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Method Article
Se describe un protocolo para aislar clones de células de melanoma transfectadas de forma estable mediante cilindros de vidrio. Nos centramos en consejos prácticos que pueden ser decisivos para el éxito de todo el procedimiento.
Las poblaciones celulares que tienen cambios estables en su información genómica son ampliamente utilizadas por los científicos como modelo de investigación. No requieren transfección celular repetida, ya que puede conducir a una población celular heterogénea y una eficiencia de transfección variable, lo que afecta la reproducibilidad. Además, son preferibles para análisis a gran escala. La generación de clones de células estables es útil para una amplia gama de aplicaciones, como la investigación sobre las funciones de los genes y la producción de proteínas recombinantes. Existen algunos métodos para obtener una población celular homogénea en la transfección transitoria inicial. Aquí, describimos el aislamiento de clones de una sola célula con cilindros de vidrio. Aunque este método se conoce desde hace algún tiempo, hay algunos pasos cruciales y descuidarlos puede llevar al fracaso. Hemos utilizado con éxito este método para obtener clones sobreexpresados de forma estable una proteína de interés (POI) o con knockout de un gen de interés (GOI). Describimos los pasos de preparación, como la optimización de la selección de las concentraciones del fármaco, la preparación de los cilindros de vidrio y la validación de si los clones obtenidos tienen el cambio deseado en la expresión del GOI mediante PCR, análisis de Western blot, inmunotinción o secuenciación de ADNg (dependiendo del tipo de clones derivados). También discutimos la heterogeneidad fenotípica de las líneas celulares bien establecidas, ya que esto podría ser un problema para obtener clones de células estables.
La transfección estable de células de mamíferos es un método utilizado de forma rutinaria en varias aplicaciones de cultivo celular, incluida la investigación del cáncer. Su ventaja sobre la transfección transitoria es que el material genético extraño introducido no puede perderse debido a factores ambientales (por ejemplo, confluencia celular o etapa de replicación) y la división celular porque está integrado en el genoma del huésped1. El desarrollo de líneas celulares que se expresen de manera estable puede ser laborioso y desafiante, pero si se requiere una expresión sostenida de genes durante un período prolongado, la derivación de líneas celulares estables es una opción preferida. El objetivo más común de la transfección es estudiar las funciones de un gen específico o producto génico mediante la sobreproducción o la regulación a la baja de su expresión. Sin embargo, la producción de proteínas recombinantes y terapias genéticas también requiere la introducción de material genético extraño en la célula2.
Un clon se define como una población celular derivada de una célula individual. El aislamiento de clones unicelulares es un aspecto crucial de la biología celular cuando se estudian células con variabilidad genotípica y fenotípica. Se utilizan tres técnicas principales para derivar clones de células: la técnica de dilución, la técnica de anillo de clonación3 y la técnica de clasificación de células4. Cada uno tiene ventajas y desventajas. Proporcionamos una descripción detallada de un método para aislar clones de células de melanoma utilizando la técnica del cilindro de vidrio. La ventaja de este método es que las células exhiben un crecimiento clonal moderado de cultivos celulares con baja densidad. Además, las células seleccionadas ya han demostrado capacidad de proliferación porque ya han formado colonias5. Este procedimiento consiste en sembrar células transfectadas escasamente, pero sin limitar la dilución, en un recipiente grande y permitir que se expandan y formen colonias durante 2-3 semanas en presencia de un antibiótico selectivo. A continuación, las colonias individuales se pueden aislar utilizando cilindros de vidrio que se colocan sobre las colonias y se adhieren al recipiente con grasa de silicona. A continuación, las células se separan con tripsina y luego se transfieren a placas de pocillos múltiples para su posterior cultivo en presencia de un medio selectivo.
Hay una serie de estudios que describen el aislamiento de clones, pero nos centramos en mostrar detalles como el tamaño que deben tener los clones después de 2 semanas de selección, cómo marcar la ubicación de los clones durante su aislamiento y cómo elegir una concentración adecuada de antibiótico para la selección. Nos centramos en consejos prácticos que pueden ser decisivos para el éxito de todo el procedimiento. El protocolo presentado nos permite obtener clones de células estables en un plazo de 2 a 4 semanas. El método es fácil y barato y no requiere equipos complicados. Compartimos una técnica que nos ha permitido obtener muchos modelos de investigación, entre ellos los clones GSN KO 6,7,8.
1. Subcultivo celular y siembra para la optimización de la concentración de fármacos
2. Optimización de la concentración de fármaco seleccionado
3. Siembra y transfección de células
4. Generación de clones celulares
5. Elección de los clones para el aislamiento
6. Preparación de cilindros de vidrio
7. Aislamiento de clones
8. Validación de los clones de células generadas
Reactivos | Volumen |
Mezcla maestra de ADN polimerasa | 7,5 μl |
Cebador delantero (10 μM) | 1,5 μl |
Imprimación inversa (10 μM) | 1,5 μl |
Agua estéril | 3,5 μl |
ADNg | 1 μl que contiene 10 ng de ADNg |
Tabla 1. Composición de la mezcla de reacción PCR.
