בידוד של שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה

מתואר פרוטוקול לבידוד שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה באמצעות גלילי זכוכית. אנו מתמקדים בעצות מעשיות שעשויות להיות מכריעות להצלחת ההליך כולו.

אוכלוסיות תאים שיש להן שינויים יציבים במידע הגנומי שלהן נמצאות בשימוש נרחב על ידי מדענים כמודל מחקר. הם אינם דורשים טרנספקציה חוזרת של תאים מכיוון שהיא עלולה להוביל לאוכלוסיית תאים הטרוגנית וליעילות טרנספקציה משתנה, מה שמשפיע על יכולת השחזור. יתר על כן, הם עדיפים לניתוחים בקנה מידה גדול. יצירת שיבוטי תאים יציבים שימושית למגוון רחב של יישומים, כגון מחקר על תפקודי גנים וייצור חלבון רקומביננטי. ישנן מספר שיטות להשגת אוכלוסיית תאים הומוגנית עם טרנספקציה חולפת ראשונית. כאן, אנו מתארים את הבידוד של שיבוטים של תא בודד עם גלילי זכוכית. למרות ששיטה זו ידועה מזה זמן מה, ישנם כמה שלבים מכריעים, והזנחתם עלולה להוביל לכישלון. השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי להשיג שיבוטים המבטאים יתר על המידה חלבון מעניין (POI) או עם נוקאאוט של גן מעניין (GOI). אנו מתארים שלבי הכנה כגון אופטימיזציה של בחירת ריכוזי תרופות, הכנת גלילי זכוכית ואימות האם לשיבוטים המתקבלים יש את השינוי הרצוי בביטוי ה-GOI על ידי PCR, ניתוח כתמים מערביים, צביעה חיסונית או ריצוף gDNA (תלוי בסוג השיבוטים הנגזרים). אנו דנים גם בהטרוגניות הפנוטיפית של קווי תאים מבוססים היטב מכיוון שזו עשויה להיות בעיה בהשגת שיבוטי תאים יציבים.

טרנספקציה יציבה של תאי יונקים היא שיטה המשמשת באופן שגרתי במספר יישומי תרביות תאים, כולל חקר סרטן. יתרונו על פני טרנספקציה חולפת הוא שלא ניתן לאבד את החומר הגנטי הזר שהוכנס עקב גורמים סביבתיים (למשל, מפגש תאים או שלב שכפול) וחלוקת תאים מכיוון שהוא משולב בגנום של המארח¹. פיתוח קווי תאים המתבטאים ביציבות יכול להיות מייגע ומאתגר, אך אם נדרש ביטוי מתמשך של גנים לאורך תקופה ממושכת, גזירת קווי תאים יציבים היא אפשרות מועדפת. המטרה הנפוצה ביותר של טרנספקציה היא לחקור את הפונקציות של גן או תוצר גן ספציפי על ידי ייצור יתר או הפחתת ויסות הביטוי שלו. עם זאת, ייצור חלבונים רקומביננטיים וטיפולים גנטיים דורש גם החדרת חומר גנטי זר לתא².

שיבוט מוגדר כאוכלוסיית תאים שמקורה בתא בודד אחד. בידוד של שיבוטים של תא בודד הוא היבט מכריע בביולוגיה של התא בעת חקר תאים עם שונות גנוטיפית ופנוטיפית. שלוש טכניקות עיקריות משמשות להפקת שיבוטי תאים: טכניקת הדילול, טכניקת טבעת השיבוט³ וטכניקת מיון התאים⁴. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות. אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה לבידוד שיבוטי תאי מלנומה בטכניקת גליל הזכוכית. היתרון בשיטה זו הוא שהתאים מציגים צמיחה משובטת מתונה מתרביות תאים בצפיפות נמוכה. יתר על כן, התאים שנבחרו כבר הוכיחו יכולת התפשטות מכיוון שהם כבר יצרו מושבות⁵. הליך זה כולל זריעת תאים שעברו טרנספטציה בדלילות, אך לא בדילול מוגבל, לתוך כלי גדול ומאפשר להם להתרחב וליצור מושבות למשך 2-3 שבועות בנוכחות אנטיביוטיקה סלקטיבית. לאחר מכן ניתן לבודד את המושבות הבודדות באמצעות גלילי זכוכית המונחים מעל המושבות ומודבקים לכלי באמצעות שומן סיליקון. לאחר מכן, תאים מנותקים עם טריפסין ואז מועברים לצלחות מרובות בארות לתרבית נוספת בנוכחות מדיום סלקטיבי.

