Isolamento di cloni di cellule di melanoma trasfettate in modo stabile

Viene descritto un protocollo per isolare cloni di cellule di melanoma trasfettate stabilmente utilizzando cilindri di vetro. Ci concentriamo su consigli pratici che possono essere decisivi per il successo dell'intera procedura.

Le popolazioni cellulari che hanno cambiamenti stabili nelle loro informazioni genomiche sono ampiamente utilizzate dagli scienziati come modello di ricerca. Non richiedono trasfezione cellulare ripetuta in quanto può portare a una popolazione cellulare eterogenea e a un'efficienza di trasfezione variabile, compromettendo la riproducibilità. Inoltre, sono preferibili per analisi su larga scala. La generazione di cloni cellulari stabili è utile per un'ampia gamma di applicazioni, come la ricerca sulle funzioni geniche e la produzione di proteine ricombinanti. Esistono alcuni metodi per ottenere una popolazione cellulare omogenea dopo la trasfezione transitoria iniziale. Qui, descriviamo l'isolamento di cloni di singole cellule con cilindri di vetro. Sebbene questo metodo sia noto da tempo, ci sono alcuni passaggi cruciali e trascurarli può portare al fallimento. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per ottenere cloni che sovraesprimono stabilmente una proteina di interesse (POI) o con knockout di un gene di interesse (GOI). Descriviamo le fasi di preparazione come l'ottimizzazione della selezione delle concentrazioni di farmaci, la preparazione di cilindri di vetro e la convalida se i cloni ottenuti hanno il cambiamento desiderato nell'espressione del GOI mediante PCR, analisi western blot, immunocolorazione o sequenziamento del gDNA (a seconda del tipo di cloni derivati). Discutiamo anche l'eterogeneità fenotipica di linee cellulari ben consolidate, in quanto questo potrebbe essere un problema nell'ottenere cloni cellulari stabili.

La trasfezione stabile di cellule di mammifero è un metodo utilizzato di routine in diverse applicazioni di coltura cellulare, compresa la ricerca sul cancro. Il suo vantaggio rispetto alla trasfezione transitoria è che il materiale genetico estraneo introdotto non può essere perso a causa di fattori ambientali (ad esempio, la confluenza cellulare o lo stadio di replicazione) e la divisione cellulare perché è integrato nel genoma dell'ospite¹. Lo sviluppo di linee cellulari che esprimono stabilmente può essere laborioso e impegnativo, ma se è richiesta un'espressione sostenuta dei geni per un periodo prolungato, la derivazione di linee cellulari stabili è un'opzione preferita. Lo scopo più comune della trasfezione è studiare le funzioni di un gene specifico o di un prodotto genico mediante sovrapproduzione o sottoregolazione della sua espressione. Tuttavia, la produzione di proteine ricombinanti e le terapie genetiche richiedono anche l'introduzione di materiale genetico estraneo nella cellula².

Un clone è definito come una popolazione cellulare derivata da una singola cellula. L'isolamento di cloni di singole cellule è un aspetto cruciale della biologia cellulare quando si studiano cellule con variabilità genotipica e fenotipica. Per derivare i cloni cellulari vengono utilizzate tre tecniche principali: la tecnica di diluizione, la tecnica dell'anello di clonazione³ e la tecnica di selezione cellulare⁴. Ognuno ha vantaggi e svantaggi. Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo per isolare i cloni di cellule di melanoma utilizzando la tecnica del cilindro di vetro. Il vantaggio di questo metodo è che le cellule mostrano una crescita clonale moderata da colture cellulari a bassa densità. Inoltre, le cellule selezionate hanno già dimostrato capacità di proliferazione perché hanno già formato colonie⁵. Questa procedura prevede la semina di cellule trasfettate in modo scarso, ma non a diluizione limitante, in un grande vaso e la possibilità di espandersi e formare colonie per 2-3 settimane in presenza di un antibiotico selettivo. Le singole colonie possono quindi essere isolate utilizzando cilindri di vetro che vengono posizionati sopra le colonie e fatti aderire al recipiente utilizzando grasso siliconico. Successivamente, le cellule vengono staccate con tripsina e quindi trasferite su piastre multipozzetto per un'ulteriore coltura in presenza di un terreno selettivo.

