autoclave. Placez le plat sous une armoire à flux laminaire et appliquez une lumière UV pendant 30 min pour stériliser la graisse silicone.
   REMARQUE : En option, la graisse silicone peut être autoclavée.
4. Plongez les cylindres autoclavés dans une boîte de Pétri recouverte de graisse silicone. Maintenant, ils sont prêts à isoler les clones.
5. Après avoir isolé les clones, nettoyez les cylindres conformément aux règles applicables au matériau cellulaire avec lequel ils sont manipulés. En cas de modification génétique, utilisez de l’hypochlorite de sodium pour la stérilisation.
6. Lavez les cylindres avec du xylène pendant la nuit pour les débarrasser de la graisse silicone.
7. Lavez les cylindres à l’eau déminéralisée sous une hotte chimique pour éliminer la solution de xylène.
8. Mettez les cylindres sur une serviette en papier et laissez-les sécher.
9. Conservez les cylindres dans une boîte de Pétri en verre.
10. Préparez les cylindres avant la prochaine utilisation, en commençant par le point 1 de ce manuel.

7. Isolement des clones

1. Préparez une plaque de 24 puits contenant 0,5 mL de milieu de culture cellulaire complet préchauffé dans chaque puits.
2. Lavez soigneusement les cellules transfectées qui se développent sur une boîte de 150 mm trois fois avec 15 ml de PBS chaud et stérile. Aspirez et jetez soigneusement le PBS.
3. Utilisez une pince à épiler stérile pour transférer les cylindres qui ont de la graisse d’un côté. Appuyez sur les cylindres au fond d’une boîte de culture sur les sites des clones marqués pour créer des puits isolés autour des colonies en croissance d’origine de clones unicellulaires.
   REMARQUE : La bouteille doit bien coller au fond pour éviter les fuites de liquides.
4. Ajouter 50 μL de solution de trypsine dans chaque cylindre et incuber pendant quelques minutes. Veillez à ne pas endommager les cellules par voie enzymatique. Traitez les colonies une par une. N’oubliez pas de changer l’embout de la pipette pour chaque cylindre afin de ne pas contaminer les colonies avec d’autres.
   REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la lignée cellulaire utilisée et doit être déterminé empiriquement. La solution de trypsine peut être pipetée de haut en bas pour faciliter le détachement des cellules. Surveillez attentivement le détachement cellulaire à l’aide d’un microscope inversé. Après le détachement cellulaire, arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant 50 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque cylindre.
5. Transférez immédiatement 100 μL de la suspension cellulaire dans le milieu dans un puits d’une plaque à 24 puits.
   REMARQUE : Ici, la croissance des clones a été poursuivie à l’aide d’un antibiotique sélectif à une concentration de 0,5 μg/mL.
6. Surveillez la croissance des clones cellulaires dans la plaque à 24 puits et, lorsqu’ils atteignent 90 % de confluence, transférez-les sur une plaque à six puits. Suivre les instructions de la section 1 du protocole ; changer seulement les volumes de trypsine (0,5 ml) et de milieu d’arrêt (1,5 ml).
7. Surveillez les clones cellulaires qui se développent dans une plaque à six puits et, lorsqu’ils atteignent la confluence, transférez-les dans le flacon de culture cellulaire T12.5.
8. Observez les clones cellulaires dans la fiole de culture cellulaire T12.5 et, lorsqu’ils atteignent la confluence, la sous-culture et comptez-les avec une méthode appropriée, telle que l’utilisation d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre. Congelez la moitié des cellules dans le milieu contenant 70 % de milieu complet avec un antibiotique sélectif, 20 % (v/v) de FBS et 10 % (v/v) de DMSO. Ensemencer le reste des cellules sur des lamelles (12 mm x 12 mm) pour l’immunomarquage et dans deux puits d’une plaque à six puits pour l’isolement de l’ADNg et la préparation du lysat.
   REMARQUE : Dans le cas de la lignée cellulaire A375, amorcer 45 000 cellules par lamelle et 450 000 cellules par puits d’une plaque à six puits.

