Выделение стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы

Описан протокол выделения стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы с помощью стеклянных цилиндров. Мы ориентируемся на практические советы, которые могут иметь решающее значение для успеха всей процедуры.

Клеточные популяции, которые имеют стабильные изменения в своей геномной информации, широко используются учеными в качестве исследовательской модели. Они не требуют повторной трансфекции клеток, так как это может привести к гетерогенной популяции клеток и переменной эффективности трансфекции, что влияет на воспроизводимость. Кроме того, они предпочтительнее для крупномасштабных анализов. Создание стабильных клеточных клонов полезно для широкого спектра применений, таких как исследования функций генов и производства рекомбинантных белков. Существует несколько методов получения однородной клеточной популяции при начальной транзиторной трансфекции. Здесь мы опишем выделение одноклеточных клонов с помощью стеклянных цилиндров. Хотя этот метод известен уже некоторое время, есть несколько важных шагов, пренебрежение которыми может привести к неудаче. Мы успешно использовали этот метод для получения клонов со стабильной сверхэкспрессией интересующего белка (POI) или с нокаутом интересующего гена (GOI). Мы описываем такие этапы подготовки, как оптимизация выбора концентраций лекарственного средства, подготовка стеклянных цилиндров и проверка наличия у полученных клонов желаемого изменения экспрессии ГОИ с помощью ПЦР, вестерн-блоттинга, иммуноокрашивания или секвенирования гДНК (в зависимости от типа полученных клонов). Мы также обсуждаем фенотипическую гетерогенность хорошо укоренившихся клеточных линий, поскольку это может быть проблемой при получении стабильных клеточных клонов.

Стабильная трансфекция клеток млекопитающих является рутинно используемым методом в нескольких областях применения клеточных культур, включая исследования рака. Его преимущество перед транзиторной трансфекцией заключается в том, что введенный чужеродный генетический материал не может быть потерян из-за факторов окружающей среды (например, слияния клеток или стадии репликации) и деления клеток, поскольку он интегрирован в геном хозяина¹. Разработка стабильно экспрессирующих клеточных линий может быть трудоемкой и сложной, но если требуется устойчивая экспрессия генов в течение длительного периода времени, получение стабильных клеточных линий является предпочтительным вариантом. Наиболее распространенной целью трансфекции является изучение функций конкретного гена или генного продукта путем перепроизводства или подавления его экспрессии. Однако производство рекомбинантных белков и генетическая терапия также требуют введения в клетку чужеродного генетического материала².

Клон определяется как клеточная популяция, полученная из одной отдельной клетки. Выделение клонов одиночных клеток является важнейшим аспектом клеточной биологии при изучении клеток с генотипической и фенотипической изменчивостью. Для получения клеточных клонов используются три основных метода: метод разбавления, метод клонирования кольца³ и метод сортировки клеток⁴. У каждого из них есть преимущества и недостатки. Приведено подробное описание метода выделения клеточных клонов меланомы с помощью технологии стеклянного цилиндра. Преимущество этого метода заключается в том, что клетки демонстрируют умеренный клональный рост из клеточных культур с низкой плотностью. Более того, отобранные клетки уже продемонстрировали способность к пролиферации, поскольку они уже образовали колонии⁵. Эта процедура предполагает засеивание трансфицированных клеток редко, но не при ограничении разведения, в большой сосуд и предоставление им возможности разрастаться и образовывать колонии в течение 2-3 недель в присутствии селективного антибиотика. Затем отдельные колонии могут быть изолированы с помощью стеклянных цилиндров, которые помещаются над колониями и приклеиваются к сосуду с помощью силиконовой смазки. Далее клетки отделяют трипсином, а затем переносят в многолуночные планшеты для дальнейшего культивирования в присутствии селективной среды.