Ci sono un certo numero di studi che descrivono l'isolamento dei cloni, ma ci concentriamo sul mostrare dettagli come la dimensione che i cloni dovrebbero avere dopo 2 settimane dalla selezione, come marcare la posizione dei cloni durante il loro isolamento e come scegliere una concentrazione appropriata di antibiotico per la selezione. Ci concentriamo su consigli pratici che possono essere decisivi per il successo dell'intera procedura. Il protocollo presentato ci permette di ottenere cloni cellulari stabili entro 2-4 settimane. Il metodo è facile ed economico e non richiede attrezzature complicate. Condividiamo una tecnica che ci ha permesso di ottenere molti modelli di ricerca, tra cui i cloni GSN KO ^6,7,8.

1. Subcoltura cellulare e semina per l'ottimizzazione della concentrazione di farmaci

1. Riscaldare il terreno di coltura cellulare (in questo caso, il terreno di Eagle modificato di Dulbecco con una concentrazione ridotta (1,5 g/L) di NaHCO₃, il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), l'1% (v/v) di L-glutammina e l'1% (v/v) di antibiotico-antimicotico) e la soluzione di tripsina a bagnomaria a 37 °C.
2. Aspirare ed eliminare il terreno di coltura cellulare dalle cellule A735 che crescono in un pallone di coltura cellulare T25. La linea cellulare è ottenuta da fonti commerciali.
3. Eliminare il terreno di coltura cellulare rimanente dalle cellule lavando il matraccio con 1 mL di tripsina o soluzione di PBS.
4. Aspirare ed eliminare la tripsina o la soluzione di PBS dalle cellule.
5. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina al matraccio e incubarlo a 37 °C. Osservare attentamente il distacco delle cellule utilizzando un microscopio invertito.
6. Arrestare l'attività della tripsina aggiungendo 3 mL di terreno di coltura cellulare completo fresco e sciacquare il pallone di coltura cellulare con esso quando le cellule si staccano.
7. Trasferire la sospensione cellulare dal pallone in una provetta da centrifuga da 15 mL.
8. Centrifugare le celle a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
9. Aspirare e scartare il surnatante.
10. Risospendere le cellule in 1 mL del terreno di coltura cellulare fresco.
11. Per calcolare la densità cellulare, contare le cellule con un contatore automatico di cellule o un emocitometro.
12. Seminare il numero appropriato di cellule in una piastra di coltura della dimensione appropriata.
    NOTA: In questo esperimento, 450.000 cellule della linea cellulare A375 sono state seminate in 2 mL di terreno di coltura cellulare in un piatto di coltura da 35 mm.

2. Ottimizzazione della concentrazione di farmaci selezionati

1. Trova l'intervallo di concentrazione raccomandato dal produttore del farmaco da utilizzare per selezionare cloni cellulari stabili.
   NOTA: Un gene di selezione introdotto in una cellula per trasfezione con un vettore genetico fornisce alla cellula resistenza al farmaco di selezione. La puromicina a una concentrazione di 1 μg/mL è stata utilizzata come marcatore di selezione per ottenere un'espressione stabile del vettore genetico ed eliminare le cellule non trasfettate.
2. Semina le cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per raggiungere il 50% di confluenza il giorno successivo. Preparare tre pozzetti per ogni concentrazione di farmaco e un controllo non trattato. Semina 10.000 cellule per pozzetto. Il numero di cellule dipende dalla linea cellulare utilizzata e deve essere determinato empiricamente.
3. Dopo 24 ore, preparare 10 diluizioni del farmaco nel terreno completo dalla concentrazione più bassa a quella più alta raccomandata dal produttore e aggiungerle alle cellule.
   NOTA: In questo caso, è stata utilizzata la puromicina. L'intervallo di concentrazione era 0-10 μg/mL. Ogni 3 giorni, o quando si osservano molte cellule morte nel terreno, passare a un terreno fresco.
4. Osserva le cellule ogni giorno per una settimana e prendi nota della loro confluenza, proliferazione e morte rispetto alla piastra di controllo.
   NOTA: Una concentrazione appropriata è quella alla quale le cellule smettono di proliferare e non causa la morte cellulare immediatamente, ma uccide tutte le cellule trattate dopo 48-120 ore. Tuttavia, per alcune combinazioni di linee cellulari e farmaci, potrebbe non esserci una fase in cui le cellule smettono di proliferare ma muoiono. In una situazione del genere, la concentrazione più bassa di farmaco che uccide tutte le cellule sarebbe appropriata per la selezione.

