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Method Article
Un protocole est décrit pour isoler des clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable à l’aide de cylindres de verre. Nous nous concentrons sur des conseils pratiques qui peuvent être décisifs pour le succès de l’ensemble de la procédure.
Les populations cellulaires qui ont des changements stables dans leurs informations génomiques sont largement utilisées par les scientifiques comme modèle de recherche. Ils ne nécessitent pas de transfection cellulaire répétée car cela peut conduire à une population cellulaire hétérogène et à une efficacité de transfection variable, affectant la reproductibilité. De plus, ils sont préférables pour les analyses à grande échelle. La génération de clones cellulaires stables est utile pour un large éventail d’applications, telles que la recherche sur les fonctions des gènes et la production de protéines recombinantes. Il existe plusieurs méthodes pour obtenir une population cellulaire homogène lors de la transfection transitoire initiale. Ici, nous décrivons l’isolement de clones unicellulaires avec des cylindres de verre. Bien que cette méthode soit connue depuis un certain temps, il y a quelques étapes cruciales, et les négliger peut conduire à l’échec. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour obtenir des clones surexprimant de manière stable une protéine d’intérêt (POI) ou avec knock-out d’un gène d’intérêt (GOI). Nous décrivons les étapes de préparation telles que l’optimisation de la sélection des concentrations de médicaments, la préparation des cylindres de verre et la validation de la modification souhaitée de l’expression du GOI par PCR, analyse par transfert Western, immunocoloration ou séquençage de l’ADNg (selon le type de clones dérivés). Nous discutons également de l’hétérogénéité phénotypique des lignées cellulaires bien établies, car cela pourrait être un problème pour obtenir des clones cellulaires stables.
La transfection stable de cellules de mammifères est une méthode couramment utilisée dans plusieurs applications de culture cellulaire, y compris la recherche sur le cancer. Son avantage par rapport à la transfection transitoire est que le matériel génétique étranger introduit ne peut pas être perdu en raison de facteurs environnementaux (par exemple, la confluence cellulaire ou le stade de réplication) et de la division cellulaire, car il est intégré dans le génome de l’hôte1. Le développement de lignées cellulaires exprimant de manière stable peut être laborieux et difficile, mais si une expression soutenue des gènes est nécessaire sur une période prolongée, la dérivation de lignées cellulaires stables est une option privilégiée. L’objectif le plus courant de la transfection est d’étudier les fonctions d’un gène spécifique ou d’un produit génique par surproduction ou régulation négative de son expression. Cependant, la production de protéines recombinantes et les thérapies géniques nécessitent également l’introduction de matériel génétique étranger dans la cellule2.
Un clone est défini comme une population cellulaire dérivée d’une cellule individuelle. L’isolement de clones de cellules uniques est un aspect crucial de la biologie cellulaire lors de l’étude de cellules présentant une variabilité génotypique et phénotypique. Trois techniques principales sont utilisées pour obtenir des clones cellulaires : la technique de dilution, la technique de clonage de l’anneau3 et la technique de tri cellulaire4. Chacun a des avantages et des inconvénients. Nous fournissons une description détaillée d’une méthode permettant d’isoler des clones de cellules de mélanome à l’aide de la technique du cylindre de verre. L’avantage de cette méthode est que les cellules présentent une croissance clonale modérée à partir de cultures cellulaires de faible densité. De plus, les cellules sélectionnées ont déjà démontré leur capacité de prolifération puisqu’elles ont déjà formé des colonies5. Cette procédure consiste à ensemencer les cellules transfectées de manière clairsemée, mais sans dilution limite, dans un grand vaisseau et à leur permettre de se développer et de former des colonies pendant 2 à 3 semaines en présence d’un antibiotique sélectif. Les colonies individuelles peuvent ensuite être isolées à l’aide de cylindres de verre qui sont placés sur les colonies et collés au récipient à l’aide de graisse de silicone. Ensuite, les cellules sont détachées avec de la trypsine, puis transférées sur des plaques multipuits pour une culture ultérieure en présence d’un milieu sélectif.
Il existe un certain nombre d’études décrivant l’isolement des clones, mais nous nous concentrons sur la présentation de détails tels que la taille des clones après 2 semaines de sélection, comment marquer l’emplacement des clones pendant leur isolement et comment choisir une concentration appropriée d’antibiotique pour la sélection. Nous nous concentrons sur des conseils pratiques qui peuvent être décisifs pour le succès de l’ensemble de la procédure. Le protocole présenté nous permet d’obtenir des clones cellulaires stables en 2 à 4 semaines. La méthode est facile et peu coûteuse et ne nécessite pas d’équipement compliqué. Nous partageons une technique qui nous a permis d’obtenir de nombreux modèles de recherche, y compris les clones GSN KO 6,7,8.
