JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم وصف بروتوكول لعزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المنقولة بثبات باستخدام أسطوانات زجاجية. نحن نركز على المشورة العملية التي قد تكون حاسمة لنجاح الإجراء بأكمله.

Abstract

يستخدم العلماء على نطاق واسع مجموعات الخلايا التي لديها تغييرات مستقرة في معلوماتها الجينومية كنموذج بحثي. لا تتطلب تعداء الخلايا المتكررة لأنها يمكن أن تؤدي إلى مجموعة خلايا غير متجانسة وكفاءة تعداء متغيرة ، مما يؤثر على قابلية التكاثر. علاوة على ذلك ، فهي أفضل للتحليلات واسعة النطاق. يعد توليد استنساخ الخلايا المستقرة مفيدا لمجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل البحث عن وظائف الجينات وإنتاج البروتين المؤتلف. هناك عدة طرق للحصول على مجموعة خلايا متجانسة عند التعداء العابر الأولي. هنا ، نصف عزل المستنسخة أحادية الخلية مع الأسطوانات الزجاجية. على الرغم من أن هذه الطريقة معروفة منذ بعض الوقت ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة ، وقد يؤدي إهمالها إلى الفشل. لقد استخدمنا هذه الطريقة بنجاح للحصول على استنساخ يفرط في التعبير بثبات عن البروتين محل الاهتمام (POI) أو بالضربة القاضية للجين المعني (GOI). نصف خطوات التحضير مثل تحسين اختيار تركيزات الدواء ، وتحضير الأسطوانات الزجاجية ، والتحقق من صحة ما إذا كانت المستنسخة التي تم الحصول عليها لديها التغيير المطلوب في التعبير عن GOI عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تحليل اللطخة الغربية ، أو التلوين المناعي ، أو تسلسل gDNA (اعتمادا على نوع المستنسخة المشتقة). نناقش أيضا عدم تجانس النمط الظاهري لخطوط الخلايا الراسخة لأن هذه قد تكون مشكلة في الحصول على استنساخ خلايا مستقرة.

Introduction

يعد التعدي المستقر لخلايا الثدييات طريقة تستخدم بشكل روتيني في العديد من تطبيقات زراعة الخلايا ، بما في ذلك أبحاث السرطان. تتمثل ميزته على التعدي العابر في أنه لا يمكن فقدان المادة الوراثية الغريبة التي تم إدخالها بسبب العوامل البيئية (على سبيل المثال ، التقاء الخلية أو مرحلة النسخ المتماثل) وانقسام الخلية لأنها مدمجة في جينوم المضيف1. يمكن أن يكون تطوير خطوط الخلايا التي تعبر بثبات شاقا وصعبا ، ولكن إذا كان التعبير المستمر عن الجينات مطلوبا لفترة طويلة ، فإن اشتقاق خطوط الخلايا المستقرة هو الخيار المفضل. الهدف الأكثر شيوعا من التعدي هو دراسة وظائف جين معين أو منتج جيني معين عن طريق الإفراط في الإنتاج أو تقليل تنظيم تعبيره. ومع ذلك ، فإن إنتاج البروتينات المؤتلفة والعلاجات الجينية يتطلب أيضا إدخال مادة وراثية غريبة في الخلية2.

يتم تعريف الاستنساخ على أنه مجموعة خلايا مشتقة من خلية فردية واحدة. يعد عزل المستنسخة أحادية الخلية جانبا مهما من بيولوجيا الخلية عند دراسة الخلايا ذات التباين الجيني والظاهري. يتم استخدام ثلاث تقنيات رئيسية لاشتقاق استنساخ الخلايا: تقنية التخفيف ، وتقنية حلقة الاستنساخ3 ، وتقنية فرز الخلايا4. كل واحد له مزايا وعيوب. نقدم وصفا تفصيليا لطريقة عزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني باستخدام تقنية الأسطوانة الزجاجية. ميزة هذه الطريقة هي أن الخلايا تظهر نموا نسيلي معتدلا من مزارع الخلايا ذات الكثافة المنخفضة. علاوة على ذلك ، أثبتت الخلايا المختارة بالفعل قدرة على الانتشار لأنها شكلت بالفعل مستعمرات5. يتضمن هذا الإجراء زرع الخلايا المنقولة بشكل ضئيل ، ولكن ليس في الحد من التخفيف ، في وعاء كبير والسماح لها بالتوسع وتشكيل مستعمرات لمدة 2-3 أسابيع في وجود مضاد حيوي انتقائي. يمكن بعد ذلك عزل المستعمرات الفردية باستخدام أسطوانات زجاجية توضع فوق المستعمرات وتلتصق بالوعاء باستخدام شحم السيليكون. بعد ذلك ، يتم فصل الخلايا باستخدام التربسين ثم نقلها إلى ألواح متعددة الآبار لمزيد من الثقافة في وجود وسط انتقائي.