3. Semina e trasfezione cellulare

1. Semina le cellule in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
   NOTA: Il volume finale della sospensione cellulare nel terreno di coltura cellulare deve essere di 2,5 mL. Per questo esperimento sono state seminate 450.000 cellule per pozzetto. Il numero di celle deve essere determinato empiricamente in modo che la loro confluenza non possa superare il 90% dopo 48 ore di semina.
2. Coltivare le cellule a 37 °C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per 24 ore.
   NOTA: Le cellule sono state coltivate per 24 ore prima della trasfezione. Tuttavia, 48 ore dopo la semina, è stato osservato che le cellule sono state trasfettate in modo più efficiente.
3. Aspirare ed eliminare il terreno di coltura cellulare sopra le cellule.
4. Sostituire il terreno scartato con un terreno di coltura cellulare preriscaldato privo di antibiotici (10% (v/v) FBS, DMEM integrato con glutammina).
   NOTA: La necessità di cambiare il terreno di coltura cellulare è dovuta all'aumento della permeabilità cellulare causato da alcuni reagenti di trasfezione, che possono causare un aumento dell'afflusso di antibiotici nelle cellule, con conseguente morte cellulare.
5. Diluire i reagenti di trasfezione in DMEM privo di antibiotici e siero. Utilizzare polietilenimmina (PEI), reagente di trasfezione a base lipidica o elettroporazione. Per la trasfezione cellulare, utilizzare una soluzione di polietilenimmina da 2 mg/mL con un rapporto in peso di 1:2,175 per 4 μg di DNA.
   NOTA: Come soluzione di DNA, nel sistema CRISPR/Cas9(D10A) è stata utilizzata una miscela di due plasmidi con le seguenti sequenze di gRNA: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' e 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
6. Incubare la miscela di trasfezione per 30 minuti a RT.
7. Dopo l'incubazione, aggiungere con cura la miscela di trasfezione goccia a goccia alle cellule che crescono nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti.
8. Coltivare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per 2-6 ore.
9. Cambiare il terreno con il terreno di coltura cellulare completo.
10. Coltivare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per le successive 24 ore.

4. Generazione di cloni cellulari

1. Tripsinizzare e trasferire le cellule trasfettate in una piastra di coltura di 150 mm di diametro con una griglia stampata di 20 mm secondo le istruzioni nella sezione 1 del protocollo.
   NOTA: A causa della fusione delle cellule tra loro nel caso di alta densità, si consiglia di trasferire le cellule in modo uniforme in due piastre di coltura cellulare. La griglia sulla piastra di coltura aiuta a localizzare i cloni e a tracciare la loro migrazione. Su un piano di piatti stampato, si può successivamente segnare la posizione dei cloni (Figura 1B). Inoltre, per le cellule che non tollerano la rimozione del terreno e l'esposizione all'aria (con conseguente morte/danni irreversibili), sarebbe meglio utilizzare più piastre con una superficie più piccola per isolare meno colonie da una piastra. Ciò potrebbe ridurre il tempo di esposizione all'aria durante l'isolamento del clone e ridurre la probabilità di disidratazione cellulare.
2. Coltivare le cellule a 37 °C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per 24 ore.
3. Cambiare il terreno di coltura cellulare in un terreno contenente un antibiotico selettivo.
   NOTA: Da questo momento in poi, è importante coltivare le cellule in presenza di un antibiotico selettivo; In caso contrario, c'è la possibilità di tagliare il transgene integrato dal gene.
4. Cambia il terreno ogni 3 giorni o quando ci sono molte cellule morte che galleggiano nel terreno.
   NOTA: In questo esperimento, le cellule sono state incubate con puromicina a una concentrazione di 1 μg/mL. La fase di selezione del clone cellulare dura circa 2 settimane. La formazione dei cloni dovrebbe essere monitorata osservando la loro crescita al microscopio invertito, perché non dovrebbero crescere ed entrare in contatto con cloni cellulari vicini. Non si può impedire alle cellule di una colonia di migrare e crescere con un'altra colonia. Pertanto, è importante osservare la piastra per la migrazione cellulare dai cloni e annotare le informazioni al riguardo sul piano della piastra.

