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이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 세포외 소포체(ADEV)의 농축을 설명합니다. 이는 폴리머 침전에 의한 EV의 분리를 기반으로 하며, ADEV의 ACSA-1 기반 면역 캡처를 기반으로 합니다. ADEV의 분석은 액체 생검에 의해 비침습적으로 살아있는 환자의 염증 경로 변화를 연구할 수 있는 단서를 제공할 수 있습니다.
세포외 소포체(EV)는 세포 통신 및 폐기물 제거를 위해 모든 세포에서 분비되는 생물학적 나노 입자입니다. 그들은 생리학적, 병리학적 조건에서 다른 세포에 작용하고 화물을 다른 세포로 이동시킴으로써 광범위한 기능에 참여합니다. EV는 생체 유체에 존재한다는 점을 감안할 때 질병 과정을 연구하기 위한 훌륭한 자원이며 바이오마커 발견을 위한 액체 생검으로 간주될 수 있습니다. EV 분석의 매력적인 측면은 기원 세포의 마커를 기반으로 선택할 수 있으므로 화물에 있는 특정 조직의 환경을 반영할 수 있다는 것입니다. 그러나 EV 절연 방법과 관련된 주요 단점 중 하나는 방법론적 합의와 표준화된 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 성상세포(astrocyte)는 뇌에서 필수적인 역할을 하는 신경교세포(glial cell)입니다. 신경퇴행성 질환에서 성상세포 반응은 EV 화물 및 비정상적인 세포 통신을 변경하여 질병 진행을 촉진/향상시킬 수 있습니다. 따라서 성상교세포 EV의 분석은 바이오마커 및 잠재적인 질병 표적의 발견으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 EV(ADEV)를 농축하는 2단계 방법을 설명합니다. 첫째, EV는 폴리머 기반 침전을 통해 제세된 플라즈마에서 농축됩니다. 그 다음에는 자기 마이크로 비드를 사용한 ACSA-1 기반 면역 캡처를 통해 ADEV를 농축하며, 여기서 재현탁된 EV는 자기장에 배치된 기둥에 적재됩니다. 자기 라벨링된 ACSA-1+ EV는 컬럼 내에 유지되고 다른 EV는 통과합니다. 자석에서 컬럼이 제거되면 ADEV가 용리되어 저장 및 분석할 준비가 됩니다. 성상세포 마커의 농축을 검증하기 위해 신경교세포섬유산단백질(GFAP) 또는 세포 내 기원의 기타 특정 성상세포 마커를 용리액에서 측정하고 플로우 스루(flow-through)와 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜은 성상세포 관련 마커를 검사하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있는 혈장에서 ADEV를 농축하는 쉽고 시간 효율적인 방법을 제안합니다.
세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막질 나노입자의 이질적인 그룹으로, 단백질, 지질 및 핵산을 운반합니다1. 미세소포체(100-1000 nm), 엑소좀(30-100 nm) 및 자가사멸체(1000-5000 nm)가 주요 EV 유형을 구성하며, 원산지 2,3에 따라 구별됩니다. EV는 항원 제시 및 면역 반응4, 수용체 재생, 대사 산물 제거5,세포 소통6과 같은 중요한 생리적 과정을 조절합니다. 이러한 과정의 조절은 EV 세포막에 풍부한 단백질과 수용 세포의 표적 사이의 직접 결합 및/또는 수용 세포의 세포질에서 화물의 내재화 및 방출을 통해 발생할 수 있습니다7. EV는 필수적인 세포 기능을 수행하지만 암 및 신경학 분야에서 병리학적 관점에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 실제로, 여러 연구에 따르면 EV는 종양 세포 이동을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다 8,9 또는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에서 종자 독성 단백질 응집체10,11.
