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Este protocolo describe el enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de astrocitos (ADEVs) a partir de plasma humano. Se basa en la separación de los EV mediante precipitación de polímeros, seguida de la inmunocaptura de los ADEV basada en ACSA-1. El análisis de los ADEV puede ofrecer pistas para estudiar los cambios en las vías inflamatorias de pacientes vivos, de forma no invasiva mediante biopsia líquida.
Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas biológicas secretadas por todas las células para la comunicación celular y la eliminación de desechos. Participan en una amplia gama de funciones actuando y transfiriendo sus cargas a otras células en condiciones fisiológicas y patológicas. Dada su presencia en biofluidos, las VE representan un excelente recurso para el estudio de los procesos patológicos y pueden considerarse una biopsia líquida para el descubrimiento de biomarcadores. Un aspecto atractivo del análisis de VE es que pueden seleccionarse en función de los marcadores de su célula de origen, reflejando así el entorno de un tejido específico en su carga. Sin embargo, uno de los principales hándicaps relacionados con los métodos de aislamiento de VE es la falta de consensos metodológicos y protocolos estandarizados. Los astrocitos son células gliales con funciones esenciales en el cerebro. En las enfermedades neurodegenerativas, la reactividad de los astrocitos puede conducir a una alteración de la carga de EV y a una comunicación celular aberrante, lo que facilita/mejora la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, el análisis de los VE de los astrocitos puede conducir al descubrimiento de biomarcadores y posibles dianas patológicas. Este protocolo describe un método de 2 pasos para el enriquecimiento de EV derivadas de astrocitos (ADEV) a partir de plasma humano. En primer lugar, los vehículos eléctricos se enriquecen a partir de plasma desfibrilado mediante precipitación basada en polímeros. A esto le sigue el enriquecimiento de los ADEV mediante la inmunocaptura basada en ACSA-1 con microesferas magnéticas, en la que los EV resuspendidos se cargan en una columna colocada en un campo magnético. Los EV ACSA-1+ etiquetados magnéticamente se retienen dentro de la columna, mientras que otros EV fluyen a través de ella. Una vez que se retira la columna del imán, los ADEV se eluyen y están listos para su almacenamiento y análisis. Para validar el enriquecimiento de marcadores de astrocitos, se puede medir la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) u otros marcadores astrocíticos específicos de origen intracelular en el eluido y compararlos con el flujo a través. Este protocolo propone un método fácil y eficiente en el tiempo para enriquecer ADEVs a partir de plasma que se puede utilizar como plataforma para examinar marcadores relevantes para los astrocitos.
Las vesículas extracelulares (VE) son un grupo heterogéneo de nanopartículas membranosas secretadas por todo tipo de células, portadoras de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos1. Las microvesículas (100-1000 nm), los exosomas (30-100 nm) y los cuerpos apoptóticos (1000-5000 nm) constituyen los principales tipos de EV, distinguidos por su sitio de origen 2,3. Las VE regulan procesos fisiológicos importantes, como la presentación de antígenos y las respuestas inmunitarias4, el reciclaje de receptores, la eliminación de metabolitos5 y la comunicación celular6. La regulación de estos procesos puede ocurrir por la unión directa entre proteínas enriquecidas en la membrana de la célula EV y dianas en las células receptoras, y/o a través de la internalización y liberación de su carga en el citoplasma de la célula receptora7. Si bien las VE realizan funciones celulares esenciales, han ganado cada vez más interés desde una perspectiva patológica en los campos del cáncer y la neurología. De hecho, varios estudios han demostrado que los VE pueden ayudar a promover la migración de células tumorales 8,9 o semillas de agregados de proteínas tóxicas en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer10,11.
Los VE pueden seleccionarse y enriquecerse a partir de biofluidos a partir de marcadores de superficie celular relacionados con su célula de origen, reflejando así el entorno de un tejido específico en su carga 12,13,14,15,16,17,18,19,20. Además, dada su presencia en la sangre, el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva, la orina y la leche materna, las VE representan una excelente herramienta no invasiva para el diagnóstico, y pueden considerarse una biopsia líquida para el descubrimiento de biomarcadores. Esto es de especial interés en neurología, dadas las dificultades de estudiar los analitos cerebrales en fluidos accesibles distintos del LCR.