Существует ряд исследований, описывающих выделение клонов, но мы сосредоточимся на демонстрации таких деталей, как размер, который должен быть у клонов после 2 недель отбора, как отмечать местоположение клонов во время их изоляции и как выбрать подходящую концентрацию антибиотика для отбора. Мы ориентируемся на практические советы, которые могут иметь решающее значение для успеха всей процедуры. Представленный протокол позволяет получать стабильные клеточные клоны в течение 2-4 недель. Способ легкий и дешевый и не требует сложного оборудования. Мы делимся методикой, которая позволила нам получить множество исследовательских моделей, в том числе клоны GSN KO ^6,7,8.

1. Субкультура и посев клеток для оптимизации концентрации препарата

1. Подогрейте среду для культивирования клеток (в данном случае модифицированную среду Дульбекко с уменьшенной концентрацией (1,5 г/л) NaHCO₃, 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% (v/v) L-глутамина и 1% (v/v) антибиотика-антимикотика) и раствор трипсина на водяной бане до 37 °C.
2. Отсадите и выбросьте питательную среду из клеток A735, выращиваемых в колбе для клеточных культур T25. Клеточная линия получается из коммерческих источников.
3. Вымойте остатки среды для культивирования клеток из клеток, промыв колбу 1 мл раствора трипсина или PBS.
4. Аспирируйте и выбросьте раствор трипсина или PBS из клеток.
5. Добавьте в колбу 1 мл раствора трипсина и инкубируйте его при 37 °С. Внимательно наблюдайте за отслоением клеток с помощью инвертированного микроскопа.
6. Остановите активность трипсина, добавив 3 мл свежей полной среды для клеточной культуры, и промойте ею колбу с клеточной культурой, когда клетки отделятся.
7. Переложите клеточную суспензию из колбы в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
8. Центрифугируйте ячейки при давлении 800 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
9. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость.
10. Ресуспендируйте клетки в 1 мл свежей клеточной питательной среды.
11. Чтобы рассчитать плотность клеток, подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
12. Засейте соответствующее количество клеток в культуральную чашку соответствующего размера.
    Примечание: В этом эксперименте 450 000 клеток клеточной линии A375 были посеяны в 2 мл среды для клеточных культур в 35-миллиметровой чашке для культивирования.

2. Оптимизация выбранной концентрации препарата

1. Найдите рекомендованный производителем диапазон концентраций используемого препарата для выбора стабильных клеточных клонов.
   Примечание: Селекционный ген, вводимый в клетку путем трансфекции с генетическим вектором, обеспечивает клетке устойчивость к селекционному препарату. Пуромицин в концентрации 1 мкг/мл использовали в качестве селекционного маркера для получения стабильной экспрессии генетического вектора и элиминации нетрансфицированных клеток.
2. Засейте клетки в лунки 96-луночного планшета, чтобы на следующий день достичь 50% конфлюенции. Подготовьте по три лунки для каждой концентрации препарата и необработанного контроля. Засейте 10 000 клеток в лунку. Номер ячейки зависит от используемой клеточной линии и должен быть определен опытным путем.
3. Через 24 ч приготовьте 10 разведений препарата в полной среде от наименьшей до самой высокой концентрации, рекомендованной производителем, и добавьте их в клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае был использован пуромицин. Диапазон концентраций составлял 0-10 г/мл. Каждые 3 дня, или когда в среде наблюдается много мертвых клеток, меняют на свежую среду.
4. Наблюдайте за клетками ежедневно в течение недели и делайте заметки об их слиянии, пролиферации и гибели относительно контрольной пластины.
   Примечание: Подходящей концентрацией является концентрация, при которой клетки прекращают пролиферацию и не вызывают немедленной гибели клеток, а убивают все обработанные клетки через 48-120 ч. Однако для некоторых комбинаций клеточных линий и лекарств может не быть фазы, когда клетки перестают размножаться, а умирают. В такой ситуации для отбора будет целесообразна самая низкая концентрация препарата, которая убивает все клетки.