8. Validation des clones cellulaires générés

1. Immunomarquage
   REMARQUE : Effectuer un immunomarquage sur les cellules pour déterminer le niveau d’expression de la protéine d’intérêt (POI). Il est important de colorer simultanément des cellules de type sauvage ou des clones de contrôle en tant que témoin pour pouvoir comparer les niveaux d’expression du POI (Figure 2A).
   1. Aspirez et jetez le milieu de culture cellulaire.
   2. Lavez les cellules qui se développent sur les lamelles trois fois avec du PBS.
   3. Fixez les cellules en ajoutant 0,5 mL de solution de formaldéhyde à 4 % dans chaque puits et incubez-les pendant 20 min à RT.
      REMARQUE : Différents anticorps peuvent nécessiter différentes méthodes de fixation.
   4. Lavez les cellules deux fois avec du PBS.
   5. Pour perméabiliser les cellules, incuber les lamelles dans du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 5 min à RT.
      REMARQUE : Différents anticorps peuvent nécessiter différentes méthodes de perméabilisation.
   6. Lavez les lamelles deux fois avec du PBS.
   7. Placez les lamelles dans une chambre de coloration⁹.
   8. Incuber les lamelles dans du BSA à 1 % (p/v) dans du Triton X-100 à 0,1 % (v/v) dans une solution PBS pendant 30 min à RT pour éviter la liaison non spécifique des anticorps.
   9. Retirez la solution en plaçant la lamelle avec le bord sur un morceau de lignine à l’aide d’une aiguille et d’une pince à épiler.
   10. Préparez une solution de coloration composée d’anticorps primaires dans 1 % (p/v) de BSA et de 0,1 % (v/v) de Triton X-100 dans du PBS. Déposez 30 μL de solution sur chaque lamelle et incubez-les pendant 24 h à 4 °C dans une chambre humide et humide.
       REMARQUE : Un anticorps anti-GSN de souris à dilution de 1:200 a été utilisé dans cette expérience.
   11. Retirez la solution en plaçant les lamelles avec le bord sur un morceau de lignine à l’aide d’une aiguille et d’une pince à épiler. Placez les lamelles dans une plaque à 24 puits.
   12. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS pendant 5 min à RT.
   13. Préparez des anticorps secondaires et des colorants dans du BSA à 1 % (p/v) et du Triton X-100 à 0,1 % (v/v) dans une solution de PBS. Déposez 30 μL de solution sur chaque lamelle et incubez-les pendant 1 h à RT dans l’obscurité.
       REMARQUE : Utilisez des anticorps secondaires marqués anti-souris fluorescents d’âne 488 à une dilution de 1:200. Pour détecter l’actine F et les noyaux cellulaires, nous avons utilisé la phalloïdine-Alexa Fluor 568 à une dilution de 1:200 et le Hoechst 33342 à une dilution de 1:1000.
   14. Retirez la solution en plaçant les lamelles avec le bord sur un morceau de lignine à l’aide d’une aiguille et d’une pince à épiler. Placez les lamelles dans une plaque à 24 puits.
   15. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS pendant 5 minutes à RT dans l’obscurité.
   16. Lavez les lamelles une fois avec de l’eau déminéralisée.
   17. Montez les lamelles à l’aide d’un support de montage sur le verre du microscope.
   18. Visualisez la coloration cellulaire à l’aide d’un microscope confocal pour établir le niveau de POI exprimé dans les clones dérivés (Figure 2A).
2. Analyse par transfert Western
   REMARQUE : Pour confirmer l’absence, le niveau élevé ou le niveau réduit d’expression du POI dans les clones dérivés, effectuez l’analyse par transfert Western dans des conditions standard¹⁰. Analysez simultanément les cellules de type sauvage ou les clones de contrôle (Figures 2B et C).
   1. Lavez trois fois les cellules qui se développent dans le puits d’une plaque à six puits avec du PBS.
   2. Récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir jusqu’à ce qu’elles soient dans un tampon de votre choix et faites un tourbillon doux pendant 20 s. Effectuez trois cycles de congélation (à -80 °C) et de décongélation (à 4 °C) de l’échantillon.
      REMARQUE : Utiliser soit un tampon d’extraction de protéines lié au cytosquelette [10 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1 mM d’éthylène glycol-bis(2-aminoéthyl éther)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na₄P₂O₇, 2 mM Na₃VO₄, 1 % (v/v) Triton X-100, 10 % (v/v) de glycérol, 0,1 % (p/v) de SDS, 0,5 % de désoxycholate de sodium] ou tampon d’urée [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5 % (p/v) SDS, 8,6 % (p/v) de saccharose, 74 mM d’urée, 1 mM de DTT], les deux avec l’ajout d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase 1:100, d’un inhibiteur de la sérine phosphatase 1:100 et d’un inhibiteur de tyrosine phosphatase 1:100.
   3. Centrifuger les lysats à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
   4. Déterminer la concentration en protéines dans les échantillons (p. ex., au moyen d’un dosage de l’ACB).
      REMARQUE : Le test dépend de la compatibilité avec la composition du tampon.
   5. Pour effectuer une analyse par transfert Western des échantillons, chargez 30 μg de protéines dans chaque puits sur du gel de polyacrylamide (7 % à 15 %).