هناك عدد من الدراسات التي تصف عزل المستنسخة ، لكننا نركز على إظهار تفاصيل مثل الحجم الذي يجب أن تكون عليه المستنسخة بعد أسبوعين من الاختيار ، وكيفية تحديد موقع المستنسخة أثناء عزلها ، وكيفية اختيار تركيز مناسب من المضادات الحيوية للاختيار. نحن نركز على المشورة العملية التي قد تكون حاسمة لنجاح الإجراء بأكمله. يسمح لنا البروتوكول المقدم بالحصول على استنساخ خلوي مستقر في غضون 2-4 أسابيع. الطريقة سهلة ورخيصة ولا تتطلب معدات معقدة. نحن نتشارك تقنية سمحت لنا بالحصول على العديد من نماذج البحث ، بما في ذلك استنساخ GSN KO6،7،8.

Protocol

1. زراعة الخلايا الفرعية والبذر لتحسين تركيز الدواء

  1. قم بتسخين وسط زراعة الخلايا (في هذه الحالة ، وسط النسر المعدل من Dulbecco بتركيز منخفض (1.5 جم / لتر) من NaHCO3 ، و 10٪ (v / v) مصل بقري الجنين (FBS) ، و 1٪ (v / v) L-glutamine ، و 1٪ (v / v) مضاد حيوي مضاد للفطريات) ومحلول التربسين في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
  2. استنشق وسيط زراعة الخلية وتخلص منه من خلايا A735 التي تنمو في قارورة ثقافة خلية T25. يتم الحصول على خط الخلية من مصادر تجارية.
  3. اغسل أي وسط متبقي لزراعة الخلايا عن طريق غسل القارورة ب 1 مل من محلول التربسين أو PBS.
  4. استنشق وتخلص من محلول التربسين أو PBS من الخلايا.
  5. أضف 1 مل من محلول التربسين إلى القارورة واحتضنها عند 37 درجة مئوية. راقب بعناية انفصال الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
  6. أوقف نشاط التربسين عن طريق إضافة 3 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل الطازج وشطف قارورة زراعة الخلية به عند انفصال الخلايا.
  7. انقل تعليق الخلية من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
  8. الطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. استنشق وتخلص من المادة الطافية.
  10. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الطازجة.
  11. لحساب كثافة الخلية ، احسب الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي أو مقياس الدم.
  12. زرع العدد المناسب من الخلايا في طبق ثقافة بالحجم المناسب.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم زرع 450.000 خلية من خط الخلايا A375 في 2 مل من وسط زراعة الخلية في طبق استزراع 35 مم.

2. تحسين تركيز الدواء المختار

  1. ابحث عن نطاق التركيز الموصى به من الشركة المصنعة للدواء لاستخدامها في اختيار استنساخ الخلايا المستقرة.
    ملاحظة: يوفر جين الاختيار الذي يتم إدخاله في الخلية عن طريق التعداء باستخدام ناقل وراثي للخلية مقاومة لدواء الاختيار. تم استخدام بورومايسين بتركيز 1 ميكروغرام / مل كعلامة اختيار للحصول على تعبير مستقر عن الناقل الجيني والقضاء على الخلايا غير المنقولة.
  2. قم بزرع الخلايا في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا لتصل إلى التقاء 50٪ في اليوم التالي. قم بإعداد ثلاثة آبار لكل تركيز دواء وتحكم غير معالج. بذر 10,000 خلية لكل بئر. يعتمد رقم الخلية على خط الخلية المستخدم ويجب تحديده تجريبيا.
  3. بعد 24 ساعة ، قم بإعداد 10 تخفيفات من الدواء في الوسط الكامل من أدنى إلى أعلى تركيز موصى به من قبل الشركة المصنعة وإضافتها إلى الخلايا.
    ملاحظة: في هذه الحالة ، تم استخدام بورومايسين. كان نطاق التركيز 0-10 ميكروغرام / مل. كل 3 أيام ، أو عندما يلاحظ العديد من الخلايا الميتة في الوسط ، تتغير إلى وسط جديد.
  4. راقب الخلايا يوميا لمدة أسبوع وقم بتدوين الملاحظات المتعلقة بالتقائها وانتشارها وموتها فيما يتعلق بلوحة التحكم.
    ملاحظة: التركيز المناسب هو التركيز الذي تتوقف عنده الخلايا عن التكاثر ولا يسبب موت الخلايا على الفور ولكنه يقتل جميع الخلايا المعالجة بعد 48-120 ساعة. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض مجموعات خطوط الخلايا والأدوية ، قد لا تكون هناك مرحلة تتوقف فيها الخلايا عن التكاثر ولكنها تموت. في مثل هذه الحالة ، سيكون أدنى تركيز للدواء الذي يقتل جميع الخلايا مناسبا للاختيار.