ישנם מספר מחקרים המתארים בידוד של שיבוטים, אך אנו מתמקדים בהצגת פרטים כמו הגודל ששיבוטים צריכים להיות לאחר שבועיים של בחירה, כיצד לסמן את מיקום השיבוטים במהלך הבידוד שלהם, וכיצד לבחור ריכוז מתאים של אנטיביוטיקה לבחירה. אנו מתמקדים בעצות מעשיות שעשויות להיות מכריעות להצלחת ההליך כולו. הפרוטוקול המוצג מאפשר לנו להשיג שיבוטי תאים יציבים תוך 2-4 שבועות. השיטה קלה וזולה ואינה דורשת ציוד מסובך. אנו חולקים טכניקה שאפשרה לנו להשיג מודלים מחקריים רבים, כולל שיבוטי GSN KO ^6,7,8.

1. תת-תרבית תאים וזריעה לאופטימיזציה של ריכוז תרופות

1. יש לחמם את מדיום תרבית התאים (במקרה זה, מדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם ריכוז מופחת (1.5 גרם/ליטר) של NaHCO₃, 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 1% (v/v) L-גלוטמין ו-1% (v/v) אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית) ותמיסת טריפסין באמבט מים ל-37 מעלות צלזיוס.
2. שאפו והשליכו את מדיום תרבית התאים מתאי A735 הגדלים בבקבוק תרבית תאים T25. קו התאים מתקבל ממקורות מסחריים.
3. שטפו את כל מדיום תרבית התאים שנותר מהתאים על ידי שטיפת הבקבוק עם 1 מ"ל של תמיסת טריפסין או PBS.
4. שאפו והשליכו את תמיסת הטריפסין או PBS מהתאים.
5. הוסף 1 מ"ל תמיסת טריפסין לבקבוק ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. התבונן בזהירות בניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
6. עצור את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם טרי ושטוף איתו את בקבוק תרבית התאים כאשר התאים מתנתקים.
7. העבירו את מתלה התאים מהבקבוק לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
8. צנטריפוגה של התאים ב-800 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
9. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
10. השעיה מחדש של תאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית התאים הטרי.
11. כדי לחשב את צפיפות התאים, ספור את התאים בעזרת מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
12. זרע את מספר התאים המתאים בצלחת תרבית בגודל המתאים.
    הערה: בניסוי זה, 450,000 תאים מקו התאים A375 נזרעו ב-2 מ"ל של מדיום תרבית התאים בצלחת תרבית של 35 מ"מ.

2. אופטימיזציה של ריכוז תרופות נבחרות

1. מצא את טווח הריכוזים המומלץ של היצרן של התרופה שתשמש לבחירת שיבוטי תאים יציבים.
   הערה: גן ברירה המוחדר לתא על ידי טרנספקציה עם וקטור גנטי מספק לתא עמידות לתרופת הברירה. פורומיצין בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל שימש כסמן בחירה להשגת ביטוי יציב של הווקטור הגנטי ולסילוק תאים לא מועברים.
2. זרע את התאים בבארות של צלחת של 96 בארות כדי להגיע למפגש של 50% למחרת. הכן שלוש בארות לכל ריכוז תרופה ובקרה לא מטופלת. זרע 10,000 תאים לבאר. מספר התא תלוי בקו התא בו נעשה שימוש ויש לקבוע אותו באופן אמפירי.
3. לאחר 24 שעות, הכינו 10 דילולים של התרופה במדיום השלם מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר המומלץ על ידי היצרן והוסיפו אותם לתאים.
   הערה: במקרה זה נעשה שימוש בפורומיצין. טווח הריכוז היה 0-10 מיקרוגרם/מ"ל. כל 3 ימים, או כאשר נצפים תאים מתים רבים במדיום, משתנים למדיום טרי.
4. התבוננו בתאים מדי יום במשך שבוע ורשמו הערות לגבי המפגש שלהם, התפשטותם ומותם ביחס ללוחית הבקרה.
   הערה: ריכוז מתאים הוא כזה שבו התאים מפסיקים להתרבות ואינו גורם למוות תאים באופן מיידי אלא הורג את כל התאים המטופלים לאחר 48-120 שעות. עם זאת, עבור שילובים מסוימים של קווי תאים ותרופות, ייתכן שלא יהיה שלב שבו תאים מפסיקים להתרבות אלא מתים. במצב כזה, הריכוז הנמוך ביותר של תרופה שהורגת את כל התאים יתאים לבחירה.