5. Scegliere i cloni per l'isolamento

1. Esaminare la piastra di coltura cellulare alla ricerca di cloni cellulari al microscopio invertito con un obiettivo 10x o 20x.
   NOTA: I cloni sono costituiti da circa 500-30.000 cellule. Tuttavia, dipende dalla linea cellulare utilizzata. Una colonia soddisfacente dovrebbe essere separata dalle altre colonie cellulari ed essere di dimensioni medie, poiché cloni molto grandi ed eccezionali possono derivare da più di una cellula (Figura 1B).
2. Trova una colonia adatta usando il microscopio invertito esaminando attentamente la capsula e valutando i cloni trovati. Posiziona il pennarello nella posizione del clone selezionato con il pennarello sul piatto sottostante. Contemporaneamente, segnare la localizzazione della colonia sul piano del piatto stampato (Figura 1B).
   NOTA: Dovrebbero essere selezionate circa 20-30 colonie dal piatto. A volte, si ottengono meno cloni cellulari e tutti dovrebbero essere isolati in questi casi.

6. Preparazione dei cilindri di vetro

1. Prima di isolare i cloni, posizionare i cilindri di vetro (6,4 mm di diametro e 8 mm di altezza) (Figura 1C) nella prima capsula di Petri di vetro e sterilizzarli in autoclave.
2. Autoclavare la seconda capsula di Petri in vetro.
3. Applicare un sottile strato di grasso siliconico sul fondo della seconda capsula di Petri in vetro autoclavata. Posizionare la capsula sotto una cappa a flusso laminare e applicare la luce UV per 30 minuti per sterilizzare il grasso al silicone.
   NOTA: Opzionalmente, il grasso siliconico può essere sterilizzato in autoclave.
4. Immergere i cilindri sterilizzati in autoclave in una capsula di Petri rivestita di grasso siliconico. Ora sono pronti per isolare i cloni.
5. Dopo aver isolato i cloni, pulire i cilindri secondo le norme applicabili al materiale cellulare con cui vengono manipolati. In caso di modificazione genetica, utilizzare l'ipoclorito di sodio per la sterilizzazione.
6. Lavare i cilindri con xilene durante la notte per ripulirli dal grasso siliconico.
7. Lavare i cilindri con acqua deionizzata sotto una cappa chimica per rimuovere la soluzione di xilene.
8. Mettete i cilindri su un tovagliolo di carta e lasciateli asciugare.
9. Conservare i cilindri in una capsula di Petri di vetro.
10. Preparare le bombole prima del successivo utilizzo, a partire dal punto 1 di questo manuale.

7. Isolamento dei cloni

1. Preparare una piastra da 24 pozzetti contenente 0,5 mL di terreno di coltura cellulare completo preriscaldato in ciascun pozzetto.
2. Lavare accuratamente le cellule trasfettate che crescono su un piatto da 150 mm tre volte con 15 mL di PBS caldo e sterile. Aspirare con cura e gettare il PBS.
3. Utilizzare pinzette sterili per trasferire i cilindri che hanno grasso su un lato. Premere i cilindri sul fondo di una capsula di coltura nei siti dei cloni marcati per creare pozzetti isolati attorno alle colonie in crescita di origine clone unicellulare.
   NOTA: Il cilindro deve aderire bene al fondo per evitare perdite di liquidi.
4. Aggiungere 50 μL di soluzione di tripsina in ciascun cilindro e incubare per alcuni minuti. Fare attenzione a non danneggiare enzimaticamente le cellule. Elabora le colonie una per una. Ricordarsi di cambiare il puntale della pipetta per ogni cilindro in modo da non contaminare le colonie con altre.
   NOTA: Il tempo di incubazione dipende dalla linea cellulare utilizzata e deve essere determinato empiricamente. La soluzione di tripsina può essere pipettata su e giù per facilitare il distacco delle cellule. Monitorare attentamente il distacco delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Dopo il distacco delle cellule, arrestare l'attività della tripsina aggiungendo 50 μl di terreno di coltura cellulare a ciascun cilindro.
5. Trasferire immediatamente 100 μl della sospensione cellulare nel terreno in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
   NOTA: In questo caso, la crescita del clone è stata continuata con un antibiotico selettivo a una concentrazione di 0,5 μg/mL.
6. Monitora la crescita dei cloni cellulari nella piastra a 24 pozzetti e, quando raggiungono il 90% di confluenza, trasferiscili in una piastra a sei pozzetti. Seguire le istruzioni nella sezione 1 del protocollo; modificare solo i volumi di tripsina (0,5 mL) e il mezzo di arresto (1,5 mL).
7. Monitora i cloni cellulari che crescono in una piastra a sei pozzetti e, quando raggiungono la confluenza, trasferiscili nel pallone di coltura cellulare T12.5.
8. Osservare i cloni cellulari nel pallone di coltura cellulare T12.5 e, quando raggiungono la confluenza, sottocoltivarli e contarli con un metodo adeguato, ad esempio utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Congelare metà delle cellule nel terreno contenente il 70% di terreno completo con antibiotico selettivo, il 20% (v/v) di FBS e il 10% (v/v) di DMSO. Seminare il resto delle cellule su vetrini coprioggetti (12 mm x 12 mm) per l'immunocolorazione e in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti per l'isolamento del gDNA e la preparazione del lisato.
   NOTA: Nel caso della linea cellulare A375, seminare 45.000 cellule per vetrino coprioggetti e 450.000 cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