Los astrocitos han ganado un interés creciente, ya que se encuentran en la intersección de la comunicación neurovascular21. En condiciones fisiológicas, son responsables de la preservación de la barrera hematoencefálica, del reciclaje de neurotransmisores, del suministro de nutrientes y factores de crecimiento a las neuronas y otras células gliales 22,23,24, así como de la defensa neuroinmune, dada su plasticidad metabólica de estados proinflamatorios a antiinflamatorios y viceversa 25,26,27. Un mecanismo importante por el cual los astrocitos cumplen sus funciones reguladoras es la comunicación a través de los EV28,29. La astrocitosis reactiva es un sello distintivo clave de varias enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer,30 la atrofia multisistémica (AMS), la parálisis supranuclear progresiva (PSP)31 y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)32. La reactividad de los astrocitos puede conducir a una alteración de la carga de EV, liberación de mediadores inflamatorios y comunicación celular aberrante, facilitando así la propagación de la patología y conduciendo a la neurodegeneración10,11. Por lo tanto, el estudio de los VE derivados de astrocitos (ADEV) y los cambios en su carga es un recurso atractivo para examinar los procesos neurodegenerativos de manera no invasiva.
En la actualidad, existen varias metodologías para el aislamiento de los vehículos eléctricos, cada una con sus correspondientes ventajas y desventajas33. Es fundamental considerar qué método es el más adecuado para un uso específico, en función de la aplicación final de interés. En el campo de la neurología, y más concretamente en los estudios de astrocitos, la precipitación basada en polímeros seguida de inmunocaptura ha sido el método predominantemente utilizado 12,18,19,20,34. Sin embargo, incluso cuando se aplica el mismo enfoque, sigue habiendo heterogeneidad entre los estudios en los diferentes pasos aplicados para el aislamiento de EV. Por lo tanto, existe la necesidad de una metodología estandarizada clara y paso a paso para facilitar los estudios de VE de astrocitos y la reproducibilidad del estudio. La precipitación basada en polímeros facilita el cribado de biomarcadores, ya que se trata de un procedimiento rápido, sencillo y que no requiere de equipos complejos, lo que permite un alto rendimiento de las VE sin afectar a su actividad biológica35.
El presente protocolo describe un método detallado, sencillo y de dos pasos para el enriquecimiento de ADEVs a partir de plasma humano. Se basa en una precipitación basada en polímeros de la fracción total de EV, seguida de una inmunocaptura de VE de astrocitos. Dadas las importantes funciones de los astrocitos, el análisis de los ADEV puede arrojar luz para el descubrimiento de biomarcadores y vías inflamatorias cerebrales que puedan estudiarse de forma no invasiva.
La investigación descrita en este protocolo se ha llevado a cabo con muestras de plasma humano de donantes adultos sanos de ambos sexos (rango de edad 65,9-81,3 años, 45,5% mujeres), de la cohorte de la Iniciativa de Sant Pau en Neurodegeneración (SPIN), Barcelona, España36. Los participantes dieron su consentimiento informado. El estudio se ha llevado a cabo siguiendo las directrices éticas internacionales para la investigación médica contenidas en la declaración de Helsinki y la legislación española. El Comité de Ética de la Investigación de Sant Pau (CEIC) revisó y aprobó el protocolo de recogida y almacenamiento de muestras de plasma humano de la cohorte SPIN (#16/2013).
1. Enriquecimiento de astrocitos EV a partir de plasma humano
NOTA: Este protocolo implica el uso de muestras de plasma humano. Todos los detalles sobre los reactivos y el material de laboratorio utilizados en este protocolo se incluyen en la Tabla de Materiales. No se requiere ningún equipo especial para este procedimiento, sin embargo, revise las consideraciones de seguridad de cada reactivo, según lo especificado individualmente por cada fabricante.
Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de dos pasos para el enriquecimiento de EVs derivadas de astrocitos. En el primer paso, los VE se enriquecen a partir de plasma humano desfibrilado mediante pasos de precipitación y centrifugación basados en polímeros. Después de la resuspensión total de EV, los VE de astrocitos se seleccionan mediante inmunocaptura con anticuerpos anti-GLAST biotinilados (ACSA-1) y microesferas magnéticas anti-biotina. Abreviaturas: ACSA-1 = antígeno 1 de superficie de la célula de astrocitos; ADEVs = vesículas extracelulares derivadas de astrocitos; DPBS = solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; EV = vesículas extracelulares; GLAST = transportador de glutamato-aspartato; Sin ADEVs = vesículas extracelulares no astrocíticas; Sin EV = Sin vesículas extracelulares (plasma empobrecido por EV); PIC = cóctel de inhibidores de proteasa; RT = temperatura ambiente. Figura creada con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Validación de protocolo
3. Análisis de datos
El aislamiento de los ADEVs a partir de plasma recogido de donantes sanos se llevó a cabo con éxito. Se empleó un método de precipitación basado en polímeros para obtener la fracción total de EV, seguido de una inmunocaptura con microperlas magnéticas para obtener ADEVs.