3. بذر الخلايا وتعداء الخلايا

  1. بذر الخلايا في بئر من ستة آبار.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم النهائي لتعليق الخلية في وسط زراعة الخلية 2.5 مل. لهذه التجربة ، تم زرع 450.000 خلية لكل بئر. يجب تحديد عدد الخلية تجريبيا بحيث لا يمكن أن يتجاوز التقائها 90٪ بعد 48 ساعة من البذر.
  2. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تمت زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة قبل التعداد. ومع ذلك ، بعد 48 ساعة من البذر ، لوحظ أن الخلايا قد تم نقلها بشكل أكثر كفاءة.
  3. استنشق وتخلص من وسط زراعة الخلايا فوق الخلايا.
  4. يستعاض عن الوسط المهمل بوسط زراعة الخلايا الخالي من المضادات الحيوية المسخن مسبقا (10٪ (حجم/حجم) FBS، DMEM المكمل بالجلوتامين).
    ملاحظة: ترجع الحاجة إلى تغيير وسط زراعة الخلايا إلى زيادة نفاذية الخلية التي تسببها بعض كواشف التعدي ، والتي يمكن أن تسبب زيادة تدفق المضادات الحيوية إلى الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا.
  5. كواشف التعداء المخففة في DMEM الخالية من المضادات الحيوية والمصل. استخدم البولي إيثيلين إيثيلين (PEI) أو كاشف التعداء القائم على الدهون أو التثقيب الكهربائي. لتعداء الخلايا ، استخدم محلول بولي إيثيلين 2 مجم / مل بنسبة وزن 1: 2.175 ل 4 ميكروغرام من الحمض النووي.
    ملاحظة: كمحلول للحمض النووي ، تم استخدام خليط من بلازميدتين في نظام CRISPR / Cas9 (D10A) مع تسلسلات gRNA التالية: 5'ccgggccgtggcagcaccgtg3' و 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
  6. احتضان خليط التعداء لمدة 30 دقيقة في RT.
  7. بعد الحضانة ، أضف بعناية خليط التعدي بالتنقيط إلى الخلايا التي تنمو في آبار صفيحة من ستة آبار.
  8. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 2-6 ساعات.
  9. قم بتغيير الوسيط إلى وسط زراعة الخلية الكامل.
  10. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة 24 ساعة التالية.

4. توليد استنساخ الخلايا

  1. قم بالتربسين ونقل الخلايا المنقولة إلى طبق استزراع قطره 150 مم بشبكة مصبوبة 20 مم وفقا للتعليمات الواردة في القسم 1 من البروتوكول.
    ملاحظة: نظرا لاندماج الخلايا مع بعضها البعض في حالة الكثافة العالية ، يوصى بنقل الخلايا بالتساوي إلى طبقين لزراعة الخلايا. تساعد الشبكة الموجودة على طبق الثقافة في تحديد موقع المستنسخة وتتبع هجرتها. في خطة الطبق المطبوعة ، يمكن للمرء لاحقا تحديد موقع المستنسخة (الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للخلايا التي لا تتسامح مع إزالة الوسط والتعرض للهواء (مما يؤدي إلى الموت / الضرر الذي لا رجعة فيه) ، سيكون من الأفضل استخدام المزيد من الأطباق ذات المساحة الأصغر لعزل عدد أقل من المستعمرات من طبق واحد. هذا يمكن أن يقلل من وقت التعرض للهواء أثناء عزل الاستنساخ ويقلل من احتمالية جفاف الخلايا.
  2. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
  3. قم بتغيير وسط زراعة الخلية إلى وسط يحتوي على مضاد حيوي انتقائي.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، من المهم زراعة الخلايا في وجود مضاد حيوي انتقائي ؛ خلاف ذلك ، هناك فرصة لقطع الجين المعدل المتكامل من الجين.
  4. قم بتغيير الوسط كل 3 أيام أو عندما يكون هناك العديد من الخلايا الميتة التي تطفو في الوسط.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم تحضين الخلايا بالبورومايسين بتركيز 1 ميكروغرام / مل. تستغرق خطوة اختيار استنساخ الخلية حوالي أسبوعين. يجب مراقبة تكوين المستنسخة من خلال مراقبة نموها تحت المجهر المقلوب ، لأنها لا ينبغي أن تنمو وتلامس مع استنساخ الخلايا المجاورة. لا يمكن منع الخلايا من مستعمرة من الهجرة والنمو مع مستعمرة أخرى. لذلك ، من المهم مراقبة اللوحة لهجرة الخلايا من المستنسخة وملاحظة المعلومات المتعلقة بها في خطة الطبق.

5. اختيار المستنسخة للعزل

  1. افحص طبق زراعة الخلايا بحثا عن استنساخ الخلايا تحت مجهر مقلوب بهدف 10x أو 20x.
    ملاحظة: تتكون المستنسخة من ما يقرب من 500-30,000 خلية. ومع ذلك ، فإنه يعتمد على خط الخلية المستخدم. يجب فصل المستعمرة المرضية عن مستعمرات الخلايا الأخرى وأن تكون متوسطة الحجم حيث يمكن أن تنشأ المستنسخة الكبيرة جدا والمميزة من أكثر من خلية واحدة (الشكل 1 ب).
  2. ابحث عن مستعمرة مناسبة باستخدام المجهر المقلوب عن طريق فحص الطبق بعناية وتقييم المستنسخة الموجودة. ضع العلامة في موقع الاستنساخ المحدد مع وجود علامة على الطبق تحتها. في الوقت نفسه ، ضع علامة على توطين المستعمرة على خطة الطبق المطبوع (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: يجب اختيار ما يقرب من 20-30 مستعمرة من الطبق. في بعض الأحيان ، يتم الحصول على عدد أقل من المستنسخة من الخلايا ، ويجب عزلها جميعا في مثل هذه الحالات.