Pasos | Temperatura [°C] | Tiempo [minutos: segundos] |
1 | 95 | 04:00 |
2 | 95 | 00:30 |
3 | 57 | 00:30 |
4 | 72 | 00:45 |
5 | Ir a 2, 35x | X |
6 | 72 | 10:00 |
7 | 8 | ∞ |
Tabla 2. Ajustes del termociclador para la reacción PCR.
Reactivos | Volumen |
5 x Tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad | 4 μl |
dNTPs (10 mM) | 0,4 μl |
Cebador delantero (10 μM) | 1 μl |
Imprimación inversa (10 μM) | 1 μl |
Agua estéril | 12,4 μl |
ADNg | 1 μl que contiene 10 ng de ADNg |
ADN polimerasa de alta fidelidad | 0,2 μl |
Tabla 3. Composición de la mezcla de reacción PCR.
Pasos | Temperatura [°C] | Tiempo [minutos: segundos] |
1 | 98 | 00:30 |
2 | 98 | 00:30 |
3 | 61 | 00:30 |
4 | 72 | 01:00 |
5 | Vaya al paso 2, 35 veces | X |
6 | 72 | 10:00 |
7 | 8 | ∞ |
Tabla 4. Ajustes del termociclador para la reacción PCR.
Reactivos | Importe |
10 x búfer | 3 μl |
Enzima de restricción | 1 μl |
Agua estéril | 20,7 μl |
Plásmido | 5,3 μl que contiene 5 μg de ADN |
Tabla 5. Composición de la mezcla de reacción de digestión de restricción.
9. Evaluar la heterogeneidad fenotípica de la línea celular
Utilizando el protocolo presentado, proporcionamos una demostración detallada del aislamiento de clones de células de melanoma transfectadas de manera estable con el método del cilindro de vidrio (Figura 1A). Nuestros estudios se relacionan con la biología celular del melanoma, y el modelo de investigación más común que utilizamos es la línea de melanoma Adherente y altamente invasiva A375. Dado que nuestra investigación ha demostrado que las célul...
Hemos proporcionado una descripción detallada del aislamiento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estable con cilindros de vidrio. Es importante obtener clones de control cuando se derivan clones con expresión modificada de genes, ya que los resultados obtenidos para los clones de modificación dirigida siempre deben compararse con los resultados obtenidos para los controles. De esta forma, podemos comprobar si la propia transfección o el cultivo con un antibióti...
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para la Ciencia, Polonia (proyecto #2016/22/E/NZ3/00654, otorgado a AJM).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 ml centrifuge tube | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
150 mm cell culturedish with 20 mm grid | Falcon | 353025 | |
24-wells plate | VWR International | 10062-896 | |
35 mm culture dish | Eppendorf | EP0030700112 | |
6-well plate | Eppendorf | EP0030700113 | |
96-well plate | VWR International | 10062-900 | |
Acetic acid, 80% solution | Chempur | 115687330 | |
Agarose | Prona-Abo | BLE500 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
anti-GAPDH antibodies | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
anti-GSN antibodies - clone C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
anti-GSN antibodies - clone GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
Control Double Nickase Plasmid | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
Coverslips | bionovo | 16283 | |
Dako Mounting medium | Clontech | S3023 | |
DMSO - Dimethyl sulfoxide | applichem | A3672,0250 | |
DNA Purification Kit | EurX | 3555-02 | |
donkey anti- mouse-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
DTT - 1,4-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E0396 | |
FBS - Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
Gelsolin CRISPR Plasmids | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium with reduced concentration (1.5 g/l) of NaHCO3 | Polish Academy of Science,Wroc![]() | 11-500 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Lignin | Bionovo | B-0521 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000-008 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
NEBuilder Assembly Tool | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
pACGFP-C1 | Clontech | ||
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Perfect 100 bp DNA ladder | EurX | E3134 | |
phalloidin-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
puromycin | InviviGen | ant-pr | |
SDS - sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L4509 | |
silicone | CX80 Polska | ||
Sodium chloride - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
sucrose | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
the glass cylinders | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
Tissue Culture Flask 25mL | VWR International | 10062-868 | |
Tissue-culture 75 cm2 flask | VWR | 10062-872 | |
Trisma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
trypsin | Polish Academy of Science,Wroc![]() | 20-500 | |
urea | Sigma-Aldrich | 8656 | |
xylene solution | Chempur | 115208603 |
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