EV는 기원 세포와 관련된 세포 표면 마커를 기반으로 생체 유체에서 선택하고 농축할 수 있으므로 화물에 있는 특정 조직의 환경을 반영합니다 12,13,14,15,16,17,18,19,20. 또한 혈액, 뇌척수액(CSF), 타액, 소변 및 모유에 존재한다는 점을 감안할 때 EV는 진단을 위한 탁월한 비침습적 도구이며 바이오마커 발견을 위한 액체 생검으로 간주될 수 있습니다. 이것은 CSF 이외의 접근 가능한 유체에서 뇌 분석물을 연구하는 어려움이 있다는 점을 감안할 때 신경학에서 특별한 관심을 끌고 있습니다.
성상세포(astrocyte)는 신경-혈관 소통(neuro-vascular communication)의 교차점에 있기 때문에 점점 더 많은 관심을 받고 있다21. 생리학적 조건 하에서, 그들은 혈액-뇌 장벽의 보존, 신경 전달 물질의 재활용, 뉴런 및 기타 신경교세포에 대한 영양분 및 성장 인자의 공급을 담당합니다 22,23,24 뿐만 아니라 전염증 상태에서 항염증 상태로 또는 그 반대로 신진대사 가소성을 감안할 때 신경 면역 방어 25,26,27. 성상세포가 조절 기능을 수행하는 중요한 메커니즘은 EV를 통한 의사소통입니다28,29. 반응성 성상세포작용은 알츠하이머병,30 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상마비(PSP)31 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)32과 같은 여러 신경퇴행성 질환의 주요 특징입니다. 성상세포 반응성은 전기차 화물의 변화, 염증 매개체의 방출 및 비정상적인 세포 통신을 유발할 수 있으며, 따라서 병리학의 확산을 촉진하고 신경 퇴행을 유발할 수 있습니다10,11. 따라서 성상세포 유래 EV(ADEV)와 그 화물의 변화를 연구하는 것은 비침습적 방식으로 신경퇴행성 과정을 조사할 수 있는 매력적인 자원입니다.
현재 EV의 격리를 위한 여러 방법론이 존재하며, 각 방법론에는 해당 장점과 단점이 있습니다33. 관심의 최종 응용 프로그램에 따라 특정 용도에 더 적합한 방법을 고려하는 것이 중요합니다. 신경학 분야에서, 더 구체적으로 말하자면, 성상세포 연구에서는 고분자 기반 침전 후 면역 캡처가 주로 사용되는 방법이었습니다 12,18,19,20,34. 그러나 동일한 접근 방식을 적용하더라도 EV 분리에 적용된 여러 단계의 연구 간에 이질성이 남아 있습니다. 따라서 성상교세포 EV 연구를 촉진하고 재현성을 연구하기 위해 명확하고 단계적으로 표준화된 방법론이 필요합니다. 폴리머 기반 침전은 복잡한 장비가 필요하지 않은 빠르고 간단한 절차라는 점을 감안할 때 바이오마커 스크리닝을 용이하게 하여 생물학적 활성에 영향을 주지 않고 EV의 높은 수율로 이어집니다35.
본 프로토콜은 인간 혈장에서 ADEV를 농축하기 위한 상세하고 간단한 2단계 방법을 설명합니다. 이는 총 EV 분획의 폴리머 기반 침전을 기반으로 한 후 성상교세포 EV의 면역 캡처를 기반으로 합니다. 성상세포의 중요한 기능을 감안할 때, ADEV 분석은 비침습적 방식으로 연구할 수 있는 바이오마커 및 뇌 염증 경로의 발견에 빛을 비출 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명된 연구는 스페인 바르셀로나에 있는 Sant Pau Initiative on Neurodegeneration(SPIN) 코호트의 남녀 건강한 성인 기증자(연령 범위 65.9-81.3세, 여성 45.5%)의 인간 혈장 샘플로 수행되었습니다. 참가자들은 정보에 입각한 동의를 했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언과 스페인 법에 포함된 의학 연구에 대한 국제 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 산트 파우 연구 윤리 위원회(Sant Pau Research Ethics Committee, CEIC)는 SPIN 코호트(#16/2013)에서 인간 혈장 샘플의 수집 및 보관을 위한 프로토콜을 검토하고 승인했습니다.
