稳定转染黑色素瘤细胞克隆的分离

描述了一种使用玻璃圆筒分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的方案。我们专注于可能对整个手术的成功起决定性作用的实用建议。

基因组信息具有稳定变化的细胞群被科学家广泛用作研究模型。它们不需要重复细胞转染，因为这会导致细胞群异质和转染效率可变，从而影响可重复性。此外，它们更适合进行大规模分析。稳定细胞克隆的生成可用于广泛的应用，例如基因功能和重组蛋白生产的研究。有几种方法可以在初始瞬时转染时获得均匀的细胞群。在这里，我们描述了用玻璃圆柱体分离单细胞克隆。虽然这种方法已经为人所知了一段时间，但有一些关键步骤，忽视它们可能会导致失败。我们已经成功地使用这种方法获得了稳定过表达目标蛋白 （POI） 或敲除目标基因 （GOI） 的克隆。我们描述了制备步骤，例如优化选择药物浓度、制备玻璃圆柱体以及通过 PCR、western blot 分析、免疫染色或 gDNA 测序（取决于衍生克隆的类型）验证获得的克隆是否具有所需的 GOI 表达变化。我们还讨论了成熟细胞系的表型异质性，因为这可能是获得稳定细胞克隆的一个问题。

哺乳动物细胞的稳定转染是多种细胞培养应用（包括癌症研究）中的常规方法。与瞬时转染相比，它的优势在于，引入的外源遗传物质不会因环境因素（例如，细胞汇合或复制阶段）和细胞分裂而丢失，因为它已整合到宿主的基因组^{中 1}。稳定表达细胞系的开发可能既费力又具有挑战性，但如果需要长时间持续表达基因，则衍生稳定细胞系是首选。转染的最常见目的是通过过量生产或下调其表达来研究特定基因或基因产物的功能。然而，重组蛋白的生产和基因疗法也需要将外源遗传物质引入细胞^{中 2}。

克隆定义为源自一个单个细胞的细胞群。在研究具有基因型和表型变异性的细胞时，单细胞克隆的分离是细胞生物学的一个重要方面。提取细胞克隆使用三种主要技术：稀释技术、克隆环技术³ 和细胞分选技术⁴。每个都有优点和缺点。我们详细描述了一种使用玻璃圆柱技术分离黑色素瘤细胞克隆的方法。这种方法的优点是细胞在低密度细胞培养物中表现出适度的克隆生长。此外，所选细胞已经显示出增殖能力，因为它们已经形成集落⁵。该程序包括将转染细胞稀疏接种，但不以限制稀释的方式接种到一个大容器中，并在选择性抗生素存在下让它们扩增并形成集落 2-3 周。然后可以使用放置在菌落上方并使用硅脂粘附在容器上的玻璃圆柱体分离单个菌落。接下来，用胰蛋白酶分离细胞，然后转移到多孔板中，以便在选择性培养基存在下进一步培养。

有许多研究描述了克隆的分离，但我们侧重于展示细节，例如选择2周后克隆的大小，如何在分离过程中标记克隆的位置，以及如何为选择选择合适的抗生素浓度。我们专注于可能对整个手术的成功起决定性作用的实用建议。所提出的方案使我们能够在 2-4 周内获得稳定的细胞克隆。该方法简单且便宜，不需要复杂的设备。我们共享一种技术，该技术使我们能够获得许多研究模型，包括 GSN KO 克隆 ^6,7,8。