3. זריעה וטרנספקציה של תאים

1. זרעו את התאים בבאר של צלחת שש בארות.
   הערה: הנפח הסופי של תרחיף התאים במדיום תרבית התאים צריך להיות 2.5 מ"ל. לצורך ניסוי זה נזרעו 450,000 תאים לבאר. יש לקבוע את מספר התאים באופן אמפירי כך שהמפגש שלהם לא יעלה על 90% לאחר 48 שעות זריעה.
2. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   הערה: התאים טופחו במשך 24 שעות לפני הטרנספקציה. עם זאת, 48 שעות לאחר הזריעה, נצפה כי התאים הועברו בצורה יעילה יותר.
3. שאפו והשליכו את מדיום תרבית התאים מעל התאים.
4. החלף את המדיום המושלך במדיום תרבית תאים נטול אנטיביוטיקה שחומם מראש (10% (v/v) FBS, DMEM בתוספת גלוטמין).
   הערה: הצורך בשינוי מדיום תרבית התאים נובע מחדירות התאים המוגברת הנגרמת על ידי כמה ריאגנטים טרנספקציה, מה שעלול לגרום לזרם מוגבר של אנטיביוטיקה לתאים, וכתוצאה מכך למוות של תאים.
5. דילול ריאגנטים לטרנספקציה ב-DEM ללא אנטיביוטיקה וסרום. השתמש בפוליאתילן (PEI), מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים, או אלקטרופורציה. עבור טרנספקציה של תאים, השתמש בתמיסת פוליאתילן של 2 מ"ג/מ"ל ביחס משקל של 1:2.175 עבור 4 מיקרוגרם של DNA.
   הערה: כתמיסת DNA, נעשה שימוש בתערובת של שני פלסמידים במערכת CRISPR/Cas9(D10A) עם רצפי ה-gRNA הבאים: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' ו-5'atccagctgcacggtaaaga3'.
6. דגרו את תערובת הטרנספקציה למשך 30 דקות ב- RT.
7. לאחר הדגירה, הוסיפו בזהירות את תערובת הטרנספקציה בטיפה לתאים הגדלים בבארות של צלחת בת שש בארות.
8. תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% CO₂ למשך 2-6 שעות.
9. שנה את המדיום למדיום תרבית התאים השלם.
10. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5%_CO2 במשך 24 השעות הבאות.