1. 인간 플라즈마에서 성상세포 EV의 농축
참고: 이 프로토콜에는 인간 혈장 샘플의 사용이 포함됩니다. 이 프로토콜에 사용된 시약 및 실험실 재료에 대한 모든 세부 정보는 재료 표에 포함되어 있습니다. 이 절차에는 특별한 장비가 필요하지 않지만, 각 제조업체에서 개별적으로 지정한 대로 각 시약의 안전성 고려 사항을 검토하십시오.
그림 1: 성상교세포 유래 EV의 농축을 위한 2단계 절차의 개략도 . 첫 번째 단계에서 EV는 폴리머 기반 침전 및 원심분리 단계를 통해 제세된 인간 플라즈마에서 농축됩니다. 전체 EV 재현탁 후, 비오틴화 항 GLAST(ACSA-1) 항체 및 항비오틴 자성 마이크로비드를 사용한 면역 캡처로 성상세포 EV를 선택합니다. 약어: ACSA-1 = 성상세포 세포 표면 항원-1; ADEVs = 성상세포 유래 세포외 소포체; DPBS = Dulbecco의 인산염 완충 식염수; EVs = 세포외 소포체; GLAST = 글루타메이트-아스파르테이트 수송체; ADEV 없음 = 비성상세포 세포외 소포체; EVs 없음 = 세포외 소포체 없음(EV-고갈 혈장); PIC = 프로테아제 억제제 칵테일; RT = 실온. BioRender로 만든 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 프로토콜 검증
3. 데이터 분석
건강한 기증자로부터 채취한 혈장에서 ADEV를 분리하는 작업이 성공적으로 이루어졌습니다. 총 EV 분획을 얻기 위해 폴리머 기반 침전 방법을 사용한 다음 자기 마이크로비드를 사용한 면역 캡처를 수행하여 ADEV를 얻었습니다.
면역 포획 단계 전 총 EV 분획에 대한 웨스턴 블롯 분석은 EV 제제에 칼넥신(calnexin, 세포 오염 마커)이 부족하고 알릭스(Alix)와 막관통 단백질 CD9가 존재하는 것을 나타냈습니다(그림 2A).
면역포획 후, 수포 및 성상세포 마커의 존재 및 농축이 ADEV 분획에서 검증되었습니다. GFAP 농도는 ADEV가 없는 분획(플로우 스루)에 비해 ADEV에서 유의하게 높았으며, 6배 농축(p = 0.008)을 보여주었습니다. 이는 ADEV 분획에서 EV의 우세한 성상세포 기원을 확인합니다(그림 2B). 10개의 동일한 샘플에서 ADEV 제제에 대한 GFAP 정량화의 CV는 25%였습니다.
ADEV 제제에서 소포 마커의 존재를 확인하기 위해 두 가지 마커, 즉 고전적인 세포질 소포 마커42인 Alix와 막관통 단백질 CD8144를 검사했습니다. 알릭스 수치는 자유 플라즈마(p = 0.001)와 EV 고갈 플라즈마(no EVs, p = 0.0007; 그림 2C). ADEV는 또한 유리 혈장에 비해 CD81의 농축을 보여주었습니다(p = 0.03; 그림 2D).
ADEV 개체군을 추가로 특성화하기 위해 NTA로 크기 및 개수 프로파일을 분석하고 Cryo-EM으로 형태학을 분석했습니다. NTA 분석은 평균 크기가 93.7nm에서 2.7nm인 EV의 균질한 프로파일을 보여주었으며, 이는 소형 EV(마이크로베± 및 엑소좀)의 크기와 일치합니다. 또한 Cryo-EM에 의한 특성 분석을 통해 EV의 존재 및 예상 형태를 추가로 확인했습니다(그림 2E).
지단백질이 EV와 함께 침전될 수 있다는 점을 감안할 때, ApoB의 수준은 서로 다른 분획에 걸쳐 분석되었습니다. 결과는 면역포획 단계 후 ADEV 제제에서 ApoB 수치가 최소한이고 혈장에서 더 높다는 것을 보여줍니다(p = 0.005; 그림 2F).