1. 用于药物浓度优化的细胞传代培养和接种

1. 将细胞培养基（在这种情况下，Dulbecco 改良的 Eagle 培养基，含降低浓度 （1.5 g/L） 的 NaHCO₃、10% （v/v） 胎牛血清 （FBS）、1% （v/v） L-谷氨酰胺和 1% （v/v） 抗生素 - 抗真菌剂）和胰蛋白酶溶液在水浴中加热至 37 °C。
2. 从 T25 细胞培养瓶中生长的 A735 细胞中吸出并丢弃细胞培养基。该细胞系可从商业来源获得。
3. 用 1 mL 胰蛋白酶或 PBS 溶液洗涤培养瓶，洗去细胞中剩余的细胞培养基。
4. 从细胞中吸出并丢弃胰蛋白酶或 PBS 溶液。
5. 向培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶溶液，并在 37 °C 下孵育。 使用倒置显微镜仔细观察细胞的脱离。
6. 加入 3 mL 新鲜的完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，并在细胞分离时用胰蛋白酶冲洗细胞培养瓶。
7. 将细胞悬液从培养瓶中转移到 15 mL 离心管中。
8. 在室温 （RT） 下以 800 x g 离心细胞 5 分钟。
9. 吸出并丢弃上清液。
10. 在 1 mL 新鲜细胞培养基中重悬细胞。
11. 要计算细胞密度，请使用自动细胞计数仪或血细胞计数器对细胞进行计数。
12. 在适当大小的培养皿中接种适当数量的细胞。
    注：在本实验中，将 450,000 个 A375 细胞系细胞接种在 35 mm 培养皿中的 2 mL 细胞培养基中。

2. 优化选定的药物浓度

1. 查找制造商推荐的药物浓度范围，用于选择稳定的细胞克隆。
   注：通过转染遗传载体引入细胞的选择基因使细胞对选择药物产生抗性。使用浓度为 1 μg/mL 的嘌呤霉素作为选择标记，以获得遗传载体的稳定表达并去除未转染的细胞。
2. 将细胞接种在 96 孔板的孔中，以在第二天达到 50% 汇合。为每种药物浓度和未处理的对照准备三个孔。每孔接种 10,000 个细胞。细胞数量取决于所使用的细胞系，需要根据经验确定。
3. 24 小时后，在完全培养基中制备 10 种稀释的药物，从制造商推荐的最低浓度到最高浓度，并将它们添加到细胞中。
   注意：在这种情况下，使用了嘌呤霉素。浓度范围为 0-10 μg/mL。每 3 天一次，或者当培养基中观察到许多死细胞时，更换为新鲜培养基。
4. 每天观察细胞一周，并记录它们相对于对照板的汇合、增殖和死亡。
   注：适当的浓度是细胞停止增殖并且不会立即导致细胞死亡，而是在 48-120 小时后杀死所有处理过的细胞的浓度。然而，对于某些细胞系和药物的组合，可能不存在细胞停止增殖而死亡的阶段。在这种情况下，杀死所有细胞的最低浓度的药物将是合适的选择。

3. 细胞接种和转染

1. 将细胞接种在 6 孔板的孔中。
   注：细胞培养基中细胞悬液的最终体积应为 2.5 mL。对于该实验，每孔接种 450,000 个细胞。需要根据经验确定细胞数量，以便在接种 48 小时后它们的汇合度不能超过 90%。
2. 在 37 °C 下在含有 5% CO₂ 的潮湿气氛中培养细胞 24 小时。
   注：转染前将细胞培养 24 小时。然而，接种后 48 小时，观察到细胞的转染效率更高。
3. 吸出并丢弃细胞上方的细胞培养基。
4. 用预热的不含抗生素的细胞培养基（10% （v/v） FBS，补充谷氨酰胺的 DMEM）替换丢弃的培养基。
   注：需要更换细胞培养基是由于某些转染试剂导致细胞通透性增加，这会导致抗生素流入细胞的增加，从而导致细胞死亡。
5. 在不含抗生素和血清的 DMEM 中稀释转染试剂。使用聚乙烯亚胺 （PEI）、基于脂质的转染试剂或电穿孔。对于细胞转染，对 4 μg DNA 使用 2 mg/mL 聚乙烯亚胺溶液，重量比为 1：2.175。
   注：作为 DNA 溶液，在 CRISPR/Cas9（D10A） 系统中使用了两种质粒的混合物，具有以下 gRNA 序列：5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' 和 5'atccagctgcacggtaaaga3'。
6. 将转染混合物在 RT 下孵育 30 分钟。
7. 孵育后，小心地将转染混合物逐滴加入到在 6 孔板孔中生长的细胞中。
8. 在 37 °C 下在含有 5% CO₂ 的潮湿气氛中培养细胞 2-6 小时。
9. 将培养基更换为完全细胞培养基。
10. 在 37 °C 下在含有 5% CO_{2 的} 潮湿气氛中培养细胞接下来 24 小时。