3. Посев и трансфекция клеток

1. Засейте клетки в лунку шестилуночного планшета.
   Примечание: Конечный объем клеточной суспензии в среде для культивирования клеток должен составлять 2,5 мл. Для этого эксперимента было засеяно 450 000 клеток в лунку. Количество клеток нужно определить опытным путем, чтобы их слияние не превышало 90% после 48 ч посева.
2. Культивируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2 , в течение 24 ч.
   Примечание: Клетки культивировали в течение 24 ч перед трансфекцией. Однако через 48 ч после посева было замечено, что клетки трансфицируются более эффективно.
3. Отсадите и выбросьте среду для культивирования клеток над клетками.
4. Замените выброшенную среду предварительно подогретой средой для культивирования клеток без антибиотиков (10% (v/v) FBS, DMEM с добавлением глутамина).
   Примечание: Необходимость изменения среды для культивирования клеток обусловлена повышенной проницаемостью клеток, вызванной некоторыми реагентами для трансфекции, которые могут вызывать повышенный приток антибиотиков в клетки, что приводит к гибели клеток.
5. Разбавьте реагенты для трансфекции в ДМЭМ, не содержащем антибиотиков и сывороток. Используйте полиэтиленимин (ПЭИ), реагент для трансфекции на основе липидов или электропорацию. Для клеточной трансфекции используют раствор полиэтиленимина в дозе 2 мг/мл в массовом соотношении 1:2,175 на 4 мкг ДНК.
   Примечание: В качестве раствора ДНК использовали смесь двух плазмид в системе CRISPR/Cas9(D10A) со следующими последовательностями гРНК: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' и 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
6. Инкубировать трансфекционную смесь в течение 30 минут при RT.
7. После инкубации осторожно добавляйте трансфекционную смесь по каплям в клетки, растущие в лунках шестилуночного планшета.
8. Культивируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2 , в течение 2-6 часов.
9. Смените среду на полную среду для культивирования клеток.
10. Культивируйте клетки при температуре 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2 , в течение следующих 24 часов.

4. Генерация клеточных клонов

1. Трипсинизируйте и перенесите трансфицированные клетки в культуральную чашку диаметром 150 мм с формованной сеткой диаметром 20 мм в соответствии с инструкциями в разделе 1 протокола.
   Примечание: Из-за слияния клеток друг с другом в случае высокой плотности, рекомендуется равномерно переносить клетки в две чашки для клеточных культур. Сетка на чашке с культурой помогает находить клонов и отслеживать их миграцию. На распечатанном плане блюд впоследствии можно отметить местонахождение клонов (рис. 1B). Кроме того, для клеток, которые не переносят удаление среды и воздействие воздуха (что приводит к смерти/необратимому повреждению), было бы лучше использовать больше чашек с меньшей площадью поверхности, чтобы изолировать меньше колоний от одной чашки. Это может сократить время контакта с воздухом во время изоляции клонов и снизить вероятность обезвоживания клеток.
2. Культивируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2 , в течение 24 ч.
3. Смените среду для культивирования клеток на среду, содержащую селективный антибиотик.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента важно культивировать клетки в присутствии селективного антибиотика; В противном случае существует вероятность вырезания интегрированного трансгена из гена.
4. Меняйте среду каждые 3 дня или когда в ней плавает много мертвых клеток.
   Примечание: В этом эксперименте клетки инкубировали с пуромицином в концентрации 1 г/мл. Этап отбора клонов клеток занимает примерно 2 недели. За формированием клонов следует следить, наблюдая за их ростом под перевернутым микроскопом, ведь они не должны расти и вступать в контакт с клонами соседних клеток. Клетки из одной колонии не могут мигрировать и расти вместе с другой колонией. Поэтому важно наблюдать за пластиной на предмет миграции клеток от клонов и отмечать информацию об этом на плане блюда.