그림 2: 전체 EV 및 ADEV 분획의 특성화.(A) 총 EV 제제에서 칼넥신이 부족하고 Alix 및 CD9가 존재함을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯. (B) ADEV 분획은 ADEV가 없는 경우와 비교하여 GFAP 수치가 증가한 것으로 나타났습니다(ADEV, n = 7; ADEV 없음, n = 7; p = 0.008). (씨) ADEV에서 플라즈마(p = 0.001) 및 EV가 없는 경우(p = 0.0007)에 비해 더 높은 수준의 Alix가 검출되었습니다. 혈장 : n = 6; EV 없음: n = 6; ADEVS: n = 16. (D) 플라즈마에 비해 ADEV 분획에서 더 높은 수준의 CD81이 검출되었습니다(p = 0.003). 혈장 : n = 5; EV 없음: n = 1 (CD81은 9개의 No EV 샘플 중 8개에서 검출되지 않음); ADEVS: n = 17. (E) NTA 분석에서 중간 크기가 93.7 ± 2.7 nm인 입자의 존재가 밝혀졌으며 그 소포 특성은 Cryo-EM에 의해 확인되었습니다. (에프) ApoB는 플라즈마에 비해 ADEV 분율에서 유의하게 낮았습니다(p = 0.005). 플라즈마 : n = 4; 전기차: n = 4; ADEVS: n = 4. 약어: ADEVs = 성상세포 유래 세포외 소포체; 알릭스 = 프로그램된 세포 사멸 6 상호 작용 단백질(PDCD6IP); ApoB = 아포지단백 B; EVs = 폴리머 기반 침전 후 총 세포외 소포 제제; GFAP = 신경교섬유산성 단백질; ADEV 없음 = 비성상세포 세포외 소포체; EVs 없음 = 세포외 소포체 없음(EV-고갈된 혈장). (B)의 경우 양측 Mann Whitney 검정(**p < 0.01)이 사용되었고 (C,D,F)의 경우 Kluskal-Wallis와 Dunn의 다중 비교 검정(*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.0001)이 사용되었습니다. 그래프는 평균을 보여주고 오차 막대는 표준 오차를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, 이 프로토콜의 적용 가능성은 ADEV를 사용하여 염증 마커를 정량화하여 조사되었습니다. 패널에 있는 25개의 염증성 사이토카인은 모두 건강한 기증자로부터 얻은 ADEV에서 검출될 수 있었습니다(그림 3).
그림 3. ADEV 분획에서 염증성 사이토카인의 정량화. 건강한 기증자의 ADEV에 포함된 25개의 염증성 사이토카인으로 구성된 패널은 모두 검출 가능하고 차등적으로 발현되는 것으로 나타났습니다(HC, n = 3). 그래프는 평균을 보여주고 오차 막대는 표준 오류를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
EV는 진단 및 치료 가능성으로 인해 생물 의학 연구에 대한 큰 관심을 얻고 있습니다. 현재 EV 격리 방법과 관련된 주요 단점 중 하나는 방법론적 합의와 표준화된 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 이 연구는 폴리머 기반 침전 및 GLAST 면역 캡처 를 통해 인간 혈장에서 성상 세포 EV를 농축하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
EV를 체액에서 분리하기 위한 다양한 방법론이 존재하며, 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 폴리머 기반 접근법은 단순성, 사용 용이성, 시간 소모적이지 않음, 특정 기기가 필요하지 않음, 높은 EV 수율 및 신경학 12,18,19,20의 EV 바이오마커 연구에 널리 사용되어 결과를 비교할 수 있기 때문에 선택되었습니다. 그러나 크기 배제 크로마토그래피와 같은 대체 방법도 테스트할 수 있습니다. 폴리머 기반 방법에 대한 일반적인 비판은 EV와 함께 지단백질의 동시 침전입니다. 그러나 ACSA-1 항체를 사용한 추가 면역포획 단계 및 후속 세척은 ADEV에 선택적으로 결합하여 ApoB 분석에서 볼 수 있듯이 지단백질로 인한 오염을 최소화함으로써 이러한 한계를 극복할 수 있습니다. 정량적 연구를 위해 이 프로토콜을 사용할 때는 특히 작은 샘플 크기의 경우 intra-assay CV를 고려해야 합니다. 이 절차의 또 다른 한계는 최소한의 폴리머 트레이스가 질량 분석법과 같은 특정 다운스트림 분석을 방해할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜과 후속 분석 방법의 조합은 각 특정 용도에 대해 테스트해야 합니다.