4. 细胞克隆的生成

1. 根据方案第 1 节中的说明，将转染的细胞胰蛋白酶消化并转移到直径为 150 mm 的培养皿中，该培养皿具有 20 mm 的模制网格。
   注：由于在高密度情况下细胞会相互融合，因此建议将细胞均匀转移到两个细胞培养皿中。培养皿上的网格有助于定位克隆并跟踪其迁移。在打印的培养皿平面图上，稍后可以标记克隆的位置（图 1B）。此外，对于不能耐受去除培养基和暴露在空气中（导致死亡/不可逆损伤）的细胞，最好使用更多表面积更小的培养皿，以便从一个培养皿中分离出更少的菌落。这可以减少克隆分离过程中暴露在空气中的时间，并降低细胞脱水的可能性。
2. 在 37 °C 下在含有 5% CO₂ 的潮湿气氛中培养细胞 24 小时。
3. 将细胞培养基更换为含有选择性抗生素的培养基。
   注意：从这一点开始，在选择性抗生素存在下培养细胞很重要;否则，就有可能将整合的转基因从基因中切掉。
4. 每 3 天更换一次培养基，或者当培养基中漂浮着许多死细胞时更换培养基。
   注：在本实验中，将细胞与浓度为 1 μg/mL 的嘌呤霉素一起孵育。细胞克隆选择步骤大约需要 2 周。应通过在倒置显微镜下观察克隆的生长来监测克隆的形成，因为它们不应生长并与邻近的细胞克隆接触。无法阻止来自一个集落的细胞与另一个集落一起迁移和生长。因此，观察来自克隆的细胞迁移板并在培养皿计划中记录有关它的信息非常重要。

5. 选择要隔离的克隆

1. 在具有 10 倍或 20 倍物镜的倒置显微镜下检查细胞培养皿中的细胞克隆。
   注意：克隆由大约 500-30,000 个细胞组成。但是，这取决于所使用的细胞系。令人满意的集落应与其他细胞集落分离，并且具有中等大小，因为非常大和出色的克隆可以来自多个细胞（图 1B）。
2. 使用倒置显微镜仔细检查培养皿并评估发现的克隆，找到合适的菌落。将标记放在所选克隆的位置，标记位于下面的培养皿上。同时，在打印的培养皿平面上标记菌落定位（图 1B）。
   注意：应从培养皿中选择大约 20-30 个菌落。有时，获得的细胞克隆较少，在这种情况下，应分离所有细胞克隆。

6. 玻璃圆筒的制备

1. 在分离克隆之前，将玻璃圆柱体（直径 6.4 毫米，高度 8 毫米）（图 1C）放入第一个玻璃培养皿中并高压灭菌。
2. 高压灭菌第二个玻璃培养皿。
3. 在第二个高压灭菌的玻璃培养皿的底部涂上一层薄薄的硅脂。将培养皿放在层流柜下，用紫外线照射 30 分钟以对硅脂进行消毒。
   注意：或者，硅脂可以高压灭菌。
4. 将高压灭菌的圆筒浸入涂有硅脂的培养皿中。现在，他们已准备好隔离克隆。
5. 分离克隆后，根据适用于处理它们的细胞材料的规则清洁圆柱体。在转基因的情况下，使用次氯酸钠进行灭菌。
6. 用二甲苯清洗气瓶过夜，以清除其中的硅脂。
7. 在化学罩下用去离子水清洗钢瓶以去除二甲苯溶液。
8. 将气瓶放在纸巾上晾干。
9. 将圆柱体存放在玻璃培养皿中。
10. 从本手册的第 1 点开始，在下次使用之前准备气瓶。