6. تحضير الاسطوانات الزجاجية

  1. قبل عزل المستنسخة ، ضع الأسطوانات الزجاجية (قطرها 6.4 مم وارتفاعها 8 مم) (الشكل 1 ج) في طبق بتري الزجاجي الأول وقم بتعقيمها.
  2. الأوتوكلاف طبق بتري الزجاجي الثاني.
  3. ضع طبقة رقيقة من شحم السيليكون في قاع طبق بتري الزجاجي الثاني المعقم. ضع الطبق تحت خزانة تدفق رقائقي وقم بتطبيق ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لتعقيم شحم السيليكون.
    ملاحظة: اختياريا ، يمكن تعقيم شحم السيليكون.
  4. اغمر الأسطوانات المعقمة في طبق بتري مغطى بالشحوم السيليكونية. الآن هم مستعدون لعزل المستنسخة.
  5. بعد عزل المستنسخة ، قم بتنظيف الأسطوانات وفقا للقواعد المطبقة على المواد الخلوية التي يتم التعامل معها. في حالة التعديل الجيني ، استخدم هيبوكلوريت الصوديوم للتعقيم.
  6. اغسل الأسطوانات بالزيلين طوال الليل لإزالتها من شحم السيليكون.
  7. اغسل الأسطوانات بالماء منزوع الأيونات تحت غطاء كيميائي لإزالة محلول الزيلين.
  8. ضع الأسطوانات على منشفة ورقية واتركها تجف.
  9. قم بتخزين الأسطوانات في طبق بتري زجاجي.
  10. قم بإعداد الأسطوانات قبل الاستخدام التالي ، بدءا من النقطة 1 من هذا الدليل.

7. عزل المستنسخة

  1. قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا تحتوي على 0.5 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل المسخن مسبقا في كل بئر.
  2. اغسل الخلايا المنقولة بعناية التي تنمو على طبق 150 مم ثلاث مرات باستخدام 15 مل من PBS الدافئ والمعقم. استنشق بعناية وتخلص من PBS.
  3. استخدم ملاقط معقمة لنقل الأسطوانات التي تحتوي على شحوم على جانب واحد. اضغط على الأسطوانات الموجودة في قاع طبق الاستزراع في مواقع المستنسخة المحددة لإنشاء آبار معزولة حول المستعمرات المتنامية ذات أصل استنساخ أحادي الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تلتصق الأسطوانة جيدا بالقاع لمنع تسرب السوائل.
  4. أضف 50 ميكرولتر من محلول التربسين إلى كل أسطوانة واحتضنه لبضع دقائق. احرص على عدم إتلاف الخلايا إنزيميا. قم بمعالجة المستعمرات واحدة تلو الأخرى. تذكر تغيير طرف الماصة لكل أسطوانة حتى لا تلوث المستعمرات بأخرى أخرى.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على خط الخلية المستخدم ويجب تحديده تجريبيا. يمكن سحب محلول التربسين لأعلى ولأسفل لتسهيل انفصال الخلية. راقب انفصال الخلايا بعناية باستخدام المجهر المقلوب. بعد انفصال الخلية ، أوقف نشاط التربسين عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل أسطوانة.
  5. انقل على الفور 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الوسط في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا.
    ملاحظة: هنا ، استمر نمو الاستنساخ بمضاد حيوي انتقائي بتركيز 0.5 ميكروغرام / مل.
  6. راقب نمو المستنسخة الخلوية في اللوحة المكونة من 24 بئرا ، وعندما تصل إلى 90٪ من التقاء ، انقلها إلى صفيحة من ستة آبار. اتبع التعليمات الواردة في القسم 1 من البروتوكول ؛ قم بتغيير أحجام التربسين (0.5 مل) ووسط التوقف (1.5 مل) فقط.
  7. راقب استنساخ الخلايا التي تنمو في صفيحة مكونة من ستة آبار ، وعندما تصل إلى التقاء ، انقلها إلى قارورة ثقافة الخلايا T12.5.
  8. راقب استنساخ الخلايا في قارورة ثقافة الخلايا T12.5 ، وعندما تصل إلى التقاء ، والزراعة الفرعية وقم بحسابها بطريقة مناسبة ، مثل استخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم. قم بتجميد نصف الخلايا في الوسط الذي يحتوي على 70٪ وسط كامل مع مضاد حيوي انتقائي ، و 20٪ (v / v) FBS ، و 10٪ (v / v) DMSO. قم بزرع باقي الخلايا على أغطية (12 مم × 12 مم) للتلوين المناعي وفي بئرين من صفيحة من ستة آبار لعزل gDNA وتحضير المحلل.
    ملاحظة: في حالة خط الخلايا A375 ، قم بزرع 45,000 خلية لكل غطاء و 450,000 خلية لكل بئر من صفيحة من ستة آبار.