이 연구에 설명된 프로토콜은 ADEV 분획에서 성상세포 및 소포 마커의 농축에 대해 검증되었습니다. 성상세포 EV 면역캡처는 GLOW를 표적으로 사용하여 수행되었으며 추가 성상세포 마커인 GFAP의 6배 농축에서 알 수 있듯이 EV의 성상세포 기원을 검증했습니다. 이 절차는 건강한 노인의 인간 혈장에서 ADEV 농축을 위해 테스트되고 최적화되었지만, 프로토콜의 특정 단계는 사용할 다운스트림 애플리케이션에 따라 수정 및 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 펠릿 재현탁을 위한 초순수의 사용은 후속 면역침전을 위해 선호됩니다. 또한 항체 및 마그네틱 비드의 배양 단계(시간 및 농도)를 수정하여 필요에 따라 ADEV를 농축하거나 희석할 수 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계에는 면역 포획 단계 전에 EV 펠릿을 기계적으로 재부유하는 것이 포함됩니다. 펠릿 EV는 매우 조심스럽게 다루어야 하며 재서스펜션 중 거품이 발생하지 않도록 해야 합니다. 또한 혈장에 존재하는 활성 프로테아제를 억제하기 위해 완충액에 3x 농축 프로테아제 억제제를 사용하는 데 주의를 기울여야 합니다. 또한, 컬럼에 남아 있는 ADEV가 용리되기 전에 단계에서 플런저를 컬럼에 밀어 넣지 않는 것이 중요합니다.
알츠하이머병 및 외상성 뇌 손상 환자로부터 ADEV를 분리하기 위해 이 접근법(폴리머 기반 침전 + 면역침전법)을 사용하는 연구가 있지만, 12,20,34 ADEV는 다른 세포 기원(예: 뉴런)의 EV에 대해 연구가 부족하며 더 많은 연구가 필요합니다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 다운증후군(Down syndrome)과 같은 특정 신경퇴행성 질환은 엔도솜 이상 및 EV 분비 증가와 관련이 있습니다 45,46,47. 더 높은 EV 분비를 설명하는 한 가지 방법은 이 연구에서 수행된 것처럼 Alix 및 CD81과 같은 EV 마커 또는 CD63 또는 CD9와 같은 다른 테트라스파닌의 수준을 정량화하여 관심 분석물의 수준을 정규화하는 것입니다. 성상세포(astrocytic) 및 전기(EV) 마커의 풍부성을 검증하는 것 외에도, ADEV에서 염증성 사이토카인을 측정하기 위한 프로토콜의 유용성을 테스트했습니다. 멀티플렉스 플랫폼을 사용하여 ADEV 분획에서 25개의 사이토카인과 케모카인의 검출 가능하고 정량적인 농도를 얻었습니다.
따라서 이 절차를 통해 바이오마커 발견 플랫폼으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 성상세포 관련 분자 메커니즘 및 경로 연구를 위한 비침습적 도구로 사용할 수 있는 EV를 수집할 수 있습니다. 실제로 ADEV 연구는 ADEV 화물이 성상세포 표현형과 다양한 질병 단계에 따른 변화를 탐구하는 자원으로 사용될 수 있기 때문에 신경 질환 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
이 원고는 방법론을 광범위하게 설명하고 있지만, 이 방법의 장점과 한계 및 적절한 적용 가능성을 고려하는 것이 중요합니다. 실제로, 국제세포외소포학회(International Society for Extracellular Vesicles48)의 MISEV 가이드라인에 요약된 광범위한 연구 권장 사항 및 검증 단계, EV 연구49에 대한 방법론적 정보 보고를 위한 EV 트랙 플랫폼과 같은 EV 분야에서는 중요한 표준화 노력이 있습니다.