El análisis de Western blot de la fracción total de EV antes de la etapa de inmunocaptura indicó la falta de calnexina (marcador de contaminación celular) y la presencia de Alix y la proteína transmembrana CD9 en las preparaciones de EV (Figura 2A).
Tras la inmunocaptura, se validó la presencia y enriquecimiento de marcadores vesiculares y astrocíticos en la fracción ADEV. Las concentraciones de GFAP fueron significativamente mayores en los ADEV en comparación con la fracción sin ADEV (flow-through), mostrando un enriquecimiento de seis veces (p = 0,008). Esto confirma el origen predominantemente astrocítico de los EV en la fracción ADEV (Figura 2B). El CV de la cuantificación de GFAP en las preparaciones de ADEV a partir de 10 muestras idénticas fue del 25%.
Con el fin de confirmar la presencia de marcadores vesiculares en las preparaciones de ADEV, se examinaron dos marcadores: Alix, un marcador vesicular citosólico clásico42, y la proteína transmembrana CD8144. Los niveles de Alix fueron mayores en la fracción ADEV en comparación con el plasma libre (p = 0,001), así como con el plasma empobrecido por EV, denominado sin EV (p = 0,0007; Figura 2C). Los ADEV también mostraron el enriquecimiento de CD81 en comparación con el plasma libre (p = 0,03; Figura 2D).
Para caracterizar aún más la población de ADEV, el perfil de tamaño y conteo se analizó por NTA y la morfología por crio-EM. El análisis de NTA mostró un perfil homogéneo de VE con un tamaño medio de 93,7 ± 2,7 nm, consistente con el tamaño de los VE pequeños (microvesículas y exosomas). Además, la caracterización por crio-EM confirmó aún más la presencia y la morfología esperada de los VE (Figura 2E).
Dado que las lipoproteínas pueden co-precipitar con las EV, los niveles de ApoB se analizaron en diferentes fracciones. Los resultados muestran que después de la etapa de inmunocaptura, los niveles de ApoB son mínimos en las preparaciones de ADEV, siendo mayores en plasma (p = 0,005; Figura 2F).
Figura 2: Caracterización de las fracciones totales de EV y ADEV. (A) Western blot representativo que muestra falta de calnexina y presencia de Alix y CD9 en las preparaciones totales de EV. (B) La fracción ADEV mostró niveles aumentados de GFAP en comparación con los No ADEV (ADEV, n = 7; Sin ADEV, n = 7; p = 0,008). (C) Se detectaron niveles más altos de Alix en los ADEV en comparación con los plasmáticos (p = 0,001) y los No EV (p = 0,0007); plasma: n = 6; Sin vehículos eléctricos: n = 6; ADEVS: n = 16. (D) Se detectaron niveles más altos de CD81 en la fracción ADEV en comparación con el plasma (p = 0,003); plasma: n = 5; Sin EV: n = 1 (CD81 fue indetectable en ocho de las nueve muestras de No EV); ADEVS: n = 17. (E) El análisis de NTA reveló la presencia de partículas con un tamaño medio de 93,7 ± 2,7 nm y cuya característica vesicular fue confirmada por crio-EM. (F) La ApoB fue significativamente menor en la fracción ADEV en comparación con el plasma (p = 0,005); plasma: n = 4; EV: n = 4; ADEVS: n = 4. Abreviaturas: ADEVs = vesículas extracelulares derivadas de astrocitos; Alix = proteína interactuante de muerte celular programada 6 (PDCD6IP); ApoB = Apolipoproteína B; EVs = preparaciones totales de vesículas extracelulares después de la precipitación a base de polímeros; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; Sin ADEVs = vesículas extracelulares no astrocíticas; Sin EV = Sin vesículas extracelulares (plasma empobrecido por EV). Para (B) se utilizó la prueba de Mann Whitney de dos colas (**p < 0,01) y para (C,D,F) se utilizaron las pruebas de comparación múltiple de Kluskal-Wallis y Dunn (*p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,0001). Los gráficos ilustran la media y las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Por último, se examinó la aplicabilidad de este protocolo mediante el uso de ADEVs para cuantificar marcadores inflamatorios. Las 25 citocinas inflamatorias del panel fueron detectables en los ADEV obtenidos de donantes sanos (Figura 3).