   6. Effectuez une électrophorèse SDS-PAGE et transférez les protéines dans une membrane de nitrocellulose.
   7. Visualisez le niveau d’expression du POI en colorant la membrane avec des anticorps appropriés (Figures 2B,C).
      REMARQUE : Des anticorps anti-GSN de souris à une dilution de 1:2000 et des anticorps anti-GAPDH de souris à une dilution de 1:200 ont été utilisés. Voir nos articles pour plus de détails ^2,11. Le temps d’exposition doit être suffisamment long pour que les signaux faibles ne soient pas négligés (Figure 2C).
3. Analyse de l’ADNg
   REMARQUE : Après l’estimation du niveau d’expression du POI dans les clones dérivés par des techniques de microscopie et de western blot, l’ADN génomique doit être analysé. Une comparaison de la longueur du produit de réaction PCR obtenu sur la matrice d’ADNg des clones obtenus permet de savoir si la séquence du GOI a été modifiée (figure 2D).
   1. Lavez trois fois les cellules qui se développent dans le puits d’une plaque à six puits avec du PBS.
   2. Récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir dans 1 mL de PBS.
   3. Centrifuger les cellules à 5000 x g pendant 5 min à 4 °C.
   4. Aspirez et jetez les surnageants.
      REMARQUE : Les granulés peuvent être conservés pendant plusieurs mois à -80 °C.
   5. Isolez l’ADNg à partir de pastilles de clones dérivés à l’aide d’un kit d’extraction d’ADNg disponible dans le commerce.
   6. Concevez des amorces PCR en recuit d’au moins 300 pb en amont et en aval de la cible de l’ARNg sur le site d’édition de gènes CRISPR/Cas9.
      REMARQUE : Les amorces suivantes ont été utilisées : Fwd : 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev : 5'ccctgttactggtgcatc3'.
   7. Effectuez des réactions PCR à l’aide de l’ADN polymérase Master Mix selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : La composition du mélange réactionnel PCR est indiquée dans le Tableau 1, et les paramètres du thermocycleur pour la réaction PCR sont présentés dans le Tableau 2.
   8. Analysez les produits PCR dans un gel d’agarose à 1 % ou 2 % (p/v) dans un tampon Tris-acétate-EDTA (40 mM Tris pH 8,0, 20 mM d’acide acétique, 1 mM d’EDTA).
   9. Comparez la longueur de l’amplicon du produit PCR des clones de GSN KO à la longueur du produit PCR des clones de CTRL KO (203 pb ; Figure 2D).
4. Séquençage de l’ADNg
   1. Concevoir des amorces de PCR par recuit aux séquences en amont et en aval des séquences reconnues par les ARNg codés par les plasmides CRISPR/Cas9(D10A).
      REMARQUE : Concevez les amorces comme suit : Fwd : 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev : 5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
   2. Effectuez une PCR à l’aide de l’ADN polymérase haute fidélité (une telle analyse nécessite une grande précision lors de l’amplification de l’ADN) et de l’ADNg comme modèle.
      REMARQUE : La composition du mélange réactionnel PCR est indiquée dans le tableau 3, et les paramètres du thermocycleur pour la réaction PCR sont présentés dans le tableau 4.
   3. Linéariser le plasmide avec une enzyme de restriction dans plusieurs sites de clonage en l’incubant pendant 1 h à 37°C.
      REMARQUE : La composition du mélange de réaction de digestion de restriction est indiquée dans le Tableau 5. Peu importe le plasmide utilisé. pACGFP-C1 a été linéarisé avec l’enzyme EcoRI.
   4. Estimer la concentration des inserts et du plasmide coupé par électrophorèse sur gel d’agarose.
   5. Préparez les réactions d’assemblage de l’ADN.
      REMARQUE : Une méthode de clonage traditionnelle ou toute autre méthode peut être utilisée.
   6. Transformer les bactéries compétentes (par exemple, par une procédure de choc thermique)¹².
   7. Isolez les plasmides (p. ex., à partir de six colonies de bactéries par construction, selon les instructions du fabricant ou le protocole cité)¹³.
   8. Vérifiez si l’insert a été cloné avec succès dans le plasmide et que sa longueur est appropriée par digestion par restriction et électrophorèse de l’ADN.
      REMARQUE : Si les colonies sélectionnées ne contiennent pas de plasmide avec insert, les plasmides doivent être isolés des colonies bactériennes suivantes.
   9. Confirmer l’édition de gènes par séquençage plasmidique (Figure 3).
      REMARQUE : Il faut obtenir au moins deux résultats différents de séquençage de l’ADN pour chaque clone de cellule dérivée en raison de l’existence de deux allèles de gènes. Pour les lignées cellulaires multiploïdes (supérieures à 2 n), il est nécessaire de séquencer plus de plasmides pour obtenir la séquence de toutes les copies de gènes de la cellule obtenues. Isolez autant de colonies que nécessaire jusqu’à ce que les plasmides avec les séquences clonées de toutes les copies du gène soient isolés. On peut utiliser un kit disponible dans le commerce pour estimer le nombre de loci pour le gène étudié.
   10. Comparez les séquences d’ADNg obtenues pour les clones GSN KO et CTRL KO à l’aide d’un programme d’alignement de séquences multiples (Figure 3).