8. Validazione dei cloni cellulari generati

1. Immunocolorazione
   NOTA: Eseguire l'immunocolorazione sulle cellule per determinare il livello di espressione della proteina di interesse (POI). È importante colorare contemporaneamente le cellule wild-type o i cloni di controllo come controllo per poter confrontare i livelli di espressione del POI (Figura 2A).
   1. Aspirare ed eliminare il terreno di coltura cellulare.
   2. Lavare tre volte le cellule che crescono sui vetrini coprioggetti con PBS.
   3. Fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di formaldeide al 4% a ciascun pozzetto e incubarle per 20 minuti a RT.
      NOTA: Anticorpi diversi possono richiedere metodi di fissazione diversi.
   4. Lavare le celle due volte con PBS.
   5. Per permeabilizzare le cellule, incubare i vetrini coprioggetti in Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 5 minuti a RT.
      NOTA: Anticorpi diversi possono richiedere metodi di permeabilizzazione diversi.
   6. Lavare i vetrini coprioggetti due volte con PBS.
   7. Posizionare i vetrini coprioggetti in una camera di colorazione⁹.
   8. Incubare i vetrini coprioggetti in 1% (p/v) di BSA in 0,1% (v/v) di Triton X-100 in soluzione PBS per 30 minuti a RT per evitare il legame aspecifico degli anticorpi.
   9. Rimuovere la soluzione posizionando il vetrino coprioggetti con il bordo su un pezzo di lignina usando un ago e una pinzetta.
   10. Preparare una soluzione colorante composta da anticorpi primari in BSA all'1% (p/v) e Triton X-100 allo 0,1% (v/v) in PBS. Far cadere 30 μL di soluzione su ciascun vetrino coprioggetti e incubarli per 24 ore a 4 °C in una camera umida.
       NOTA: In questo esperimento è stato utilizzato un anticorpo anti-GSN di topo alla diluizione di 1:200.
   11. Rimuovere la soluzione posizionando i vetrini coprioggetti con il bordo su un pezzo di lignina usando un ago e una pinzetta. Posizionare i vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti.
   12. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS per 5 minuti a RT.
   13. Preparare anticorpi secondari e coloranti in 1% (p/v) BSA e 0,1% (v/v) Triton X-100 in soluzione PBS. Far cadere 30 μL di soluzione su ciascun vetrino coprioggetti e incubarli per 1 ora a RT al buio.
       NOTA: Utilizzare anticorpi secondari 488 marcati con anti-topo fluorescente d'asino alla diluizione di 1:200. Per rilevare la F-actina e i nuclei cellulari, abbiamo utilizzato falloidina-Alexa Fluor 568 a diluizione 1:200 e Hoechst 33342 a diluizione 1:1000.
   14. Rimuovere la soluzione posizionando i vetrini coprioggetti con il bordo su un pezzo di lignina usando un ago e una pinzetta. Posizionare i vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti.
   15. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS per 5 minuti a RT al buio.
   16. Lavare una volta i vetrini coprioggetti con acqua deionizzata.
   17. Montare i vetrini coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio sul vetro del microscopio.
   18. Visualizzare la colorazione cellulare utilizzando un microscopio confocale per stabilire il livello di POI espresso nei cloni derivati (Figura 2A).
2. Analisi Western Blot
   NOTA: Per confermare la mancanza, il livello elevato o il livello ridotto di espressione dei POI nei cloni derivati, eseguire l'analisi del western blot in condizioni standard¹⁰. Analizzare contemporaneamente le cellule wild-type o i cloni di controllo (Figure 2B, C).
   1. Lavare tre volte le cellule che crescono nel pozzetto di una piastra a sei pozzetti con PBS.
   2. Raccogliere le cellule utilizzando un raschietto fino a un tampone a scelta e agitare delicatamente per 20 s. Eseguire tre cicli di congelamento (a -80 °C) e scongelamento (a 4 °C) del campione.
      NOTA: Utilizzare un tampone per l'estrazione delle proteine legate al citoscheletro [10 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 mM glicole etilenico-bis(2-amminoetil etere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na₄P₂O₇, 2 mM Na₃VO₄, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) glicerolo, 0,1% (p/v) SDS, 0,5% desossicolato di sodio] o tampone urea [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (p/v) SDS, 8,6% (p/v) saccarosio, 74 mM urea, 1 mM DTT], entrambi con l'aggiunta di cocktail di inibitori della proteasi 1:100, inibitori della serina fosfatasi 1:100 e inibitori della tirosina fosfatasi 1:100.
   3. Centrifugare i lisati a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
   4. Determinare la concentrazione proteica nei campioni (ad esempio, mediante saggio BCA).
      NOTA: Il test dipende dalla compatibilità con la composizione del tampone.
   5. Per condurre l'analisi western blot dei campioni, caricare 30 μg di proteine in ciascun pozzetto su gel di poliacrilammide (7%-15%).