7. 克隆的分离

1. 准备一个 24 孔板，每个孔中含有 0.5 mL 预热的完全细胞培养基。
2. 用 15 mL 温热的无菌 PBS 小心洗涤在 150 mm 培养皿上生长的转染细胞 3 次。小心吸出并丢弃 PBS。
3. 使用无菌镊子转移一侧有油脂的气瓶。将培养皿底部的圆柱体压在标记克隆的位点，以在单细胞克隆来源的生长菌落周围创建孤立的孔。
   注意： 气瓶应牢固地粘在底部，以防止液体泄漏。
4. 向每个圆筒中加入 50 μL 胰蛋白酶溶液，并孵育几分钟。小心不要用酶法损坏细胞。逐个处理菌落。请记住更换每个圆筒的移液器吸头，以免其他菌落污染菌落。
   注：孵育时间取决于所使用的细胞系，需要根据经验确定。胰蛋白酶溶液可以上下移液以促进细胞分离。使用倒置显微镜仔细监测细胞脱离。细胞分离后，向每个圆柱体中加入 50 μL 细胞培养基以终止胰蛋白酶活性。
5. 立即将 100 μL 细胞悬液转移到 24 孔板的一个孔中的培养基中。
   注：在这里，使用浓度为 0.5 μg/mL 的选择性抗生素继续克隆生长。
6. 监测细胞克隆在 24 孔板中的生长情况，当它们达到 90% 汇合时，将其转移到 6 孔板中。遵循协议第 1 节中的说明;仅更改胰蛋白酶 （0.5 mL） 和终止培养基 （1.5 mL） 的体积。
7. 监测在 6 孔板中生长的细胞克隆，当它们达到汇合时，将它们转移到 T12.5 细胞培养瓶中。
8. 观察 T12.5 细胞培养瓶中的细胞克隆，当它们达到汇合时，使用合适的方法进行传代培养和计数，例如使用自动细胞计数仪或血细胞计数器。在含有 70% 完全培养基和选择性抗生素、20% （v/v） FBS 和 10% （v/v） DMSO 的培养基中冷冻一半的细胞。将其余细胞接种在盖玻片 （12 mm x 12 mm） 上进行免疫染色，并接种到六孔板的两个孔中，用于 gDNA 分离和裂解物制备。
   注：对于 A375 细胞系，每个盖玻片接种 45,000 个细胞，6 孔板每孔接种 450,000 个细胞。