5. Выбор клонов для изоляции

1. Исследуйте чашку для клеточных культур на предмет клонов клеток под перевернутым микроскопом с объективом 10x или 20x.
   Примечание: Клоны состоят примерно из 500-30 000 клеток. Однако это зависит от используемой клеточной линии. Удовлетворительная колония должна быть отделена от других клеточных колоний и иметь средний размер, так как очень крупные и выдающиеся клоны могут возникать из более чем одной клетки (рис. 1B).
2. Найдите подходящую колонию с помощью перевернутого микроскопа, внимательно изучив чашку и оценив найденные клоны. Поместите маркер в месте расположения выбранного клона, а маркер — на тарелке под ним. Одновременно отметьте локализацию колонии на распечатанном плане посуды (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует выбрать примерно 20-30 колоний из блюда. Иногда получается меньшее количество клонов клеток, и в таких случаях все они должны быть изолированы.

6. Подготовка стеклянных цилиндров

1. Перед изоляцией клонов поместите стеклянные цилиндры (диаметром 6,4 мм и высотой 8 мм) (рис. 1В) в первую стеклянную чашку Петри и отавтоклавируйте их.
2. Автоклавируйте второй стакан чашки Петри.
3. Нанесите тонкий слой силиконовой смазки на дно второй автоклавной стеклянной чашки Петри. Поместите посуду под шкаф с ламинарным потоком и подайте ультрафиолетовый свет на 30 минут, чтобы стерилизовать силиконовую смазку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию силиконовая смазка может быть автоклавирована.
4. Погрузите автоклавные цилиндры в чашку Петри, покрытую силиконовой смазкой. Теперь они готовы изолировать клонов.
5. После изоляции клонов очистите цилиндры в соответствии с правилами, применимыми к ячеистому материалу, с которым они обрабатываются. В случае генетической модификации для стерилизации используют гипохлорит натрия.
6. Промойте цилиндры с ксилолом на ночь, чтобы очистить их от силиконовой смазки.
7. Промойте баллоны деионизированной водой под химическим колпаком, чтобы удалить раствор ксилола.
8. Выложите цилиндры на бумажное полотенце и дайте им высохнуть.
9. Храните цилиндры в стеклянной чашке Петри.
10. Подготовьте баллоны перед следующим использованием, начиная с пункта 1 данного руководства.

7. Изоляция клонов

1. Приготовьте 24-луночный планшет, содержащий 0,5 мл предварительно подогретой полной среды для культивирования клеток в каждой лунке.
2. Тщательно промойте трансфицированные клетки, растущие на чашке диаметром 150 мм, три раза 15 мл теплого стерильного PBS. Осторожно аспирируйте и выбросьте PBS.
3. Используйте стерильный пинцет для переноса цилиндров, которые имеют смазку с одной стороны. Надавите на цилиндры на дне чашки для культивирования в местах расположения помеченных клонов для создания изолированных лунок вокруг растущих колоний одноклеточного клонического происхождения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цилиндр должен хорошо прилегать ко дну, чтобы предотвратить утечку жидкостей.
4. Добавьте по 50 мкл раствора трипсина в каждый цилиндр и инкубируйте в течение нескольких минут. Будьте осторожны, чтобы не повредить клетки ферментативным путем. Обрабатывайте колонии одну за другой. Не забывайте менять наконечник пипетки для каждого баллона, чтобы не загрязнить колонии другими.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от используемой клеточной линии и должно быть определено опытным путем. Раствор трипсина можно дозировать вверх и вниз для облегчения отслойки клеток. Внимательно следите за отслоением клеток с помощью инвертированного микроскопа. После отделения клеток следует остановить активность трипсина, добавив 50 мкл среды для культивирования клеток в каждый цилиндр.
5. Немедленно перенесите 100 мкл клеточной суспензии в среду в одну лунку 24-луночного планшета.
   Примечание: В данном случае выращивание клона было продолжено с помощью селективного антибиотика в концентрации 0,5 г/мл.
6. Следите за ростом клеточных клонов в 24-луночном планшете, и когда они достигнут 90% конфлюенции, перенесите их в шестилуночный планшет. Следуйте инструкциям в разделе 1 протокола; изменяют только объемы трипсина (0,5 мл) и останавливающего средства (1,5 мл).
7. Наблюдайте за ростом клеточных клонов в шестилуночном планшете, и когда они достигнут слияния, перенесите их в колбу для клеточных культур T12.5.
8. Наблюдайте за клонами клеток в колбе для клеточных культур T12.5, а когда они достигают слияния, субкультивируйте и подсчитывайте их с помощью подходящего метода, например, с помощью автоматического клеточного счетчика или гемоцитометра. Заморозьте половину клеток в среде, содержащей 70% полной среды с селективным антибиотиком, 20% (v/v) FBS и 10% (v/v) ДМСО. Остальные клетки засейте на покровные стекла (12 мм х 12 мм) для иммуноокрашивания и в две лунки шестилуночного планшета для выделения гДНК и получения лизата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае клеточной линии A375 затравливайте 45 000 клеток на покровный лист и 450 000 клеток на лунку шестилуночного планшета.