4. יצירת שיבוטי תאים

1. טריפסין והעביר את התאים המועברים לתבנית תרבית בקוטר 150 מ"מ עם רשת יצוקה של 20 מ"מ בהתאם להוראות בסעיף 1 לפרוטוקול.
   הערה: בשל מיזוג התאים זה עם זה במקרה של צפיפות גבוהה, מומלץ להעביר את התאים באופן שווה לשני כלי תרבית תאים. הרשת בצלחת התרבות עוזרת לאתר שיבוטים ולעקוב אחר נדידתם. בתוכנית צלחת מודפסת, אפשר לסמן מאוחר יותר את מיקום השיבוטים (איור 1B). בנוסף, עבור תאים שאינם סובלים הסרת המדיום וחשיפה לאוויר (וכתוצאה מכך מוות/נזק בלתי הפיך), עדיף להשתמש ביותר כלים עם שטח פנים קטן יותר כדי לבודד פחות מושבות מצלחת אחת. זה יכול להפחית את זמן החשיפה לאוויר במהלך בידוד שיבוטים ולהפחית את הסבירות להתייבשות תאים.
2. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% CO₂ למשך 24 שעות.
3. שנה את מדיום תרבית התאים למדיום המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית.
   הערה: מנקודה זו ואילך, חשוב לתרבית את התאים בנוכחות אנטיביוטיקה סלקטיבית; אחרת, יש סיכוי לחתוך את הטרנסגן המשולב מהגן.
4. החלף את המדיום כל 3 ימים או כאשר יש הרבה תאים מתים צפים בתווך.
   הערה: בניסוי זה, התאים הודגרו עם פורומיצין בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל. שלב בחירת שיבוט התאים אורך כשבועיים. יש לעקוב אחר היווצרותם של שיבוטים על ידי התבוננות בצמיחתם במיקרוסקופ הפוך, מכיוון שהם לא צריכים לגדול ולבוא במגע עם שיבוטי תאים שכנים. לא ניתן למנוע מתאים ממושבה אחת לנדוד ולגדול עם מושבה אחרת. לכן, חשוב להתבונן בצלחת לנדידת תאים מהשיבוטים ולציין את המידע עליה בתוכנית המנה.

5. בחירת השיבוטים לבידוד

1. בדוק את צלחת תרבית התאים עבור שיבוטי תאים תחת מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של פי 10 או פי 20.
   הערה: השיבוטים מורכבים מכ-500-30,000 תאים. עם זאת, זה תלוי בקו התאים בו משתמשים. מושבה משביעת רצון צריכה להיות מופרדת ממושבות תאים אחרות ולהיות בגודל ממוצע מכיוון ששיבוטים גדולים מאוד ויוצאי דופן יכולים להיווצר מיותר מתא אחד (איור 1B).
2. מצא מושבה מתאימה באמצעות המיקרוסקופ ההפוך על ידי בחינה מדוקדקת של הצלחת והערכת השיבוטים שנמצאו. הנח את הסמן במיקום השיבוט שנבחר עם הסמן על הכלי שמתחת. במקביל, סמנו את מיקום המושבה בתוכנית הכלים המודפסת (איור 1B).
   הערה: יש לבחור כ 20-30 מושבות מהמנה. לפעמים מתקבלים פחות שיבוטי תאים, ויש לבודד את כולם במקרים כאלה.

6. הכנת גלילי זכוכית

1. לפני בידוד השיבוטים, הניחו את גלילי הזכוכית (בקוטר 6.4 מ"מ ובגובה 8 מ"מ) (איור 1C) בצלחת פטרי הזכוכית הראשונה ובצעו חיטוי שלהם.
2. חיטוי צלחת הפטרי הזכוכית השנייה.
3. מרחו שכבה דקה של שומן סיליקון על תחתית צלחת הפטרי השנייה מזכוכית חיטוי. הניחו את המנה מתחת לארון זרימה למינרית ומרחו אור UV למשך 30 דקות כדי לעקר את שומן הסיליקון.
   הערה: לחלופין, ניתן לבצע חיטוי של שומן הסיליקון.
4. טבלו את הצילינדרים האוטומטיים בצלחת פטרי מצופה שומן סיליקון. עכשיו הם מוכנים לבודד את השיבוטים.
5. לאחר בידוד השיבוטים, יש לנקות את הצילינדרים בהתאם לכללים החלים על החומר הסלולרי איתו הם מטופלים. במקרה של שינוי גנטי, השתמש בנתרן היפוכלוריט לעיקור.
6. שטפו את הצילינדרים עם קסילן למשך הלילה כדי לנקות אותם משומן סיליקון.
7. שטפו את הצילינדרים במים נטולי יונים מתחת למכסה המנוע הכימי כדי להסיר את תמיסת הקסילן.
8. הניחו את הצילינדרים על מגבת נייר ותנו להם להתייבש.
9. אחסן את הצילינדרים בצלחת פטרי מזכוכית.
10. הכן את הצילינדרים לפני השימוש הבא, החל מנקודה 1 במדריך זה.