Figura 3. Cuantificación de citocinas inflamatorias en la fracción ADEV. Un panel de 25 citoquinas inflamatorias en ADEVs de donantes sanos reveló que todas ellas eran detectables y se expresaban diferencialmente (HC, n = 3). El gráfico ilustra la media y las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los vehículos eléctricos han ganado un gran interés en la investigación biomédica debido a su potencial diagnóstico y terapéutico. En la actualidad, uno de los principales hándicaps relacionados con los métodos de aislamiento de VE es la falta de consenso metodológico y de protocolos estandarizados. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el enriquecimiento de astrocitos EV a partir de plasma humano a través de la precipitación basada en polímeros y la inmunocaptura BLAST.
Existen diferentes metodologías para el aislamiento de los VE de los fluidos corporales, cada una con sus propias ventajas y limitaciones. Se eligió un enfoque basado en polímeros debido a su simplicidad, facilidad de uso, no requiere mucho tiempo, no requiere un instrumento específico, alto rendimiento de EV y porque es ampliamente utilizado en estudios de biomarcadores de EV en neurología 12,18,19,20, lo que permite la comparación de resultados. Sin embargo, también se podrían probar métodos alternativos como la cromatografía de exclusión por tamaño. Una crítica común a los métodos basados en polímeros es la coprecipitación de lipoproteínas junto con las EV. Sin embargo, el paso adicional de inmunocaptura con anticuerpos ACSA-1 y los lavados posteriores pueden superar esta limitación mediante la unión selectiva a ADEVs, minimizando la contaminación con lipoproteínas, como se ha visto con el análisis de ApoB. Cuando se utiliza este protocolo para estudios cuantitativos, se debe tener en cuenta el CV intraensayo, especialmente con tamaños de muestra pequeños. Otra limitación de este procedimiento es que las trazas mínimas de polímero podrían interferir con ciertos análisis posteriores, como la espectrometría de masas. Por lo tanto, la combinación de este protocolo con métodos analíticos posteriores debe probarse para cada uso específico.
El protocolo descrito en este estudio ha sido validado para el enriquecimiento de marcadores astrocíticos y vesiculares en la fracción ADEV. La inmunocaptura de astrocitos EV se llevó a cabo utilizando GLAST como objetivo y validó el origen astrocítico de los EV, como lo demuestra el enriquecimiento séxtuple de un marcador astrocítico adicional, GFAP. Aunque este procedimiento ha sido probado y optimizado para el enriquecimiento de ADEV a partir de plasma humano de adultos mayores sanos, ciertos pasos del protocolo se pueden modificar y adaptar de acuerdo con la aplicación posterior que se vaya a utilizar. Por ejemplo, se prefiere el uso de agua ultrapura para la resuspensión de pellets para la inmunoprecipitación posterior. Además, la etapa de incubación de los anticuerpos y las perlas magnéticas (tiempo y concentración) se puede modificar para concentrar o diluir los ADEV según se desee.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen la resuspensión mecánica de la peleta EV antes de la etapa de inmunocaptura. Los vehículos eléctricos granulados deben tratarse con mucho cuidado, evitando la formación de espuma durante la resuspensión. También se debe prestar atención al uso de inhibidores de proteasa 3x concentrados en los tampones, para inhibir las proteasas activas presentes en el plasma. Además, es crucial no empujar con el émbolo sobre la columna en pasos antes de la elución de los ADEV retenidos en la columna.
Si bien existen estudios que utilizan este enfoque (precipitación basada en polímeros + inmunoprecipitación) para aislar los ADEV de individuos con enfermedad de Alzheimer y lesión cerebral traumática 12,20,34, los ADEV siguen siendo poco investigados con respecto a los EV de otros orígenes celulares (por ejemplo, neuronas) y ameritan más investigación.
Ciertas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, se han asociado con anomalías endosomales y aumento de la secreción de EV 45,46,47. Una forma de explicar una mayor secreción de EV es cuantificar los niveles de un marcador EV, como Alix y CD81, como se hizo en este estudio, u otras tetraspaninas, como CD63 o CD9, para normalizar los niveles del analito de interés. Además de validar el enriquecimiento de marcadores astrocíticos y EV, se probó la utilidad del protocolo para medir citocinas inflamatorias en ADEVs. Utilizando una plataforma multiplex, se obtuvieron concentraciones detectables y cuantitativas de 25 citocinas y quimiocinas en la fracción ADEV.