8. Валидация сгенерированных клонов клеток

1. Иммуноокрашивание
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите иммуноокрашивание клеток для определения уровня экспрессии интересующего белка (POI). Важно одновременно окрашивать клетки дикого типа или контрольные клоны в качестве контроля, чтобы иметь возможность сравнивать уровни экспрессии POI (рис. 2A).
   1. Отсадите и выбросьте среду для культивирования клеток.
   2. Промойте растущие на покровных стеклах ячейки трижды PBS.
   3. Зафиксируйте клетки, добавив в каждую лунку по 0,5 мл 4% раствора формальдегида и инкубируйте их в течение 20 минут при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для разных антител могут потребоваться разные методы фиксации.
   4. Дважды промойте клетки PBS.
   5. Для проникновения клеток инкубируйте покровные стекла в 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для разных антител могут потребоваться разные методы пермеабилизации.
   6. Дважды постирайте покровные стекла с помощью PBS.
   7. Поместите покровные стекла в камеру окрашивания⁹.
   8. Инкубируйте покровные стекла в 1% (масс./об.) BSA в 0,1% (v/v) Triton X-100 в растворе PBS в течение 30 минут при ЛТ, чтобы избежать неспецифического связывания антител.
   9. Удалите раствор, поместив покровный лист краем на кусок лигнина с помощью иглы и пинцета.
   10. Приготовьте окрашивающий раствор, состоящий из первичных антител в 1% (w/v) BSA и 0,1% (v/v) Triton X-100 в PBS. Капните по 30 мкл раствора на каждую покровную крышку и инкубируйте их в течение 24 ч при 4 °C в камере влажной влажности.
       Примечание: В этом эксперименте использовали мышиные антитела к GSN в разведении 1:200.
   11. Удалите раствор, поместив покровные стекла краем на кусочек лигнина с помощью иглы и пинцета. Поместите покровные стекла в 24-луночную пластину.
   12. Промойте покровные стекла три раза с PBS в течение 5 минут при температуре RT.
   13. Готовьте вторичные антитела и красители в 1% (w/v) BSA и 0,1% (v/v) Triton X-100 в растворе PBS. Капните по 30 мкл раствора на каждую покровную крышку и инкубируйте их в течение 1 ч при RT в темноте.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меченые против мышей флуоресцентные вторичные антитела 488 в разведении 1:200. Для обнаружения F-актина и клеточных ядер мы использовали фаллоидин-Alexa Fluor 568 в разведении 1:200 и Hoechst 33342 в разведении 1:1000.
   14. Удалите раствор, поместив покровные стекла краем на кусочек лигнина с помощью иглы и пинцета. Поместите покровные стекла в 24-луночную пластину.
   15. Покровные стекла трижды постирать с PBS в течение 5 минут при температуре RT в темноте.
   16. Промойте покровные стекла один раз деионизированной водой.
   17. Закрепите покровные стекла с помощью монтажного носителя на стекле микроскопа.
   18. Визуализируйте окрашивание клеток с помощью конфокального микроскопа, чтобы установить уровень POI, экспрессируемого в производных клонах (рис. 2A).
2. Анализ вестерн-блоттинга
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить отсутствие, повышенный уровень или пониженный уровень экспрессии POI у производных клонов, проведите вестерн-блоттинг в стандартных условиях¹⁰. Анализируйте одновременно клетки дикого типа или контрольные клоны (рисунки 2B, C).
   1. Промойте клетки, растущие в лунке шестилуночного планшета, три раза PBS.
   2. Соберите ячейки с помощью скребка в буфер по выбору и осторожно перемешайте в течение 20 с. Выполните три цикла замораживания (при -80 °C) и размораживания (при 4 °C) образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте либо цитоскелетно-связанный белковый экстракционный буфер [10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1 мМ этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 1 мМ NaF, 20 мМ Na₄P₂O₇, 2 мМ Na₃VO₄, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) глицерин, 0,1% (w/v) SDS, 0,5% дезоксихолата натрия] или буфер мочевины [50 мМ TRIS-HCl pH 7, 5% (w/v) SDS, 8,6% (w/v) сахарозы, 74 мМ мочевины, 1 mM DTT], оба с добавлением коктейля ингибиторов протеазы 1:100, ингибитора серинфосфатазы 1:100 и ингибитора тирозинфосфатазы 1:100.
   3. Центрифугируйте лизаты при давлении 12 000 x g в течение 5 мин при 4 °C.
   4. Определите концентрацию белка в образцах (например, с помощью анализа BCA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ зависит от совместимости с буферным составом.
   5. Для проведения вестерн-блоттинга образцов необходимо загрузить по 30 г белка в каждую лунку на полиакриламидный гель (7%-15%).
   6. Проведите электрофорез SDS-PAGE и перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану.