7. בידוד שיבוטים

1. הכינו צלחת של 24 בארות המכילה 0.5 מ"ל מדיום תרבית תאים שלם שחומם מראש בכל באר.
2. שטפו בזהירות את התאים המועברים הגדלים על צלחת 150 מ"מ שלוש פעמים עם 15 מ"ל PBS חם וסטרילי. שאפו בזהירות והשליכו את ה-PBS.
3. השתמש בפינצטה סטרילית כדי להעביר צילינדרים שיש בהם שומן בצד אחד. לחץ על הגלילים בתחתית צלחת תרבית באתרים של השיבוטים המסומנים כדי ליצור בארות מבודדות סביב המושבות הגדלות שמקורן בשיבוט חד-תאי.
   הערה: הצילינדר צריך להיצמד היטב לתחתית כדי למנוע דליפת נוזלים.
4. מוסיפים 50 מיקרוליטר תמיסת טריפסין לכל גליל ודוגרים מספר דקות. היזהר לא לפגוע בתאים באופן אנזימטי. עבד את המושבות אחת אחת. זכור להחליף את קצה הפיפטה לכל גליל כדי לא לזהם את המושבות באחרות.
   הערה: זמן הדגירה תלוי בקו התאים בו נעשה שימוש ויש לקבוע אותו באופן אמפירי. ניתן לזרום את תמיסת הטריפסין למעלה ולמטה כדי להקל על ניתוק התאים. עקוב אחר ניתוק התאים בזהירות באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לאחר ניתוק התאים, עצור את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לכל גליל.
5. העבירו מיד 100 מיקרוליטר של מתלה התא למדיום בבאר אחת של צלחת 24 בארות.
   הערה: כאן, גידול השיבוטים נמשך עם אנטיביוטיקה סלקטיבית בריכוז של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל.
6. עקוב אחר צמיחת שיבוטי התאים בצלחת של 24 בארות, וכאשר הם מגיעים למפגש של 90%, העבירו אותם לצלחת של שש בארות. עקוב אחר ההוראות בסעיף 1 של הפרוטוקול; שנה רק את נפחי הטריפסין (0.5 מ"ל) ומדיום העצירה (1.5 מ"ל).
7. עקוב אחר שיבוטי התאים הגדלים בצלחת של שש בארות, וכאשר הם מגיעים למפגש, העבירו אותם לבקבוק תרבית התאים T12.5.
8. התבונן בשיבוטי תאים בבקבוק תרבית התאים T12.5, וכאשר הם מגיעים למפגש, תת-תרבית וספור אותם בשיטה מתאימה, כגון שימוש במונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. הקפיאו מחצית מהתאים במדיום המכיל 70% מדיום שלם עם אנטיביוטיקה סלקטיבית, 20% (v/v) FBS ו-10% (v/v) DMSO. זרעו את שאר התאים על כיסויים (12 מ"מ על 12 מ"מ) לצביעה חיסונית ולתוך שתי בארות של צלחת בת שש בארות לבידוד gDNA והכנת ליזאט.
   הערה: במקרה של קו התאים A375, זרע 45,000 תאים לכל כיסוי ו-450,000 תאים לכל באר של צלחת של שש בארות.