1. Sous-culture cellulaire et ensemencement pour l’optimisation de la concentration de médicaments
2. Optimisation de la concentration du médicament sélectionné
3. Ensemencement et transfection des cellules
4. Génération de clones cellulaires
5. Choisir les clones pour l’isolement
6. Préparation des cylindres de verre
7. Isolement des clones
8. Validation des clones cellulaires générés
Réactifs | Volume |
Mélange maître d’ADN polymérase | 7,5 μl |
Amorce avant (10 μM) | 1,5 μl |
Amorce inversée (10 μM) | 1,5 μl |
Eau stérile | 3,5 μl |
ADNg | 1 μl contenant 10 ng d’ADNg |
Tableau 1. Composition du mélange réactionnel PCR.
Escalier | Température [°C] | Temps [minutes : secondes] |
1 | 95 | 04:00 |
2 | 95 | 00:30 |
3 | 57 | 00:30 |
4 | 72 | 00:45 |
5 | Aller à 2, 35x | X |
6 | 72 | 10:00 |
7 | 8 | ∞ |
Tableau 2. Paramètres du thermocycleur pour la réaction PCR.
Réactifs | Volume |
5 x tampon d’ADN polymérase haute fidélité | 4 μl |
dNTP (10 mM) | 0,4 μl |
Amorce avant (10 μM) | 1 μl |
Amorce inversée (10 μM) | 1 μl |
Eau stérile | 12,4 μl |
ADNg | 1 μl contenant 10 ng d’ADNg |
ADN polymérase haute fidélité | 0,2 μl |
Tableau 3. Composition du mélange réactionnel PCR.
Escalier | Température [°C] | Temps [minutes : secondes] |
1 | 98 | 00:30 |
2 | 98 | 00:30 |
3 | 61 | 00:30 |
4 | 72 | 01:00 |
5 | Passez à l’étape 2, 35 fois | X |
6 | 72 | 10:00 |
7 | 8 | ∞ |
Tableau 4. Paramètres du thermocycleur pour la réaction PCR.
Réactifs | Quantité |
10 x tampon | 3 μl |
Enzyme de restriction | 1 μl |
Eau stérile | 20,7 μl |
Plasmide | 5,3 μl contenant 5 μg d’ADN |
Tableau 5. Composition du mélange de réaction de digestion de restriction.
9. Évaluer l’hétérogénéité phénotypique de la lignée cellulaire
À l’aide du protocole présenté, nous fournissons une démonstration détaillée de l’isolement de clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable avec la méthode du cylindre de verre (Figure 1A). Nos études portent sur la biologie cellulaire du mélanome, et le modèle de recherche le plus courant que nous utilisons est la lignée de mélanome A375, adhérente et hautement invasive. Comme nos recherches ont montré que les cellules d...
Nous avons fourni une description détaillée de l’isolement de clones de cellules de mélanome transfectés de manière stable avec des cylindres de verre. Il est important d’obtenir des clones de contrôle lors de la dérivation de clones avec une expression modifiée des gènes, car les résultats obtenus pour les clones de modification ciblés doivent toujours être comparés aux résultats obtenus pour les témoins. De cette façon, nous pouvons vérifier si la transfection elle...
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Ce travail a été soutenu par le Centre national pour la science, Pologne (projet #2016/22/E/NZ3/00654, accordé à AJM).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 ml centrifuge tube | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
150 mm cell culturedish with 20 mm grid | Falcon | 353025 | |
24-wells plate | VWR International | 10062-896 | |
35 mm culture dish | Eppendorf | EP0030700112 | |
6-well plate | Eppendorf | EP0030700113 | |
96-well plate | VWR International | 10062-900 | |
Acetic acid, 80% solution | Chempur | 115687330 | |
Agarose | Prona-Abo | BLE500 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
anti-GAPDH antibodies | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
anti-GSN antibodies - clone C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
anti-GSN antibodies - clone GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
Control Double Nickase Plasmid | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
Coverslips | bionovo | 16283 | |
Dako Mounting medium | Clontech | S3023 | |
DMSO - Dimethyl sulfoxide | applichem | A3672,0250 | |
DNA Purification Kit | EurX | 3555-02 | |
donkey anti- mouse-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
DTT - 1,4-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E0396 | |
FBS - Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
Gelsolin CRISPR Plasmids | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium with reduced concentration (1.5 g/l) of NaHCO3 | Polish Academy of Science,Wroc![]() | 11-500 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Lignin | Bionovo | B-0521 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000-008 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
NEBuilder Assembly Tool | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
pACGFP-C1 | Clontech | ||
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Perfect 100 bp DNA ladder | EurX | E3134 | |
phalloidin-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
puromycin | InviviGen | ant-pr | |
SDS - sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L4509 | |
silicone | CX80 Polska | ||
Sodium chloride - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
sucrose | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
the glass cylinders | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
Tissue Culture Flask 25mL | VWR International | 10062-868 | |
Tissue-culture 75 cm2 flask | VWR | 10062-872 | |
Trisma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
trypsin | Polish Academy of Science,Wroc![]() | 20-500 | |
urea | Sigma-Aldrich | 8656 | |
xylene solution | Chempur | 115208603 |
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