   7. Визуализируйте уровень экспрессии POI путем окрашивания мембраны подходящими антителами (рис. 2B, C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использовали мышиные антитела к GSN в разведении 1:2000 и антитела к GAPDH у мышей в разведении 1:200. Подробности см. в наших статьях ^2,11. Время воздействия должно быть достаточным для того, чтобы слабые сигналы не были пропущены (рисунок 2C).
3. Анализ гДНК
   Примечание: После оценки уровня экспрессии POI в полученных клонах с помощью микроскопических методов и методов вестерн-блоттинга, следует проанализировать геномную ДНК. Сравнение длины продукта ПЦР-реакции, полученного на матрице гДНК полученных клонов, дает информацию о том, была ли отредактирована последовательность ГОИ (рис. 2D).
   1. Промойте клетки, растущие в лунке шестилуночного планшета, три раза PBS.
   2. Соберите клетки с помощью скребка в 1 мл PBS.
   3. Центрифугируйте ячейки при давлении 5000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   4. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре -80 °C.
   5. Выделите гДНК из гранул полученных клонов с помощью коммерчески доступного набора для экстракции гДНК.
   6. Разрабатывайте праймеры для ПЦР путем отжига не менее 300.о. до и после мишени гРНК в сайте редактирования генов CRISPR/Cas9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались следующие грунтовки: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
   7. Провести ПЦР-реакции с использованием DNA Polymerase Master Mix в соответствии с инструкцией производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав реакционной смеси для ПЦР приведен в таблице 1, а настройки термоамплификатора для реакции ПЦР представлены в таблице 2.
   8. Анализируйте продукты ПЦР в 1% или 2% (по объему) агарозного геля в буфере Tris-ацетат-ЭДТА (40 мМ Трис pH 8,0, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА).
   9. Сравните длину ампликона продукта ПЦР клонов GSN KO с длиной продукта ПЦР клонов CTRL KO (203.о.; Рисунок 2D).
4. Секвенирование гДНК
   1. Проектируйте праймеры для ПЦР путем отжига до и после последовательностей, распознаваемых гРНК, кодируемыми плазмидами CRISPR/Cas9(D10A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки для проектирования следующие: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattgaattgaacagtgcagacctg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
   2. Проводят ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы (такой анализ требует высокой точности при амплификации ДНК) и гДНК в качестве матрицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав реакционной смеси для ПЦР приведен в таблице 3, а настройки термоамплификатора для реакции ПЦР представлены в таблице 4.
   3. Линеаризируйте плазмиду с помощью фермента рестрикции в нескольких сайтах клонирования путем инкубации в течение 1 ч при 37°C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав смеси реакции рестрикционного сбраживания приведен в таблице 5. При этом не имеет значения, какая плазмида используется. pACGFP-C1 линеаризовали ферментом EcoRI.
   4. Оценивают концентрацию вставок и разрезаемой плазмиды методом электрофореза в агарозном геле.
   5. Подготовьте реакции сборки ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать традиционный метод клонирования или любой другой метод.
   6. Трансформируйте компетентные бактерии (например, с помощью процедуры теплового шока)¹².
   7. Выделите плазмиды (например, из шести колоний бактерий на конструкцию в соответствии с инструкциями производителя или процитированным протоколом)¹³.
   8. Проверьте, была ли вставка успешно клонирована в плазмиду и подходит ли ее длина, с помощью рестрикции, расщепления и электрофореза ДНК.
      Примечание: Если выбранные колонии не содержат плазмиды со вставкой, плазмиды должны быть выделены из последующих бактериальных колоний.
   9. Подтвердите редактирование генов с помощью секвенирования плазмид (рис. 3).
      Примечание: Необходимо получить по крайней мере два различных результата секвенирования ДНК для каждого полученного клеточного клона из-за существования двух аллелей генов. Для мультиплоидных клеточных линий (более 2 n) необходимо секвенировать большее количество плазмид, чтобы получить последовательность всех полученных копий генов в клетке. Изолируйте столько колоний, сколько необходимо, до тех пор, пока не будут выделены плазмиды с клонированными последовательностями всех копий гена. Для оценки количества локусов изучаемого гена можно использовать коммерчески доступный набор.
   10. Сравните последовательности гДНК, полученные для клонов GSN KO и CTRL KO с помощью программы множественного выравнивания последовательностей (рис. 3).