8. 验证生成的细胞克隆

1. 免疫染色
   注：对细胞进行免疫染色以确定目标蛋白 （POI） 的表达水平。重要的是同时对野生型细胞或对照克隆进行染色作为对照，以便能够比较 POI 的表达水平（图 2A）。
   1. 吸出并丢弃细胞培养基。
   2. 用 PBS 洗涤在盖玻片上生长的细胞 3 次。
   3. 向每个孔中加入 0.5 mL 4% 甲醛溶液来固定细胞，并在室温下孵育 20 分钟。
      注：不同的抗体可能需要不同的固定方法。
   4. 用 PBS 洗涤细胞两次。
   5. 为了透化细胞，将盖玻片在 PBS 中的 0.1% Triton X-100 中在 RT 下孵育 5 分钟。
      注：不同的抗体可能需要不同的透化方法。
   6. 用 PBS 洗涤盖玻片两次。
   7. 将盖玻片放入染色室⁹.
   8. 将盖玻片在 1% （w/v） BSA 和 0.1% （v/v） Triton X-100 的 PBS 溶液中在 RT 下孵育 30 分钟，以避免抗体的非特异性结合。
   9. 用针头和镊子将带边缘的盖玻片放在一块木质素上，以去除溶液。
   10. 制备由 1% （w/v） BSA 和 0.1% （v/v） Triton X-100 PBS 中的一抗组成的染色溶液。将 30 μL 溶液滴在每个盖玻片上，并在潮湿的湿度室中于 4 °C 孵育 24 小时。
       注：本实验中使用 1：200 稀释的小鼠抗 GSN 抗体。
   11. 用针和镊子将带边缘的盖玻片放在一块木质素上，以去除溶液。将盖玻片放入 24 孔板中。
   12. 在 RT 下用 PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
   13. 在 PBS 溶液中，在 1% （w/v） BSA 和 0.1% （v/v） Triton X-100 中制备二抗和染料。将 30 μL 溶液滴在每个盖玻片上，并在 RT 下避光孵育 1 小时。
       注：使用 1：200 稀释度的驴抗小鼠荧光标记的二抗 488。为了检测 F 肌动蛋白和细胞核，我们使用了 1：200 稀释的鬼笔环肽-Alexa Fluor 568 和 1：1000 稀释的 Hoechst 33342。
   14. 用针和镊子将带边缘的盖玻片放在一块木质素上，以去除溶液。将盖玻片放入 24 孔板中。
   15. 在 RT 下在黑暗中用 PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
   16. 用去离子水清洗盖玻片一次。
   17. 使用安装介质将盖玻片安装在显微镜玻璃上。
   18. 使用共聚焦显微镜观察细胞染色，以确定衍生克隆中表达的 POI 水平（图 2A）。
2. Western Blot 分析
   注：为了确认衍生克隆中 POI 表达的缺乏、升高水平或降低水平，请在标准条件下进行蛋白质印迹分析¹⁰。同时分析野生型细胞或对照克隆（图 2B、C）。
   1. 用 PBS 洗涤在六孔板孔中生长的细胞 3 次。
   2. 使用刮刀将细胞收获到所选缓冲液中，并轻轻涡旋 20 秒。对样品进行三个冷冻（-80 °C）和解冻（4 °C）循环。
      注：使用细胞骨架结合的蛋白质提取缓冲液 [10 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）、1 mM 乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N、N、N'、N'-四乙酸 （EGTA）、1 mM NaF、20 mM Na₄P₂O₇、2 mM Na₃VO₄、1% （v/v） Triton X-100、10% （v/v） 甘油， 0.1% （w/v） SDS、0.5% 脱氧胆酸钠] 或尿素缓冲液 [50 mM TRIS-HCl pH 7、5% （w/v） SDS、8.6% （w/v） 蔗糖、74 mM 尿素、1 mM DTT]，均添加 1：100 蛋白酶抑制剂混合物、1：100 丝氨酸磷酸酶抑制剂和 1：100 酪氨酸磷酸酶抑制剂。
   3. 将裂解物在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟。
   4. 测定样品中的蛋白质浓度（例如，通过 BCA 测定）。
      注：测定取决于与缓冲液成分的相容性。
   5. 为了对样品进行蛋白质印迹分析，将 30 μg 蛋白质加载到聚丙烯酰胺凝胶 （7%-15%） 上的每个孔中。
   6. 进行 SDS-PAGE 电泳并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
   7. 通过用合适的抗体对膜进行染色来可视化 POI 表达的水平（图 2B、C）。
      注：使用 1：2000 稀释的小鼠抗 GSN 抗体和 1：200 稀释的小鼠抗 GAPDH 抗体。有关详细信息，请参阅我们的论文 ^2,11。曝光时间应足够长，以免忽视微弱信号（图 2C）。
3. gDNA 分析
   注意：通过显微和蛋白质印迹技术估计衍生克隆中 POI 表达水平后，应分析基因组 DNA。比较在所获得克隆的 gDNA 模板上获得的 PCR 反应产物的长度，可提供有关 GOI 序列是否被编辑的信息（图 2D）。
   1. 用 PBS 洗涤在六孔板孔中生长的细胞 3 次。
   2. 使用 1 mL PBS 中的刮刀收获细胞。
   3. 将细胞在 4 °C 下以 5000 x g 离心 5 分钟。
   4. 吸出并丢弃上清液。
      注意：沉淀可以在 -80 °C 下储存数月。
   5. 使用市售的 gDNA 提取试剂盒从衍生克隆的沉淀中分离 gDNA。
   6. 通过在 CRISPR/Cas9 基因编辑位点对 gRNA 靶标的上游和下游至少 300 bp 进行退火来设计 PCR 引物。
      注：使用了以下引物：Fwd：5'gtgcagccaggatgagag3'，Rev：5'ccctgttactggtgcatc3'。
   7. 根据制造商的说明，使用 DNA 聚合酶预混液进行 PCR 反应。
      注：PCR 反应混合物的组成如 表 1 所示，用于 PCR 反应的热循环仪设置如 表 2 所示。
   8. 在 Tris-乙酸-EDTA 缓冲液（40 mM Tris pH 8.0、20 mM 乙酸、1 mM EDTA）中，在 1% 或 2% （w/v） 琼脂糖凝胶中分析 PCR 产物。
   9. 将 GSN KO 克隆的 PCR 产物扩增子长度与 CTRL KO 克隆的 PCR 产物长度 （203 bp; 图 2D）。
4. gDNA 测序
   1. 通过与 CRISPR/Cas9 （D10A） 质粒编码的 gRNA 识别的序列的上游和下游序列退火来设计 PCR 引物。
      注：设计引物如下：Fwd：5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3'，修订版：5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'。
   2. 使用高保真 DNA 聚合酶（这种分析在 DNA 扩增过程中需要高准确性）和 gDNA 作为模板进行 PCR。
      注：PCR 反应混合物的组成如 表 3 所示，用于 PCR 反应的热循环仪设置如 表 4 所示。
   3. 通过在 37°C 下孵育 1 小时，在多个克隆位点内用限制性内切酶线性化质粒。
      注：限制性消化反应混合物的组成如 表 5 所示。使用什么质粒并不重要。pACGFP-C1 与 EcoRI 酶线性化。
   4. 通过琼脂糖凝胶电泳估计插入片段和切割质粒的浓度。
   5. 制备 DNA 组装反应。
      注意：可以使用传统的克隆方法或任何其他方法。
   6. 转化感受态细菌（例如，通过热休克程序）¹²。
   7. 分离质粒（例如，根据制造商的说明或引用的方案，从每个构建体的六个细菌菌落中分离质粒）¹³。
   8. 通过限制性酶切和 DNA 电泳检查插入片段是否已成功克隆到质粒中，以及其长度是否合适。
      注：如果所选菌落不包含带插入片段的质粒，则应从后续细菌菌落中分离质粒。
   9. 通过质粒测序确认基因编辑（图 3）。
      注意：由于存在两个基因等位基因，因此每个衍生的细胞克隆应至少获得两种不同的 DNA 测序结果。对于多倍体细胞系（大于 2 n），有必要对更多的质粒进行测序，以获得细胞中获得的所有基因拷贝的序列。根据需要分离尽可能多的菌落，直到分离出具有基因所有拷贝的克隆序列的质粒。可以使用市售试剂盒来估计所研究基因的基因座数量。
   10. 使用多序列比对程序比较为 GSN KO 和 CTRL KO 克隆获得的 gDNA 序列（图 3）。