   6. Eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE e trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa.
   7. Visualizzare il livello di espressione dei POI colorando la membrana con anticorpi idonei (Figure 2B, C).
      NOTA: Sono stati utilizzati anticorpi di topo anti-GSN alla diluizione 1:2000 e anticorpi di topo anti-GAPDH alla diluizione 1:200. Vedi i nostri articoli per i dettagli ^2,11. Il tempo di esposizione deve essere sufficientemente lungo da non trascurare i segnali deboli (Figura 2C).
3. Analisi del gDNA
   NOTA: Dopo aver stimato il livello di espressione di POI nei cloni derivati mediante tecniche microscopiche e western blot, il DNA genomico deve essere analizzato. Un confronto della lunghezza del prodotto della reazione PCR ottenuto sul modello di gDNA dei cloni ottenuti fornisce informazioni sul fatto che la sequenza del GOI sia stata modificata (Figura 2D).
   1. Lavare tre volte le cellule che crescono nel pozzetto di una piastra a sei pozzetti con PBS.
   2. Raccogliere le cellule utilizzando un raschietto in 1 mL di PBS.
   3. Centrifugare le celle a 5000 x g per 5 min a 4 °C.
   4. Aspirare e scartare i surnatanti.
      NOTA: Il pellet può essere conservato per diversi mesi a -80 °C.
   5. Isolare il gDNA da pellet di cloni derivati utilizzando un kit di estrazione del gDNA disponibile in commercio.
   6. Progettare primer PCR ricottura di almeno 300 bp a monte e a valle del bersaglio del gRNA nel sito di editing genetico CRISPR/Cas9.
      NOTA: Sono stati utilizzati i seguenti inneschi: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
   7. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando DNA Polimerasi Master Mix secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: La composizione della miscela di reazione PCR è mostrata nella Tabella 1 e le impostazioni del termociclatore per la reazione PCR sono presentate nella Tabella 2.
   8. Analizzare i prodotti della PCR in gel di agarosio all'1% o 2% (p/v) in tampone Tris-acetato-EDTA (40 mM Tris pH 8.0, 20 mM di acido acetico, 1 mM EDTA).
   9. Confronta la lunghezza dell'amplicone del prodotto PCR dei cloni GSN KO con la lunghezza del prodotto PCR dei cloni CTRL KO (203 bp; Figura 2D).
4. Sequenziamento del gDNA
   1. Progettare primer per PCR mediante ricottura alle sequenze a monte e a valle delle sequenze riconosciute dai gRNA codificati dai plasmidi CRISPR/Cas9(D10A).
      NOTA: Primer di progettazione come segue: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgactggaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
   2. Eseguire la PCR utilizzando la DNA polimerasi ad alta fedeltà (tale analisi richiede un'elevata precisione durante l'amplificazione del DNA) e il gDNA come modello.
      NOTA: La composizione della miscela di reazione PCR è mostrata nella Tabella 3 e le impostazioni del termociclatore per la reazione PCR sono presentate nella Tabella 4.
   3. Linearizzare il plasmide con un enzima di restrizione all'interno di più siti di clonazione incubando per 1 ora a 37°C.
      NOTA: La composizione della miscela di reazione di digestione di restrizione è mostrata nella Tabella 5. Non importa quale plasmide venga utilizzato. pACGFP-C1 è stato linearizzato con l'enzima EcoRI.
   4. Stimare la concentrazione degli inserti e tagliare il plasmide mediante elettroforesi su gel di agarosio.
   5. Preparare le reazioni di assemblaggio del DNA.
      NOTA: È possibile utilizzare un metodo di clonazione tradizionale o qualsiasi altro metodo.
   6. Trasformare i batteri competenti (ad esempio, mediante procedura di shock termico)¹².
   7. Isolare i plasmidi (ad esempio, da sei colonie di batteri per costrutto secondo le istruzioni del produttore o il protocollo citato)¹³.
   8. Verificare se l'inserto è stato clonato con successo nel plasmide e se la sua lunghezza è appropriata mediante digestione per restrizione ed elettroforesi del DNA.
      NOTA: Se le colonie selezionate non contengono un plasmide con un inserto, i plasmidi devono essere isolati dalle colonie batteriche successive.
   9. Confermare l'editing genetico mediante sequenziamento plasmidico (Figura 3).
      NOTA: Si dovrebbero ottenere almeno due risultati diversi del sequenziamento del DNA per ogni clone di cellula derivata a causa dell'esistenza di due alleli di geni. Per le linee cellulari multiploidi (maggiori di 2 n), è necessario sequenziare più plasmidi per ottenere la sequenza di tutte le copie geniche nella cellula che si ottengono. Isolare tutte le colonie necessarie fino a quando i plasmidi con le sequenze clonate di tutte le copie del gene sono isolati. È possibile utilizzare un kit disponibile in commercio per stimare il numero di loci per il gene studiato.
   10. Confrontare le sequenze di gDNA ottenute per i cloni GSN KO e CTRL KO utilizzando un programma di allineamento di sequenze multiple (Figura 3).