Таблица 1. Состав реакционной смеси ПЦР.

Таблица 2. Настройки термоамплификатора для проведения ПЦР-реакции.

Таблица 3. Состав реакционной смеси ПЦР.

Таблица 4. Настройки термоамплификатора для проведения ПЦР-реакции.

Таблица 5. Состав реакционной смеси реакции рестрикции рестрикции.

9. Оценка фенотипической гетерогенности клеточной линии

1. Проведите иммуноокрашивание клеток для определения уровня экспрессии POI.
2. Делайте фотографии без увеличения с помощью 60-кратного масляного иммерсионного объектива в конфокальном микроскопе.
3. Чтобы установить соотношение распределения клеток с разными уровнями, используйте инструмент «передержка/недодержка», который обычно доступен в большинстве программ анализа микроскопических изображений. Рассматривайте клетки, которые показывают недоэкспонированные участки, как производящие POI на низком уровне. Классифицируйте переэкспонированные клетки как клетки с высоким уровнем экспрессии POI, а остальные клетки как клетки, экспрессирующие POI на среднем уровне.

Используя представленный протокол, мы подробно демонстрируем выделение стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы методом стеклянного цилиндра (рис. 1А). Наши исследования относятся к клеточной биологии меланомы, и наиболее распространенно?...

Мы привели подробное описание выделения стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы стеклянными цилиндрами. Получение контрольных клонов важно при получении клонов с измененной экспрессией генов, поскольку результаты, полученные для клонов целевой модифик...

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Эта работа была поддержана Национальным центром науки, Польша (проект #2016/22/E/NZ3/00654, предоставлен AJM).