8. אימות של שיבוטי התאים שנוצרו

1. צביעה חיסונית
   הערה: בצע צביעה חיסונית על התאים כדי לקבוע את רמת הביטוי של החלבון המעניין (POI). חשוב לצבוע תאים מסוג פרא או לשלוט בשיבוטים בו-זמנית כבקרה כדי להיות מסוגלים להשוות את רמות הביטוי של ה-POI (איור 2A).
   1. שאפו והשליכו את מדיום תרבית התאים.
   2. שטפו את התאים הגדלים על הכיסויים שלוש פעמים בעזרת PBS.
   3. תקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד 4% לכל באר ודגירתם למשך 20 דקות ב-RT.
      הערה: נוגדנים שונים יכולים לדרוש שיטות קיבוע שונות.
   4. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS.
   5. כדי לחלחל את התאים, דגרו את החלקות הכיסוי ב-0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 דקות ב-RT.
      הערה: נוגדנים שונים יכולים לדרוש שיטות חדירה שונות.
   6. שטפו את הכיסויים פעמיים עם PBS.
   7. הנח את הכיסויים בתא מכתים⁹.
   8. דגרו את הכיסויים ב-1% (w/v) BSA ב-0.1% (v/v) Triton X-100 בתמיסת PBS למשך 30 דקות ב-RT כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים.
   9. הסר את התמיסה על ידי הנחת הכיסוי עם הקצה על חתיכת ליגנין בעזרת מחט ופינצטה.
   10. הכן תמיסת צביעה המורכבת מנוגדנים ראשוניים ב-1% (w/v) BSA ו-0.1% (v/v) Triton X-100 ב-PBS. זרוק 30 מיקרוליטר של תמיסה על כל כיסוי ודגר אותם למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס בתא לחות לח.
       הערה: נוגדן נגד GSN של עכבר בדילול של 1:200 שימש בניסוי זה.
   11. הסר את התמיסה על ידי הנחת הכיסויים עם הקצה על חתיכת ליגנין בעזרת מחט ופינצטה. הניחו את הכיסויים בצלחת של 24 בארות.
   12. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות ב-RT.
   13. הכן נוגדנים וצבעים משניים ב-1% (w/v) BSA ו-0.1% (v/v) Triton X-100 בתמיסת PBS. זרוק 30 מיקרוליטר של תמיסה על כל כיסוי ודגר אותם למשך שעה ב-RT בחושך.
       הערה: השתמש בנוגדנים משניים נגד עכברים-פלואורסצנטיים 488 בדילול של 1:200. כדי לזהות F-אקטין וגרעיני תאים, השתמשנו ב-phalloidin-Alexa Fluor 568 בדילול של 1:200 וב-Hoechst 33342 בדילול של 1:1000.
   14. הסר את התמיסה על ידי הנחת הכיסויים עם הקצה על חתיכת ליגנין בעזרת מחט ופינצטה. הניחו את הכיסויים בצלחת של 24 בארות.
   15. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות ב-RT בחושך.
   16. שטפו את הכיסויים פעם אחת במים נטולי יונים.
   17. הרכיבו את הכיסויים באמצעות אמצעי הרכבה על זכוכית מיקרוסקופ.
   18. דמיין את צביעת התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לקבוע את רמת ה-POI המתבטאת בשיבוטים נגזרים (איור 2A).
2. ניתוח כתם מערבי
   הערה: כדי לאשר את החסר, הרמה המוגברת או הרמה הנמוכה יותר של ביטוי POI בשיבוטים נגזרים, בצע את ניתוח הכתם המערבי בתנאים סטנדרטיים¹⁰. נתחו את התאים מסוג הבר או שיבוטי הבקרה בו-זמנית (איורים 2B,C).
   1. שטפו את התאים הגדלים בבאר של צלחת בת שש בארות שלוש פעמים עם PBS.
   2. קצרו את התאים בעזרת מגרד למאגר לבחירתכם ומערבלו בעדינות במשך 20 שניות. בצע שלושה מחזורי הקפאה (ב-80 מעלות צלזיוס) והפשרה (ב-4 מעלות צלזיוס) של הדגימה.
      הערה: השתמש במאגר מיצוי חלבון הקשור לשלד הציטו [10 מ"מ Tris-HCl pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 1 מ"מ אתילן גליקול-ביס(2-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA), 1 מ"מ NaF, 20 מ"מ Na₄P₂O₇, 2 מ"מ Na₃VO₄, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) גליצרול, 0.1% (w/v) SDS, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט], או חוצץ אוריאה [50 מ"מ TRIS-HCl pH 7, 5% (w/v) SDS, 8.6% (w/v) סוכרוז, 74 מ"מ אוריאה, 1 מ"מ DTT], שניהם בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1:100, מעכב סרין פוספטאז 1:100 ומעכב טירוזין פוספטאז 1:100.
   3. צנטריפוגה את הליזטים ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. קבע את ריכוז החלבון בדגימות (למשל, על ידי בדיקת BCA).
      הערה: הבדיקה תלויה בתאימות להרכב המאגר.
   5. כדי לבצע ניתוח כתמים מערביים של הדגימות, טען 30 מיקרוגרם חלבון לכל באר על ג'ל פוליאקרילאמיד (7%-15%).