Tableau 1. Composition du mélange réactionnel PCR.

Tableau 2. Paramètres du thermocycleur pour la réaction PCR.

Tableau 3. Composition du mélange réactionnel PCR.

Tableau 4. Paramètres du thermocycleur pour la réaction PCR.

Tableau 5. Composition du mélange de réaction de digestion de restriction.

9. Évaluer l’hétérogénéité phénotypique de la lignée cellulaire

1. Effectuer l’immunocoloration des cellules pour déterminer le niveau d’expression des POI.
2. Prenez des photos sans grossissement à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 60x dans un microscope confocal.
3. Pour établir le rapport de distribution de cellules de différents niveaux, utilisez l’outil « surexposition/sous-exposition » qui est généralement disponible dans la plupart des programmes d’analyse d’images microscopiques. Traiter les cellules qui montrent des zones sous-exposées comme produisant le POI à un faible niveau. Classez les cellules surexposées comme des cellules avec un niveau élevé d’expression du POI et les cellules restantes comme exprimant le POI à un niveau moyen.

À l’aide du protocole présenté, nous fournissons une démonstration détaillée de l’isolement de clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable avec la méthode du cylindre de verre (Figure 1A). Nos études portent sur la biologie cellulaire du mélanome, et le modèle de recherche le plus courant que nous utilisons est la lignée de mélanome A375, adhérente et hautement invasive. Comme nos recherches ont montré que les cellules d...

Nous avons fourni une description détaillée de l’isolement de clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable avec des cylindres de verre. Il est important d’obtenir des clones de contrôle lors de la dérivation de clones avec une expression modifiée des gènes, car les résultats obtenus pour les clones de modification ciblés doivent toujours être comparés aux résultats obtenus pour les témoins. De cette façon, nous pouvons vérifier si la transfection elle...

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ce travail a été soutenu par le Centre national pour la science, Pologne (projet #2016/22/E/NZ3/00654, accordé à AJM).