8. التحقق من صحة استنساخ الخلايا التي تم إنشاؤها

  1. التلوين المناعي
    ملاحظة: قم بإجراء تلطيخ مناعي على الخلايا لتحديد مستوى التعبير عن البروتين محل الاهتمام (POI). من المهم تلطيخ الخلايا البرية أو التحكم في المستنسخة في وقت واحد كعنصر تحكم حتى تتمكن من مقارنة مستويات التعبير عن نقطة الاهتمام (الشكل 2 أ).
    1. استنشق وتخلص من وسط زراعة الخلايا.
    2. اغسل الخلايا التي تنمو على الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS.
    3. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ إلى كل بئر واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT.
      ملاحظة: يمكن أن تتطلب الأجسام المضادة المختلفة طرق تثبيت مختلفة.
    4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
    5. لاختراق الخلايا ، احتضان الغطاء في 0.1٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن أن تتطلب الأجسام المضادة المختلفة طرق نفاذية مختلفة.
    6. اغسل الأغطية مرتين باستخدام PBS.
    7. ضع الغطاء في غرفة تلطيخ9.
    8. احتضان الغطاء في 1٪ (وزن / حجم) BSA في 0.1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 في محلول PBS لمدة 30 دقيقة في RT لتجنب الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.
    9. قم بإزالة المحلول عن طريق وضع الغطاء مع الحافة على قطعة من اللجنين باستخدام إبرة وملاقط.
    10. تحضير محلول تلطيخ يتكون من أجسام مضادة أولية في 1٪ (وزن / حجم) BSA و 0.1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 في PBS. قم بإسقاط 30 ميكرولتر من المحلول على كل غطاء واحتضانه لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في غرفة رطوبة رطبة.
      ملاحظة: تم استخدام الجسم المضاد للفأر المضاد ل GSN عند تخفيف 1: 200 في هذه التجربة.
    11. قم بإزالة المحلول عن طريق وضع الغطاء مع الحافة على قطعة من اللجنين باستخدام إبرة وملاقط. ضع الغطاء في طبق 24 بئرا.
    12. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق في RT.
    13. تحضير الأجسام المضادة والأصباغ الثانوية في 1٪ (وزن / حجم) BSA و 0.1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 في محلول PBS. قم بإسقاط 30 ميكرولتر من المحلول على كل غطاء واحتضانها لمدة 1 ساعة في RT في الظلام.
      ملاحظة: استخدم الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر المضادة للفأر 488 عند التخفيف 1: 200. للكشف عن F-actin ونواة الخلية ، استخدمنا الفالويدين-أليكسا فلور 568 عند تخفيف 1: 200 و Hoechst 33342 عند تخفيف 1: 1000.
    14. قم بإزالة المحلول عن طريق وضع الغطاء مع الحافة على قطعة من اللجنين باستخدام إبرة وملاقط. ضع الغطاء في طبق 24 بئرا.
    15. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
    16. اغسل الأغطية مرة واحدة بالماء منزوع الأيونات.
    17. قم بتركيب أغطية باستخدام وسيط التثبيت على زجاج المجهر.
    18. تصور تلطيخ الخلية باستخدام مجهر متحد البؤر لتحديد مستوى نقطة الاهتمام المعبر عنها في المستنسخة المشتقة (الشكل 2 أ).
  2. تحليل اللطخة الغربية
    ملاحظة: لتأكيد النقص أو المستوى المرتفع أو المستوى المنخفض لتعبير POI في المستنسخة المشتقة ، قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية في ظل الظروف القياسية10. قم بتحليل الخلايا من النوع البري أو استنساخ التحكم في وقت واحد (الأشكال 2 ب ، ج).
    1. اغسل الخلايا التي تنمو في بئر صفيحة من ستة آبار ثلاث مرات باستخدام PBS.
    2. احصد الخلايا باستخدام مكشطة إلى مخزن مؤقت من اختيارك ودوامة برفق لمدة 20 ثانية. قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد (عند -80 درجة مئوية) والذوبان (عند 4 درجات مئوية) للعينة.
      ملاحظة: استخدم إما المخزن المؤقت لاستخراج البروتين المرتبط بالهيكل الخلوي [10 ملي مولار Tris-HCl pH 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، 1 ملي مولار الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N '، N'-حمض التراأسيتيك (EGTA) ، 1 ملي NaF ، 20 ملي Na4P2O7 ، 2 ملي Na3VO4 ، 1٪ (v / v) Triton X-100 ، 10٪ (v / v) الجلسرين ، 0.1٪ (وزن / حجم) SDS ، 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم] ، أو مخزن اليوريا [50 ملي مولار TRIS-HCl درجة الحموضة 7 ، 5٪ (وزن / حجم) SDS ، 8.6٪ (وزن / حجم) سكروز ، 74 ملي مولار يوريا ، 1 ملي مولار DTT] ، كلاهما مع إضافة كوكتيل مثبط للبروتياز 1: 100 ، مثبط فوسفاتيز سيرين 1: 100 ، ومثبط فوسفاتيز التيروزين 1: 100.
    3. جهاز الطرد المركزي المحلل عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. تحديد تركيز البروتين في العينات (على سبيل المثال ، عن طريق اختبار BCA).
      ملاحظة: يعتمد الاختبار على التوافق مع تكوين المخزن المؤقت.
    5. لإجراء تحليل اللطخة الغربية للعينات ، قم بتحميل 30 ميكروغرام من البروتين في كل بئر على هلام بولي أكريلاميد (7٪ -15٪).
    6. قم بإجراء الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ونقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز.
    7. تصور مستوى تعبير نقطة الاهتمام عن طريق تلطيخ الغشاء بالأجسام المضادة المناسبة (الأشكال 2 ب ، ج).