Tabella 1. Composizione della miscela di reazione PCR.

Tabella 2. Impostazioni del termociclatore per la reazione PCR.

Tabella 3. Composizione della miscela di reazione PCR.

Tabella 4. Impostazioni del termociclatore per la reazione PCR.

Tabella 5. Composizione della miscela di reazione di digestione di restrizione.

9. Valutare l'eterogeneità fenotipica della linea cellulare

1. Eseguire l'immunocolorazione delle cellule per determinare il livello di espressione dei POI.
2. Scatta foto senza ingrandimento utilizzando una lente a immersione in olio 60x in un microscopio confocale.
3. Per stabilire il rapporto di distribuzione delle cellule con livelli diversi, utilizzare lo strumento "sovra/sottoesposizione" che è solitamente disponibile nella maggior parte dei programmi di analisi delle immagini microscopiche. Trattare le cellule che mostrano aree sottoesposte come produttrici di POI a un livello basso. Classificare le cellule sovraesposte come cellule con un alto livello di espressione di POI e le cellule rimanenti come esprimenti POI a un livello medio.

Utilizzando il protocollo presentato, forniamo una dimostrazione dettagliata dell'isolamento di cloni di cellule di melanoma trasfettate stabilmente con il metodo del cilindro di vetro (Figura 1A). I nostri studi si riferiscono alla biologia cellulare del melanoma e il modello di ricerca più comune che utilizziamo è la linea di melanoma A375 aderente e altamente invasiva. Poiché la nostra ricerca ha dimostrato che le cellule di melanoma producono gelsolin...

Abbiamo fornito una descrizione dettagliata dell'isolamento di cloni di cellule di melanoma trasfettate stabilmente con cilindri di vetro. È importante ottenere cloni di controllo quando si derivano cloni con un'espressione genica modificata perché i risultati ottenuti per i cloni di modificazione mirati dovrebbero sempre essere confrontati con i risultati ottenuti per i controlli. In questo modo, possiamo verificare se la trasfezione stessa o la coltura con un antibiotico selettivo no...

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Center for Science, Polonia (progetto #2016/22/E/NZ3/00654, concesso ad AJM).