Belbin 박사는 제출된 연구 외에 ADx NeuroSciences로부터 개인 수수료를 받았다고 보고했습니다. Alcolea 박사는 제출된 논문 외에 Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. 및 Esteve로부터 자문 위원회 서비스에 대한 개인 회비를 받았다고 보고했습니다. Lleó 박사는 제출된 연구 외에도 Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols 및 Nutricia의 컨설턴트 또는 자문 위원회에서 활동했습니다. Fortea 박사는 제출된 논문 외에 AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio 및 Biogen으로부터 자문 위원회, 심사 위원회 또는 연사 명예 봉사에 대한 개인 수수료를 받았다고 보고했습니다. Alcolea, Belbin, LLeó 및 Fortea 박사는 신경퇴행성 질환의 시냅토병증 마커에 대한 특허를 보유하고 있다고 보고합니다(ADx, EPI8382175.0 라이선스). 다른 공개는 보고되지 않았습니다. 다른 모든 저자는 더 이상 공개할 것이 없습니다.
저자는 시료 취급 및 준비를 위해 Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi 및 Oriol Sanchez Lopez의 도움을 받은 것에 감사를 표합니다. 또한 바르셀로나 재료 과학 연구소(Barcelona Materials Science Institute)의 ICTS "NANBIOSIS", unit 6(Unit of CIBER in Bioingineering, Biomaterials & Nanomedicine)의 José Amable Bernabé, Universitat Autonoma de Barcelona의 전자 현미경 유닛의 Marti de Cabo Jaume, Sant Pau Biomedical Research Institute(IIB-Sant Pau)의 유세포 분석 플랫폼의 Marta Soler Castany 박사와 Lia Ros Blanco의 협력에 감사드립니다. IIB-Sant Pau의 지질 관련 질환 병태생리학 그룹의 Joan Carles Escolà-Gil 박사가 각각 NTA, cryo-EM, Luminex 및 ApoB 측정에 도움을 주었습니다.
저자는 Jérôme Lejeune Foundation(프로젝트 #1941 및 #1913을 MFI 및 MCI), Instituto de Salud Carlos III(PI20/01473을 JF로, PI20/01330을 AL로, PI18/00435를 DA로, INT19/00016을 DA로), National Institute of Health(1R01AG056850-01A1, R21AG056974 및 R01AG061566에서 JF), Alzheimer's Association 및 Global Brain Health Institute(GBHI_ALZ-18-543740에서 MCI)의 재정적 지원을 인정합니다. 전두측두엽 퇴행 협회(The Association for Frontotemporal Degeneration, Clinical Research Postdoctoral Fellowship, AFTD 2019–2021)에서 ODI, 카탈로니아 신경학 협회(Societat Catalana de Neurologia, Premi Beca Fundació SCN 2020에서 MCI). 이 작업은 CIBERNED 프로그램(프로그램 1, 알츠하이머병에서 AL까지 및 SIGNAL 연구)의 지원도 받았습니다. SS는 Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España)으로부터 박사후 연구원 "Juan de la Cierva-Incorporación"(IJC2019-038962-I)을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Alix primary antibody for Western blotting | EMD Millipore | ABC40 | |
µMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads. |
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
Blocker BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath | Branson | ||
COBAS 6000 autoanalyzer | Roche Diagnostics | Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Digital Micrograph 1.8 | micrograph software | ||
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1) |
Gatan 895 USC 4000 | camera | ||
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system | Syngene | ||
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
Immun-Blot PVDF Membrane | BioRad | 1620177 | |
JEOL 2011 transmission electron microscope | JEOL LTD | Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA) | |
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes | Becton dickinson | 367525 | |
Leica EM GP | Leica Microsystem | commercial plunge freezer | |
Low binding microtubes 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
MACS µ Columns with plungers | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MAGPIX plate reader | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software) |
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA) |
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; 3.4 version | |
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher | 78441 | |
Polypropylene syringe (G29) | PeroxFarma | 1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2" | |
Secondary anti-rabbit antibody | Thermo Fisher | 10794347 | |
Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
Simoa, SR-X instrument | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology | |
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 |
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