      ملاحظة: تم استخدام الأجسام المضادة للفأر المضادة ل GSN عند تخفيف 1: 2000 والأجسام المضادة للفأر المضادة ل GAPDH عند تخفيف 1: 200. انظر أوراقنا للحصول على التفاصيل2،11. يجب أن يكون وقت التعرض طويلا بما يكفي لعدم التغاضي عن الإشارات الخافتة (الشكل 2C).
  3. تحليل gDNA
    ملاحظة: بعد تقدير مستوى تعبير POI في المستنسخة المشتقة بواسطة تقنيات اللطخة المجهرية والغربية ، يجب تحليل الحمض النووي الجيني. توفر مقارنة طول منتج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم الحصول عليه على قالب gDNA للنسخ المستنسخة التي تم الحصول عليها معلومات حول ما إذا كان تسلسل GOI قد تم تحريره (الشكل 2 د).
    1. اغسل الخلايا التي تنمو في بئر صفيحة من ستة آبار ثلاث مرات باستخدام PBS.
    2. احصد الخلايا باستخدام مكشطة في 1 مل من PBS.
    3. الطرد المركزي للخلايا عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. استنشق وتخلص من المواد الطافية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكريات لعدة أشهر عند -80 درجة مئوية.
    5. عزل gDNA من حبيبات المستنسخة المشتقة باستخدام مجموعة استخراج gDNA المتوفرة تجاريا.
    6. صمم بادئات PCR عن طريق تلدين ما لا يقل عن 300 نقطة أساس في المنبع واتجاه مجرى هدف gRNA في موقع تحرير الجينات CRISPR / Cas9.
      ملاحظة: تم استخدام البادئات التالية: Fwd: 5'gtgcagccaggatgag3 '، Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
    7. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام DNA Polymerase Master Mix وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يظهر تكوين خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجدول 1 ، ويتم عرض إعدادات التدوير الحراري لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجدول 2.
    8. تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في 1٪ أو 2٪ (وزن / حجم) جل الاغاروز في مخزن ثلاثي الأسيتات-EDTA (40 ملي مولار تريس درجة الحموضة 8.0 ، 20 ملي حمض الخليك ، 1 ملي EDTA).
    9. قارن طول أمبليكون منتج PCR لاستنساخ GSN KO بطول منتج PCR لاستنساخ CTRL KO (203 نقطة أساس ؛ الشكل 2 د).
  4. تسلسل gDNA
    1. صمم بادئات PCR عن طريق التلدين بالتسلسلات في المنبع والمصب من التسلسلات التي تم التعرف عليها بواسطة gRNAs المشفرة بواسطة بلازميدات CRISPR / Cas9 (D10A).
      ملاحظة: تصميم الاشعال على النحو التالي: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3 '، Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagacaggactaggc3'.
    2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (يتطلب هذا التحليل دقة عالية أثناء تضخيم الحمض النووي) و gDNA كقالب.
      ملاحظة: يظهر تكوين خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجدول 3 ، ويتم عرض إعدادات التدوير الحراري لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجدول 4.
    3. قم بخطي البلازميد بإنزيم تقييد داخل مواقع استنساخ متعددة عن طريق الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يظهر تكوين خليط تفاعل الهضم المقيد في الجدول 5. لا يهم ما هو البلازميد المستخدم. تم خطية pACGFP-C1 مع إنزيم EcoRI.
    4. تقدير تركيز الإدخالات وقطع البلازميد بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
    5. تحضير تفاعلات تجميع الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن استخدام طريقة الاستنساخ التقليدية أو أي طريقة أخرى.
    6. تحويل البكتيريا المختصة (على سبيل المثال ، عن طريق إجراء الصدمة الحرارية)12.
    7. عزل البلازميدات (على سبيل المثال ، من ست مستعمرات بكتيرية لكل بناء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو البروتوكول المذكور)13.
    8. تحقق مما إذا كان قد تم استنساخ الملحق بنجاح في البلازميد وأن طوله مناسب عن طريق تقييد الهضم والرحلان الكهربائي للحمض النووي.
      ملاحظة: إذا كانت المستعمرات المختارة لا تحتوي على بلازميد مع ملحق ، فيجب عزل البلازميدات عن المستعمرات البكتيرية اللاحقة.
    9. تأكيد تحرير الجينات عن طريق تسلسل البلازميد (الشكل 3).
      ملاحظة: يجب على المرء الحصول على نتيجتين مختلفتين على الأقل لتسلسل الحمض النووي لكل استنساخ خلية مشتقة بسبب وجود أليلين من الجينات. بالنسبة لخطوط الخلايا متعددة الصبغيات (أكبر من 2 ن) ، من الضروري تسلسل المزيد من البلازميدات للحصول على تسلسل جميع نسخ الجينات في الخلية التي يتم الحصول عليها. اعزل أكبر عدد ممكن من المستعمرات حسب الضرورة حتى يتم عزل البلازميدات ذات التسلسلات المستنسخة لجميع نسخ الجين. يمكن للمرء استخدام مجموعة متاحة تجاريا لتقدير عدد المواقع للجين المدروس.
    10. قارن تسلسلات gDNA التي تم الحصول عليها لاستنساخ GSN KO و CTRL KO باستخدام برنامج محاذاة متعدد التسلسل (الشكل 3).
الكواشفحجم
DNA بوليميراز ماستر ميكس7.5 ميكرولتر
برايمر أمامي (10 ميكرومتر)1.5 ميكرولتر
التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر)1.5 ميكرولتر
ماء معقم3.5 ميكرولتر
gDNA1 ميكرولتر يحتوي على 10 نانوغرام gDNA