   6. בצע אלקטרופורזה SDS-PAGE והעביר את החלבונים לקרום ניטרוצלולוזה.
   7. דמיינו את רמת ביטוי ה-POI על ידי צביעת הממברנה בנוגדנים מתאימים (איורים 2B,C).
      הערה: נעשה שימוש בנוגדנים נגד GSN של עכבר בדילול של 1:2000 ונוגדנים נגד GAPDH של עכבר בדילול של 1:200. עיין במאמרים שלנו לפרטים ^2,11. זמן החשיפה צריך להיות ארוך מספיק כדי שלא ניתן יהיה להתעלם מאותות חלשים (איור 2C).
3. ניתוח gDNA
   הערה: לאחר הערכת רמת ביטוי ה-POI בשיבוטים נגזרים על ידי טכניקות מיקרוסקופיות ומערביות, יש לנתח DNA גנומי. השוואה של אורך תוצר תגובת ה-PCR שהתקבלה בתבנית ה-gDNA של השיבוטים שהתקבלו מספקת מידע אם רצף ה-GOI נערך (איור 2D).
   1. שטפו את התאים הגדלים בבאר של צלחת בת שש בארות שלוש פעמים עם PBS.
   2. קצרו את התאים באמצעות מגרד ב -1 מ"ל של PBS.
   3. צנטריפוגה את התאים ב-5000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. שאפו והשליכו את הסופרנטנטים.
      הערה: ניתן לאחסן כדורים במשך מספר חודשים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   5. בודד gDNA מכדורים של שיבוטים נגזרים באמצעות ערכת מיצוי gDNA זמינה מסחרית.
   6. תכנן פריימרים PCR על ידי חישול לפחות 300 bp במעלה הזרם ובמורד הזרם של יעד ה-gRNA באתר עריכת הגנים CRISPR/Cas9.
      הערה: נעשה שימוש בפריימרים הבאים: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgctc3'.
   7. בצע תגובות PCR באמצעות DNA Polymerase Master Mix בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: הרכב תערובת תגובת ה-PCR מוצג בטבלה 1, והגדרות התרמו-ציקלר לתגובת ה-PCR מוצגות בטבלה 2.
   8. נתח מוצרי PCR בג'ל אגרוז של 1% או 2% (w/v) במאגר Tris-acetate-EDTA (40 מ"מ Tris pH 8.0, 20 מ"מ חומצה אצטית, 1 מ"מ EDTA).
   9. השווה את אורך האמפליקון של מוצר ה-PCR של שיבוטי GSN KO לאורך מוצר ה-PCR של שיבוטי CTRL KO (203 bp; איור 2D).
4. ריצוף gDNA
   1. תכנן פריימרים PCR על ידי חישול לרצפים במעלה הזרם ובמורד הזרם מהרצפים המזוהים על ידי ה-gRNAs המקודדים על ידי פלסמידים CRISPR/Cas9(D10A).
      הערה: עצב פריימרים באופן הבא: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaaggetgcagacctttg3', Rev: 5'cgcgtaccgtcggcgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
   2. בצע PCR באמצעות DNA פולימראז בנאמנות גבוהה (ניתוח כזה דורש דיוק גבוה במהלך הגברת DNA) ו-gDNA כתבנית.
      הערה: הרכב תערובת תגובת ה-PCR מוצג בטבלה 3, והגדרות תרמו-ציקלר לתגובת ה-PCR מוצגות בטבלה 4.
   3. ליניאריזציה של הפלסמיד עם אנזים הגבלה באתרי שיבוט מרובים על ידי דגירה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: הרכב תערובת תגובת עיכול ההגבלה מוצג בטבלה 5. לא משנה באיזה פלסמיד משתמשים. pACGFP-C1 עבר ליניאריזציה עם האנזים EcoRI.
   4. העריכו את ריכוז התוספות וחתכו פלסמיד על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
   5. הכן תגובות הרכבת DNA.
      הערה: ניתן להשתמש בשיטת שיבוט מסורתית או בכל שיטה אחרת.
   6. התמרת חיידקים מוכשרים (למשל, על ידי הליך הלם חום)¹².
   7. לבודד פלסמידים (למשל, משש מושבות חיידקים לכל מבנה בהתאם להוראות היצרן או לפרוטוקול המצוטט)¹³.
   8. בדוק אם התוספת שובטה בהצלחה לתוך הפלסמיד וכי אורכה מתאים על ידי הגבלה, עיכול ואלקטרופורזה של DNA.
      הערה: אם המושבות שנבחרו אינן מכילות פלסמיד עם תוספת, יש לבודד את הפלסמידים ממושבות החיידקים הבאות.
   9. אשר עריכת גנים על ידי ריצוף פלסמיד (איור 3).
      הערה: יש להשיג לפחות שתי תוצאות שונות של ריצוף DNA עבור כל שיבוט תא נגזר בגלל קיומם של שני אללים של גנים. עבור קווי תאים מולטיפלואידים (גדולים מ-2 n), יש צורך לרצף יותר פלסמידים כדי לקבל את הרצף של כל עותקי הגנים בתא המתקבלים. בודד כמה מושבות שצריך עד לבידוד פלסמידים עם הרצפים המשובטים של כל עותקי הגן. אפשר להשתמש בערכה זמינה מסחרית כדי להעריך את מספר הלוקוסים של הגן הנחקר.
   10. השווה את רצפי ה-gDNA שהתקבלו עבור שיבוטי GSN KO ו-CTRL KO באמצעות תוכנית יישור רצפים מרובים (איור 3).