Por lo tanto, este procedimiento permite la recolección de EVs que pueden ser utilizados como una plataforma de descubrimiento de biomarcadores, así como una herramienta no invasiva para el estudio de los mecanismos y vías moleculares relacionados con los astrocitos. De hecho, el estudio de los ADEV tiene un enorme potencial en los campos de las enfermedades neurológicas, ya que la carga de ADEV puede utilizarse como recurso para explorar el fenotipo de los astrocitos y los cambios a lo largo de las diferentes etapas de la enfermedad.
Si bien este manuscrito describe ampliamente la metodología, es esencial considerar las ventajas y limitaciones de este método y la aplicabilidad adecuada. De hecho, existen importantes esfuerzos de estandarización en el campo de los VE, como las extensas recomendaciones de investigación y los pasos de validación descritos por las directrices MISEV de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares48, y la plataforma EV-track para el reporte de información metodológica sobre los estudios de VE49.
El Dr. Belbin informó haber recibido honorarios personales de ADx NeuroSciences fuera del trabajo presentado. El Dr. Alcolea informó haber recibido honorarios personales por servicios de consejo asesor y/o honorarios de ponente de Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. y Esteve fuera del trabajo presentado. El Dr. Lleó ha trabajado como consultor o en consejos asesores de Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols y Nutricia fuera de los trabajos presentados. El Dr. Fortea informó haber recibido honorarios personales por su servicio en los consejos asesores, comités de adjudicación u honorarios de orador de AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio y Biogen fuera del trabajo presentado. Los Dres. Alcolea, Belbin, LLeó y Fortea informan de que son titulares de una patente de marcadores de sinaptopatía en enfermedades neurodegenerativas (licenciada a ADx, EPI8382175.0). No se reportaron otras revelaciones. Todos los demás autores no tienen nada más que revelar.
Los autores agradecen la ayuda de Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi y Oriol Sánchez López en la manipulación y preparación de las muestras. También queremos agradecer la colaboración de José Amable Bernabé, de la ICTS "NANBIOSIS", unidad 6 (Unidad del CIBER en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina) del Barcelona Materials Science Institute, Martí de Cabo Jaume de la Unidad de Microscopía Electrónica de la Universitat Autònoma de Barcelona, la Dra. Marta Soler Castany y Lia Ros Blanco de la Plataforma de Citometría de Flujo del Instituto de Investigación Biomédica de Sant Pau (IIB-Sant Pau), así como al Dr. Joan Carles Escolà-Gil del grupo de Fisiopatología de las enfermedades relacionadas con lípidos del IIB-Sant Pau por su ayuda en las determinaciones de NTA, crio-EM, Luminex y ApoB, respectivamente.
Los autores agradecen el apoyo financiero de la Fundación Jérôme Lejeune (Proyecto #1941 y #1913 a MFI y MCI), el Instituto de Salud Carlos III (PI20/01473 a JF, PI20/01330 a AL, PI18/00435 a DA e INT19/00016 a DA), el Instituto Nacional de Salud (1R01AG056850-01A1, R21AG056974 y R01AG061566 a JF), la Alzheimer's Association y el Global Brain Health Institute (GBHI_ALZ-18-543740 a MCI), la Asociación para la Degeneración Frontotemporal (Beca Postdoctoral de Investigación Clínica, AFTD 2019-2021) a ODI, y la Societat Catalana de Neurologia (Premi Beca Fundació SCN 2020 a MCI). Este trabajo también fue apoyado por el programa CIBERNED (Programa 1, Enfermedad de Alzheimer a AL y estudio SIGNAL. SS es beneficiario de una beca postdoctoral "Juan de la Cierva-Incorporación" (IJC2019-038962-I) de la Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Alix primary antibody for Western blotting | EMD Millipore | ABC40 | |
µMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads. |
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
Blocker BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath | Branson | ||
COBAS 6000 autoanalyzer | Roche Diagnostics | Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Digital Micrograph 1.8 | micrograph software | ||
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1) |
Gatan 895 USC 4000 | camera | ||
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system | Syngene | ||
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
Immun-Blot PVDF Membrane | BioRad | 1620177 | |
JEOL 2011 transmission electron microscope | JEOL LTD | Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA) | |
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes | Becton dickinson | 367525 | |
Leica EM GP | Leica Microsystem | commercial plunge freezer | |
Low binding microtubes 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
MACS µ Columns with plungers | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MAGPIX plate reader | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software) |
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA) |
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; 3.4 version | |
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher | 78441 | |
Polypropylene syringe (G29) | PeroxFarma | 1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2" | |
Secondary anti-rabbit antibody | Thermo Fisher | 10794347 | |
Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
Simoa, SR-X instrument | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology | |
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 |
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