الجدول 1. تكوين خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الخطواتدرجة الحرارة [°C]الوقت [بالدقائق: بالثواني]
19504:00
29500:30
35700:30
47200:45
5انتقل إلى 2 ، 35xX
67210:00
78∞

الجدول 2. إعدادات Thermocycler لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الكواشفحجم
5 × عازلة بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة4 ميكرولتر
dNTPs (10 ملليمتر)0.4 ميكرولتر
برايمر أمامي (10 ميكرومتر)1 ميكرولتر
التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر)1 ميكرولتر
ماء معقم12.4 ميكرولتر
gDNA1 ميكرولتر يحتوي على 10 نانوغرام gDNA
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة0.2 ميكرولتر

الجدول 3. تكوين خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الخطواتدرجة الحرارة [°C]الوقت [بالدقائق: بالثواني]
19800:30
29800:30
36100:30
47201:00
5انتقل إلى الخطوة 2 ، 35 مرةX
67210:00
78∞

الجدول 4. إعدادات Thermocycler لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الكواشفمبلغ
10 × عازلة3 ميكرولتر
إنزيم التقييد1 ميكرولتر
ماء معقم20.7 ميكرولتر
البلازميد5.3 ميكرولتر تحتوي على 5 ميكروغرام من الحمض النووي

الجدول 5 - المسائل المتعلقة ب تكوين خليط تفاعل الهضم التقييد.

9. تقييم عدم تجانس النمط الظاهري لخط الخلية

  1. قم بإجراء تلبوخية مناعية للخلايا لتحديد مستوى تعبير POI.
  2. التقط صورا بدون تكبير باستخدام عدسة غمر بالزيت بمعدل 60 ضعفا في مجهر متحد البؤر.
  3. لتحديد نسبة توزيع الخلايا ذات المستويات المختلفة ، استخدم أداة "التعرض الزائد / المنخفض" المتوفرة عادة في معظم برامج تحليل الصور المجهرية. عالج الخلايا التي تظهر مناطق غير معرضة للضوء على أنها تنتج نقطة الاهتمام عند مستوى منخفض. صنف الخلايا المعرضة بشكل مفرط على أنها خلايا ذات مستوى عال من تعبير POI والخلايا المتبقية على أنها تعبر عن POI على مستوى متوسط.

النتائج

باستخدام البروتوكول المقدم ، نقدم عرضا توضيحيا مفصلا لعزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المستقرة بطريقة الأسطوانة الزجاجية (الشكل 1 أ). تتعلق دراساتنا ببيولوجيا خلايا الورم الميلانيني ، ونموذج البحث الأكثر شيوعا الذي نستخدمه هو خط الورم الميلانيني A375 ...