表 1.PCR 反应混合物的组成。

表 2.PCR 反应的热循环仪设置。

表 3.PCR 反应混合物的组成。

表 4.PCR 反应的热循环仪设置。

表 5.限制性酶切反应混合物的组成。

9. 评估细胞系的表型异质性

1. 对细胞进行免疫染色以确定 POI 表达水平。
2. 在共聚焦显微镜中使用 60 倍油浸镜头拍摄照片，无需放大。
3. 要确定不同水平细胞的分布比率，请使用大多数显微图像分析程序中通常提供的“曝光过度/曝光不足”工具。将显示曝光不足区域的细胞视为在低水平上产生 POI。将过度曝光的细胞分类为具有高水平 POI 表达的细胞，将其余细胞分类为中等水平表达 POI。

使用提出的方案，我们详细演示了用玻璃圆筒法分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆（图 1A）。我们的研究与黑色素瘤细胞生物学有关，我们使用的最常见的研究模型是粘附性和高度侵入性的 A375 黑色素瘤系。由于我们的研究表明，与其他类型的癌症相比，黑色素瘤细胞产生高水平的凝溶胶蛋白 （GSN）¹⁴，我们正在研究这种蛋白质在...

我们提供了用玻璃圆柱体分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的详细描述。在衍生基因表达发生变化的克隆时，获得对照克隆很重要，因为应始终将靶向修饰克隆获得的结果与对照获得的结果进行比较。通过这种方式，我们可以检查转染本身或用选择性抗生素培养是否不会影响实验结果，而不是一些其他因素，例如引入的基因改造。在规划细胞克隆制备时，值得检查测试的...

作者声明没有竞争性的经济利益。

这项工作得到了波兰国家科学中心的支持（项目 #2016/22/E/NZ3/00654，授予 AJM）。