טבלה 1. הרכב תערובת תגובת ה-PCR.

טבלה 2. הגדרות תרמו-ציקלר לתגובת ה-PCR.

טבלה 3. הרכב תערובת תגובת ה-PCR.

טבלה 4. הגדרות תרמו-ציקלר לתגובת ה-PCR.

טבלה 5. הרכב תערובת תגובת העיכול של ההגבלה.

9. להעריך את ההטרוגניות הפנוטיפית של קו התא

1. בצע צביעה חיסונית של התאים כדי לקבוע את רמת ביטוי ה-POI.
2. צלם תמונות ללא הגדלה באמצעות עדשת טבילה בשמן פי 60 במיקרוסקופ קונפוקלי.
3. כדי לקבוע את יחס ההתפלגות של תאים עם רמות שונות, השתמש בכלי "חשיפת יתר/תת-חשיפת" הזמין בדרך כלל ברוב תוכניות ניתוח התמונות המיקרוסקופיות. טפל בתאים המראים אזורים שאינם חשופים כמייצרים את ה-POI ברמה נמוכה. סווג תאים עם חשיפת יתר כתאים עם רמה גבוהה של ביטוי POI ואת התאים הנותרים כמבטאים POI ברמה בינונית.

באמצעות הפרוטוקול המוצג, אנו מספקים הדגמה מפורטת של הבידוד של שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה בשיטת גליל הזכוכית (איור 1A). המחקרים שלנו מתייחסים לביולוגיה של תאי מלנומה, ומודל המחקר הנפוץ ביותר בו אנו משתמשים הוא קו המלנומה A375 הדבק והפולשני ביותר...

סיפקנו תיאור מפורט של הבידוד של שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה עם גלילי זכוכית. חשוב להשיג שיבוטי בקרה בעת הפקת שיבוטים עם ביטוי שונה של גנים מכיוון שתמיד יש להשוות את התוצאות המתקבלות עבור שיבוטי השינוי הממוקד לתוצאות המתקבלות עבור בקרות. באופן זה אנו יכולים ל...

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (פרויקט #2016/22/E/NZ3/00654, הוענק ל-AJM).