Discussion

لقد قدمنا وصفا مفصلا لعزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المستقرة بأسطوانات زجاجية. من المهم الحصول على استنساخات التحكم عند اشتقاق المستنسخة ذات التعبير المتغير عن الجينات لأن النتائج التي تم الحصول عليها لاستنساخ التعديل المستهدف يجب دائما مقارنتها بالنتائج التي ت?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا (المشروع # 2016/22 / E / NZ3 / 00654 ، الممنوح ل AJM).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml centrifuge tubeGoogleLab ScientificG66010522
150 mm cell culturedish with 20 mm gridFalcon353025
24-wells plateVWR International10062-896
35 mm culture dishEppendorfEP0030700112
6-well plateEppendorfEP0030700113
96-well plateVWR International10062-900 
Acetic acid, 80% solutionChempur115687330
AgaroseProna-AboBLE500
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062
anti-GAPDH antibodiesSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
anti-GSN antibodies  - clone C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
anti-GSN antibodies  - clone GS-2C4Sigma-AldrichG44896
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)EurXE2525
Control Double Nickase PlasmidSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Coverslipsbionovo16283
Dako Mounting medium ClontechS3023
DMSO -  Dimethyl sulfoxideapplichemA3672,0250
DNA Purification Kit EurX3555-02
donkey anti- mouse-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10197777001
EcoRI Thermo Fisher ScientificFD0274
EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid Poch (Pol-Aura)593280117
EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid Sigma-AldrichE0396
FBS - Fetal Bovine Serum Gibco10270-106
Gelsolin CRISPR PlasmidsSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
FormaldehydeSigma-AldrichP6148
GlycerolSigma-AldrichL-4909
high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium with reduced concentration (1.5 g/l) of NaHCO3 Polish Academy of Science,Wrocfigure-materials-2768aw, Poland11-500
Hoechst 33342 Thermo Fisher ScientificH3570
L-GlutamineGibco25030-024
Lignin BionovoB-0521
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder Assembly Tool http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1 Clontech
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific 26616
Perfect 100 bp DNA ladderEurXE3134
phalloidin-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma-AldrichP5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma-AldrichP0044
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher ScientificF530S
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
polyethylenimine (PEI)Sigma-Aldrich408727
protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340
puromycinInviviGenant-pr
SDS - sodium dodecyl sulfate Sigma-AldrichL4509
silicone CX80 Polska
Sodium chloride - NaClChempur7647-14-5
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750259
sucrosePoch (Pol-Aura)PA-06-772090110
the glass cylinders Sigma-AldrichC3983-50EA
Tissue Culture Flask 25mLVWR International10062-868
Tissue-culture 75 cm2 flaskVWR10062-872
Trisma baseSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
trypsin Polish Academy of Science,Wrocfigure-materials-5463aw, Poland20-500
ureaSigma-Aldrich8656
xylene solutionChempur115208603

References

  1. Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
  2. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  3. McFarland, D. C. Preparation of pure cell cultures by cloning. Methods in Cell Science. 22 (1), 63-66 (2000).
  4. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microbial Cell Factories. 5 (1), 1-11 (2006).
  5. Park, H. B., et al. Cell cloning-on-the-spot by using an attachable silicone cylinder. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (4), 768-772 (2016).
  6. Malek, N., et al. Knockout of ACTB and ACTG1 with CRISPR/Cas9(D10A) technique shows that non-muscle β and γ actin are not equal in relation to human melanoma cells' motility and focal adhesion formation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2746 (2020).
  7. Malek, N., et al. The origin of the expressed retrotransposed gene ACTBL2 and its influence on human melanoma cells' motility and focal adhesion formation. Scientific Reports. 11 (1), 3329 (2021).
  8. Mazurkiewicz, E., Nowak, D., Mazur, A. J. Gelsolin contributes to the motility of A375 melanoma cells and this activity is mediated by the fibrous extracellular matrix protein profile. Cells. 10 (8), 1848 (2021).
  9. Mazurkiewicz, E., Mrówczyńska, E., Simiczyjew, A., Nowak, D., Mazur, A. J. A Fluorescent gelatin degradation assay to study melanoma breakdown of extracellular matrix. Methods in Molecular Biology. , 47-63 (2021).
  10. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. BioEssays. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  11. Makowiecka, A., et al. Changes in biomechanical properties of A375 cells due to the silencing of TMSB4X expression are not directly correlated with alterations in their stemness features. Cells. 10 (4), 769 (2021).
  12. Pope, B., Kent, H. M. High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 24 (3), 536-537 (1996).
  13. JoVE Science Education Database. Plasmid Purification: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. JoVE. , (2022).
  14. Mazur, A. J., et al. Gelsolin interacts with LamR, hnRNP U, nestin, Arp3 and in human melanoma cells as revealed by immunoprecipitation and mass spectrometry. European Journal of Cell Biology. 95 (1), 26-41 (2016).
  15. Litwin, M., et al. Gelsolin affects the migratory ability of human colon adenocarcinoma and melanoma cells. Life Sciences. 90 (21-22), 851-861 (2012).
  16. Feldt, J., et al. Structure, regulation and related diseases of the actin-binding protein gelsolin. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1-10 (2019).
  17. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 1-37 (2021).
  18. Casden, N., Behar, O. An approach for accelerated isolation of genetically manipulated cell clones with reduced clonal variability. Journal of Cell Science. 132 (6), (2019).
  19. Nicosia, R. F., Villaschi, S., Smith, M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 30 (6), 394-399 (1994).
  20. Li, D., et al. Generation of human lens epithelial-like cells from patient-specific induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (12), 2555-2562 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved