Enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de astrocitos a partir de plasma humano

Este protocolo describe el enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de astrocitos (ADEVs) a partir de plasma humano. Se basa en la separación de los EV mediante precipitación de polímeros, seguida de la inmunocaptura de los ADEV basada en ACSA-1. El análisis de los ADEV puede ofrecer pistas para estudiar los cambios en las vías inflamatorias de pacientes vivos, de forma no invasiva mediante biopsia líquida.

Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas biológicas secretadas por todas las células para la comunicación celular y la eliminación de desechos. Participan en una amplia gama de funciones actuando y transfiriendo sus cargas a otras células en condiciones fisiológicas y patológicas. Dada su presencia en biofluidos, las VE representan un excelente recurso para el estudio de los procesos patológicos y pueden considerarse una biopsia líquida para el descubrimiento de biomarcadores. Un aspecto atractivo del análisis de VE es que pueden seleccionarse en función de los marcadores de su célula de origen, reflejando así el entorno de un tejido específico en su carga. Sin embargo, uno de los principales hándicaps relacionados con los métodos de aislamiento de VE es la falta de consensos metodológicos y protocolos estandarizados. Los astrocitos son células gliales con funciones esenciales en el cerebro. En las enfermedades neurodegenerativas, la reactividad de los astrocitos puede conducir a una alteración de la carga de EV y a una comunicación celular aberrante, lo que facilita/mejora la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, el análisis de los VE de los astrocitos puede conducir al descubrimiento de biomarcadores y posibles dianas patológicas. Este protocolo describe un método de 2 pasos para el enriquecimiento de EV derivadas de astrocitos (ADEV) a partir de plasma humano. En primer lugar, los vehículos eléctricos se enriquecen a partir de plasma desfibrilado mediante precipitación basada en polímeros. A esto le sigue el enriquecimiento de los ADEV mediante la inmunocaptura basada en ACSA-1 con microesferas magnéticas, en la que los EV resuspendidos se cargan en una columna colocada en un campo magnético. Los EV ACSA-1+ etiquetados magnéticamente se retienen dentro de la columna, mientras que otros EV fluyen a través de ella. Una vez que se retira la columna del imán, los ADEV se eluyen y están listos para su almacenamiento y análisis. Para validar el enriquecimiento de marcadores de astrocitos, se puede medir la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) u otros marcadores astrocíticos específicos de origen intracelular en el eluido y compararlos con el flujo a través. Este protocolo propone un método fácil y eficiente en el tiempo para enriquecer ADEVs a partir de plasma que se puede utilizar como plataforma para examinar marcadores relevantes para los astrocitos.

Las vesículas extracelulares (VE) son un grupo heterogéneo de nanopartículas membranosas secretadas por todo tipo de células, portadoras de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos¹. Las microvesículas (100-1000 nm), los exosomas (30-100 nm) y los cuerpos apoptóticos (1000-5000 nm) constituyen los principales tipos de EV, distinguidos por su sitio de origen ^2,3. Las VE regulan procesos fisiológicos importantes, como la presentación de antígenos y las respuestas inmunitarias⁴, el reciclaje de receptores, la eliminación de metabolitos⁵ y la comunicación celular⁶. La regulación de estos procesos puede ocurrir por la unión directa entre proteínas enriquecidas en la membrana de la célula EV y dianas en las células receptoras, y/o a través de la internalización y liberación de su carga en el citoplasma de la célula receptora⁷. Si bien las VE realizan funciones celulares esenciales, han ganado cada vez más interés desde una perspectiva patológica en los campos del cáncer y la neurología. De hecho, varios estudios han demostrado que los VE pueden ayudar a promover la migración de células tumorales ^8,9 o semillas de agregados de proteínas tóxicas en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer^10,11.

Los VE pueden seleccionarse y enriquecerse a partir de biofluidos a partir de marcadores de superficie celular relacionados con su célula de origen, reflejando así el entorno de un tejido específico en su carga 12,13,14,15,16,17,18,19,20. Además, dada su presencia en la sangre, el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva, la orina y la leche materna, las VE representan una excelente herramienta no invasiva para el diagnóstico, y pueden considerarse una biopsia líquida para el descubrimiento de biomarcadores. Esto es de especial interés en neurología, dadas las dificultades de estudiar los analitos cerebrales en fluidos accesibles distintos del LCR.

Los astrocitos han ganado un interés creciente, ya que se encuentran en la intersección de la comunicación neurovascular²¹. En condiciones fisiológicas, son responsables de la preservación de la barrera hematoencefálica, del reciclaje de neurotransmisores, del suministro de nutrientes y factores de crecimiento a las neuronas y otras células gliales ^22,23,24, así como de la defensa neuroinmune, dada su plasticidad metabólica de estados proinflamatorios a antiinflamatorios y viceversa 25,26,27. Un mecanismo importante por el cual los astrocitos cumplen sus funciones reguladoras es la comunicación a través de los EV^28,29. La astrocitosis reactiva es un sello distintivo clave de varias enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de ^Alzheimer,30 la atrofia multisistémica (AMS), la parálisis supranuclear progresiva (PSP)³¹ y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)³². La reactividad de los astrocitos puede conducir a una alteración de la carga de EV, liberación de mediadores inflamatorios y comunicación celular aberrante, facilitando así la propagación de la patología y conduciendo a la neurodegeneración^10,11. Por lo tanto, el estudio de los VE derivados de astrocitos (ADEV) y los cambios en su carga es un recurso atractivo para examinar los procesos neurodegenerativos de manera no invasiva.

En la actualidad, existen varias metodologías para el aislamiento de los vehículos eléctricos, cada una con sus correspondientes ventajas y desventajas³³. Es fundamental considerar qué método es el más adecuado para un uso específico, en función de la aplicación final de interés. En el campo de la neurología, y más concretamente en los estudios de astrocitos, la precipitación basada en polímeros seguida de inmunocaptura ha sido el método predominantemente utilizado 12,18,19,20,34. Sin embargo, incluso cuando se aplica el mismo enfoque, sigue habiendo heterogeneidad entre los estudios en los diferentes pasos aplicados para el aislamiento de EV. Por lo tanto, existe la necesidad de una metodología estandarizada clara y paso a paso para facilitar los estudios de VE de astrocitos y la reproducibilidad del estudio. La precipitación basada en polímeros facilita el cribado de biomarcadores, ya que se trata de un procedimiento rápido, sencillo y que no requiere de equipos complejos, lo que permite un alto rendimiento de las VE sin afectar a su actividad biológica³⁵.

El presente protocolo describe un método detallado, sencillo y de dos pasos para el enriquecimiento de ADEVs a partir de plasma humano. Se basa en una precipitación basada en polímeros de la fracción total de EV, seguida de una inmunocaptura de VE de astrocitos. Dadas las importantes funciones de los astrocitos, el análisis de los ADEV puede arrojar luz para el descubrimiento de biomarcadores y vías inflamatorias cerebrales que puedan estudiarse de forma no invasiva.

La investigación descrita en este protocolo se ha llevado a cabo con muestras de plasma humano de donantes adultos sanos de ambos sexos (rango de edad 65,9-81,3 años, 45,5% mujeres), de la cohorte de la Iniciativa de Sant Pau en Neurodegeneración (SPIN), Barcelona, España³⁶. Los participantes dieron su consentimiento informado. El estudio se ha llevado a cabo siguiendo las directrices éticas internacionales para la investigación médica contenidas en la declaración de Helsinki y la legislación española. El Comité de Ética de la Investigación de Sant Pau (CEIC) revisó y aprobó el protocolo de recogida y almacenamiento de muestras de plasma humano de la cohorte SPIN (#16/2013).

1. Enriquecimiento de astrocitos EV a partir de plasma humano

NOTA: Este protocolo implica el uso de muestras de plasma humano. Todos los detalles sobre los reactivos y el material de laboratorio utilizados en este protocolo se incluyen en la Tabla de Materiales. No se requiere ningún equipo especial para este procedimiento, sin embargo, revise las consideraciones de seguridad de cada reactivo, según lo especificado individualmente por cada fabricante.

1. Recogida y almacenamiento de muestras
   1. Recolectar sangre en tubos vacutainer de EDTA lavanda, siguiendo protocolos estandarizados para la recolección de plasma^36,37. Centrifugar a 2000 x g durante 10 min a 4 °C dentro de 30-120 min después de la recolección para la separación por plasma. Separe el plasma, que es el líquido claro superior que aparece como sobrenadante, en alícuotas de 500 μL.
   2. Para eliminar los restos de celdas, centrifugar las alícuotas a 3000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Recuperar el sobrenadante. Almacene el plasma a -80 °C hasta el análisis. Como es práctica común para los análisis de biofluidos, alícuota las muestras antes del almacenamiento y evite más de tres ciclos de congelación y descongelación.
2. Enriquecimiento total de vehículos eléctricos
   NOTA: Todos los reactivos utilizados deben filtrarse a través de un filtro de 0,22 μm.
   1. Descongelar 500 μL de muestras de plasma. Añadir trombina en una proporción de 1:100 para eliminar los factores de coagulación. Mezclar por inversión tres veces y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Complete el volumen hasta alcanzar 1 mL con la solución de trabajo salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco: DPBS + cóctel de inhibidores de proteasa concentrado 3x (diluido a partir de 10 veces el stock de cóctel de inhibidores de proteasa). Mezclar por inversión.
   3. Centrifugar las muestras a 6000 x g durante 20 min a 4 °C. Recuperar el sobrenadante. Complete el volumen con la solución de trabajo DBPS para alcanzar 1 mL.
   4. Añadir 252 μL de la solución de precipitación EV y mezclar por inversión tres veces. Incubar a 4 °C durante 60 min.
   5. Centrifugar las muestras a 1500 x g durante 20 min a 4 °C para precipitar la fracción total de EV (pellet). Recoja 1 mL del sobrenadante. Etiquete la fracción como plasma empobrecido en EV para utilizarla como control negativo de los marcadores de enriquecimiento de EV (sin EV) y almacene a -80 °C.
   6. Centrifugar el pellet restante a 1500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante restante. Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de agua ultrapura que contenga inhibidores concentrados de proteasa y fosfatasa (concentración final 3x, diluida a partir de un stock de 100x, ver Tabla de Materiales).
   7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para aflojar el pellet, evitando la formación de espuma; Agitar en un agitador de tubo giratorio durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la resuspensión completa. Asegurar la resuspensión completa de los pellets, ya que es un paso crítico para el siguiente paso de inmunocaptura.
3. Inmunocaptura de ADEVs
   NOTA: Los ADEV llevan marcadores de astrocitos. El marcador seleccionado para el enriquecimiento de ADEV mediante inmunocaptura es GLAST. GLAST, que significa transportador de glutamato-aspartato (UniProtKB-P43003), es el transportador de glutamato más abundante expresado predominantemente por los astrocitos en el cerebelo y el neocórtex cerebral³⁸. El anticuerpo anti-GLAST (ACSA-1, antígeno de superficie celular de astrocitos-1) es específico para un epítopo extracelular de GLAST y ha sido desarrollado para la identificación de astrocitos. Es la diana más utilizada para la inmunocaptura de ADEVs a partir de plasma humano 12,20,34.
   1. Añadir 10 μL de anticuerpo biotinilado anti-GLAST (ACSA-1) a cada muestra que contenga el preparado total de EV. Mezclar bien y suavemente. Incubar durante 1 h a 4 °C en un agitador de tubo giratorio.
   2. Añadir 10 μL de microperlas magnéticas conjugadas con anticuerpos monoclonales anti-biotina (IgG1 de ratón). Mezclar bien y suavemente. Incubar durante 1 h a 4 °C en un agitador de tubo giratorio.
   3. Coloque una microcolumna en el campo magnético de un separador MACS. Prepare la columna enjuagándola con 500 μL de PBS-0,5% albúmina sérica bovina (BSA). Deseche el flujo continuo.
   4. Cargue la suspensión EV/ACSA-1/microbead en la columna. No empuje con el émbolo en este paso. Recoja el flujo continuo. Etiquételo como EV no astrocítico (No ADEV) y manténgalo como control si es necesario.
   5. Lave la columna dos veces con 500 μL de PBS-0,5% BSA. Deseche el flujo continuo.
   6. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo de recolección de baja adherencia de 1,5 mL. Pipetea 500 μL de PBS-0,5% BSA en la columna. Empuje firmemente con un émbolo en la columna y recoja el eluido.
   7. Etiqueta como ACSA-1+ EV (ADEVs). Almacene los vehículos eléctricos no lisados a -20 °C durante períodos cortos o a -80 °C durante períodos más largos (>6 meses).
      NOTA: Los anticuerpos anti-ACSA-1 se unirán al epítopo GLAST-1/EAAT-1. Las microperlas magnéticas se unirán con afinidad al complejo anti-ACSA-1-EV. Las microcolumnas MACS contienen una matriz optimizada para generar un fuerte campo magnético cuando se colocan en un imán, que es necesario para retener los ADEV etiquetados.
      Para obtener una representación esquemática del procedimiento de enriquecimiento de ADEV, consulte la Figura 1.
4. Lisis de vehículos eléctricos
   NOTA: Los EV deben estar completamente lisados para la detección de marcadores intravesiculares. Se recomienda el uso de dos métodos secuenciales, como el químico seguido de la lisis mecánica.
   1. Realizar una lisis química de los EV añadiendo reactivo de extracción de proteínas (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 100 μL de muestra por 150 μL de reactivo de extracción. Agregue 100x inhibidores de proteasa y fosfatasa para alcanzar una concentración final 1x. Agite vigorosamente y deje reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
   2. Realice una lisis mecánica mediante un procedimiento de dos pasos: pase la solución EV lisada químicamente a través de una jeringa dos veces (aguja G29). A continuación, sonique las muestras durante 45 s en un baño ultrasónico de agua fría. Congele los EV lisados a -80 °C.
   3. Descongele las muestras a 37 °C durante 5 min. Congelar de nuevo a -80 °C para el almacenamiento de vehículos eléctricos lisados. Descongele nuevamente durante 5 minutos a 37 °C antes del análisis.

Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de dos pasos para el enriquecimiento de EVs derivadas de astrocitos. En el primer paso, los VE se enriquecen a partir de plasma humano desfibrilado mediante pasos de precipitación y centrifugación basados en polímeros. Después de la resuspensión total de EV, los VE de astrocitos se seleccionan mediante inmunocaptura con anticuerpos anti-GLAST biotinilados (ACSA-1) y microesferas magnéticas anti-biotina. Abreviaturas: ACSA-1 = antígeno 1 de superficie de la célula de astrocitos; ADEVs = vesículas extracelulares derivadas de astrocitos; DPBS = solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; EV = vesículas extracelulares; GLAST = transportador de glutamato-aspartato; Sin ADEVs = vesículas extracelulares no astrocíticas; Sin EV = Sin vesículas extracelulares (plasma empobrecido por EV); PIC = cóctel de inhibidores de proteasa; RT = temperatura ambiente. Figura creada con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Validación de protocolo

1. Caracterización de la fracción total de EV antes de la inmunocaptura
   1. Utilice EV totales lisados (pellets resuspendidos después de la precipitación del polímero) y muestras de plasma diluido para el análisis de Western blot. Complemente las muestras con 4 tampones de muestra Laemmli (5 μL para 15 μL de muestra), hierva durante 10 minutos a 90 °C y cárguelo en geles de acrilamida sin manchas al 10%.
   2. Realice la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) en tampón Tris/Glycine/SDS a 80 V durante 30 min, seguido de 200 V durante 40 min. Después de la SDS-PAGE, retire el gel de las placas de vidrio y visualice el contenido total de proteínas después de una excitación UV de 1 min.
   3. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF de 0,2 μm activada por metanol a través de un sistema semiseco a 25 V, 2,5 A durante 10 minutos (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el equipo). Después de la transferencia, bloquee la membrana en tampón de bloqueo durante 5 min a temperatura ambiente y posteriormente incube durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios contra Alix (1:1000), CD9 (1:1000) o Calnexin (1:1000); consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.
   4. Lavar la membrana en solución salina tamponada con Tris con 0,1% Tween 20 (TBST) tres veces durante 10 min e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario anti-conejo HRP diluido a 1:7500 en tampón de bloqueo. Lave la membrana en TBST cuatro veces durante 10 min. Realice todos los lavados y pasos de incubación con una suave agitación de la membrana en un balancín de banco.
   5. Mezclar en una proporción de 1:1 la solución quimioluminiscente con el tampón de peróxido e incubar las membranas durante 5 min a temperatura ambiente. Exponga y adquiera bandas utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
2. Validación del enriquecimiento de marcadores específicos de astrocitos en la fracción ADEV
   NOTA: La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) es la principal proteína de filamento intermedio en las células astrocíticas y un elemento esencial de su citoesqueleto durante el desarrollo. El GFAP puede detectarse en el tejido cerebral y en los biofluidos, siendo un marcador de astrocitos bien conocido³⁹. Por lo tanto, este marcador se cuantificó utilizando una tecnología comercial de detección de biomarcadores para demostrar el enriquecimiento de marcadores derivados de astrocitos en la fracción ADEV. Esta tecnología de biomarcadores es una técnica ultrasensible que permite la medición de moléculas individuales de proteínas con una sensibilidad de hasta 1.000 veces mayor que los inmunoensayos convencionales. Esta técnica se basa en el uso de micropartículas paramagnéticas acopladas a anticuerpos diseñados para unirse a dianas específicas^40,41 (ver Tabla de Materiales).
   1. Utilice muestras de EV lisadas para el análisis de biomarcadores. Para probar el enriquecimiento de los marcadores de astrocitos, compare los niveles de GFAP en el eluido (ADEVs) versus los de flujo (No ADEVs) utilizando un inmunoensayo ultrasensible comercial.
   2. Diluir las muestras en una proporción de 1:4 (25 μL de EVs + 75 μL de tampón de ensayo), preparar los calibradores y realizar el ensayo en el equipo de detección de biomarcadores, según lo especificado en las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Las muestras se pueden diluir directamente en la placa.
   3. Pruebe las muestras y los calibradores por duplicado. El rango de cuantificación para el ensayo GFAP fue de 1,37-1000 pg/mL. Utilice la plataforma de análisis de software del fabricante para calcular las concentraciones de GFAP a partir de la curva de calibración.
   4. Para estimar el coeficiente de variación (CV) del protocolo para el enriquecimiento de marcadores de astrocitos, se midieron los niveles de GFAP en preparaciones de ADEV obtenidas a partir de réplicas idénticas de muestras de plasma humano agrupadas y se calculó el CV como desviación estándar/media x 100. En este protocolo, el CV se calculó utilizando N = 10 muestras de plasma idénticas.
3. Validación del enriquecimiento de marcadores EV en la fracción ADEV
   1. Para validar el enriquecimiento de los marcadores de EV, mida los niveles de Alix y CD81 mediante ELISA (consulte la Tabla de materiales) en muestras de EV lisadas sin diluir, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Muestras de prueba y calibradores por duplicado.
   2. Lea las placas a 450 nm y 570 nm utilizando un lector de microplacas. Utilice una curva de calibración lineal para calcular las concentraciones de Alix y CD81. El rango de cuantificación para el ensayo Alix fue de 47-3000 pg/mL y para CD81 fue de 0,156-10 ng/mL.
4. Caracterización del tamaño y morfología de los ADEV
   1. Análisis de seguimiento de nanopartículas
      1. Utilice el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para medir la concentración de partículas y la distribución del tamaño de las preparaciones frescas de EV no lisadas.
      2. Diluya las suspensiones de ADEV frescas no lisadas (10 μL) con PBS filtrado de acuerdo con el rango de detección del instrumento (20-100 partículas/fotograma), utilizando el software suministrado, grabe tres videos de 60 s con los siguientes ajustes: caudal de la jeringa a 30 u.a., nivel de la cámara a 13 y umbral de detección a 5. Corrija las concentraciones de partículas para el volumen de la muestra de entrada, el volumen de resuspensión de EV y la dilución necesaria para la lectura de NTA.
         NOTA: Se recomienda previsualizar una muestra que contenga la solución para vehículos eléctricos para verificar el efecto de la matriz y la pureza del medio en el que se resuspenden los vehículos eléctricos.
   2. Criomicroscopía electrónica
      1. Utilice la criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) para confirmar la presencia y morfología de Evs en suspensiones frescas de ADEV no lisadas (4 μL). Vitrificar las muestras utilizando un congelador de inmersión comercial en rejillas de carbono Holey con los siguientes ajustes: 3,9 μL de muestra, tiempo de espera 10 s, tiempo de secado 2 s.
      2. Sumérjalo en etano-nitrógeno líquido en una estación de trabajo criogénica. Transfiera las rejillas a un criosoporte mantenido a -179 °C para el análisis de microscopio electrónico de transmisión. Examine los vehículos eléctricos con un microscopio electrónico de transmisión que funcione a una tensión de aceleración de 200 kV y esté equipado con una cámara CCD. Adquirir micrografías usando software.
5. Análisis de la co-precipitación de lipoproteínas
   1. Determine los niveles de ApoB humana en plasma sin diluir, muestras totales de EV lisadas y muestras de ADEV lisadas con un ensayo inmunoturbidimétrico utilizando un kit comercial adaptado para un autoanalizador comercial (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
6. Análisis de marcadores inflamatorios en ADEVs
   1. Utilice un ensayo basado en perlas (consulte la tabla de materiales) para cuantificar la concentración de 25 marcadores inflamatorios: eotaxina, IFN Alfa2, IFN Gamma, IL-1 Alfa, IL-1 Beta, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1 Alfa, MIP-1 Beta, TGF Alfa, TNF Alfa, TNF Beta.
   2. Utilice preparaciones de EV lisadas sin diluir (25 μL) e incube las muestras con las perlas durante la noche a 4 °C, siguiendo las instrucciones del fabricante. Lavar la placa, incubar con 25 μL de anticuerpos de detección e incubar durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
   3. Añadir 25 μL de estreptavidina-PE a cada pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Añadir 150 μL de líquido de la vaina e incubar durante 5 min bajo agitación. Lea la placa en el lector de placas conectado al sistema.
      NOTA: Esta técnica se basa en inmunoensayos que utilizan anticuerpos que se unen a la superficie de microperlas magnéticas recubiertas de fluorescente. Esta tecnología codifica internamente las microesferas por su color con diferentes tintes. Cada tipo de microesfera está recubierta con un anticuerpo de captura específico, de modo que múltiples perlas conjugadas capturan los analitos incrustados en las muestras, lo que permite la detección cuantitativa múltiple de docenas de analitos simultáneamente. El sistema utiliza la plataforma de inmunoensayo multiplexado basada en perlas para la detección de señales⁴³.

3. Análisis de datos

1. Realizar análisis estadísticos con software comercial. Evaluar la normalidad de los datos con la prueba de Shapiro-Wilk. Pruebe comparaciones de dos grupos con la prueba U de Mann-Whitney y comparaciones de tres grupos con la prueba de Kruskal-Wallis y la corrección post-hoc de Dunn. Establezca la significación en p < 0,05.

El aislamiento de los ADEVs a partir de plasma recogido de donantes sanos se llevó a cabo con éxito. Se empleó un método de precipitación basado en polímeros para obtener la fracción total de EV, seguido de una inmunocaptura con microperlas magnéticas para obtener ADEVs.

El análisis de Western blot de la fracción total de EV antes de la etapa de inmunocaptura indicó la falta de calnexina (marcador de contaminación celular) y la presencia de Alix y la proteína transmembrana CD9 en las preparaciones de EV (Figura 2A).

Tras la inmunocaptura, se validó la presencia y enriquecimiento de marcadores vesiculares y astrocíticos en la fracción ADEV. Las concentraciones de GFAP fueron significativamente mayores en los ADEV en comparación con la fracción sin ADEV (flow-through), mostrando un enriquecimiento de seis veces (p = 0,008). Esto confirma el origen predominantemente astrocítico de los EV en la fracción ADEV (Figura 2B). El CV de la cuantificación de GFAP en las preparaciones de ADEV a partir de 10 muestras idénticas fue del 25%.

Con el fin de confirmar la presencia de marcadores vesiculares en las preparaciones de ADEV, se examinaron dos marcadores: Alix, un marcador vesicular citosólico clásico⁴², y la proteína transmembrana CD81⁴⁴. Los niveles de Alix fueron mayores en la fracción ADEV en comparación con el plasma libre (p = 0,001), así como con el plasma empobrecido por EV, denominado sin EV (p = 0,0007; Figura 2C). Los ADEV también mostraron el enriquecimiento de CD81 en comparación con el plasma libre (p = 0,03; Figura 2D).

Para caracterizar aún más la población de ADEV, el perfil de tamaño y conteo se analizó por NTA y la morfología por crio-EM. El análisis de NTA mostró un perfil homogéneo de VE con un tamaño medio de 93,7 ± 2,7 nm, consistente con el tamaño de los VE pequeños (microvesículas y exosomas). Además, la caracterización por crio-EM confirmó aún más la presencia y la morfología esperada de los VE (Figura 2E).

Dado que las lipoproteínas pueden co-precipitar con las EV, los niveles de ApoB se analizaron en diferentes fracciones. Los resultados muestran que después de la etapa de inmunocaptura, los niveles de ApoB son mínimos en las preparaciones de ADEV, siendo mayores en plasma (p = 0,005; Figura 2F).

Figura 2: Caracterización de las fracciones totales de EV y ADEV. (A) Western blot representativo que muestra falta de calnexina y presencia de Alix y CD9 en las preparaciones totales de EV. (B) La fracción ADEV mostró niveles aumentados de GFAP en comparación con los No ADEV (ADEV, n = 7; Sin ADEV, n = 7; p = 0,008). (C) Se detectaron niveles más altos de Alix en los ADEV en comparación con los plasmáticos (p = 0,001) y los No EV (p = 0,0007); plasma: n = 6; Sin vehículos eléctricos: n = 6; ADEVS: n = 16. (D) Se detectaron niveles más altos de CD81 en la fracción ADEV en comparación con el plasma (p = 0,003); plasma: n = 5; Sin EV: n = 1 (CD81 fue indetectable en ocho de las nueve muestras de No EV); ADEVS: n = 17. (E) El análisis de NTA reveló la presencia de partículas con un tamaño medio de 93,7 ± 2,7 nm y cuya característica vesicular fue confirmada por crio-EM. (F) La ApoB fue significativamente menor en la fracción ADEV en comparación con el plasma (p = 0,005); plasma: n = 4; EV: n = 4; ADEVS: n = 4. Abreviaturas: ADEVs = vesículas extracelulares derivadas de astrocitos; Alix = proteína interactuante de muerte celular programada 6 (PDCD6IP); ApoB = Apolipoproteína B; EVs = preparaciones totales de vesículas extracelulares después de la precipitación a base de polímeros; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; Sin ADEVs = vesículas extracelulares no astrocíticas; Sin EV = Sin vesículas extracelulares (plasma empobrecido por EV). Para (B) se utilizó la prueba de Mann Whitney de dos colas (**p < 0,01) y para (C,D,F) se utilizaron las pruebas de comparación múltiple de Kluskal-Wallis y Dunn (*p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,0001). Los gráficos ilustran la media y las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, se examinó la aplicabilidad de este protocolo mediante el uso de ADEVs para cuantificar marcadores inflamatorios. Las 25 citocinas inflamatorias del panel fueron detectables en los ADEV obtenidos de donantes sanos (Figura 3).

Figura 3. Cuantificación de citocinas inflamatorias en la fracción ADEV. Un panel de 25 citoquinas inflamatorias en ADEVs de donantes sanos reveló que todas ellas eran detectables y se expresaban diferencialmente (HC, n = 3). El gráfico ilustra la media y las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los vehículos eléctricos han ganado un gran interés en la investigación biomédica debido a su potencial diagnóstico y terapéutico. En la actualidad, uno de los principales hándicaps relacionados con los métodos de aislamiento de VE es la falta de consenso metodológico y de protocolos estandarizados. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el enriquecimiento de astrocitos EV a partir de plasma humano a través de la precipitación basada en polímeros y la inmunocaptura BLAST.

Existen diferentes metodologías para el aislamiento de los VE de los fluidos corporales, cada una con sus propias ventajas y limitaciones. Se eligió un enfoque basado en polímeros debido a su simplicidad, facilidad de uso, no requiere mucho tiempo, no requiere un instrumento específico, alto rendimiento de EV y porque es ampliamente utilizado en estudios de biomarcadores de EV en neurología 12,18,19,20, lo que permite la comparación de resultados. Sin embargo, también se podrían probar métodos alternativos como la cromatografía de exclusión por tamaño. Una crítica común a los métodos basados en polímeros es la coprecipitación de lipoproteínas junto con las EV. Sin embargo, el paso adicional de inmunocaptura con anticuerpos ACSA-1 y los lavados posteriores pueden superar esta limitación mediante la unión selectiva a ADEVs, minimizando la contaminación con lipoproteínas, como se ha visto con el análisis de ApoB. Cuando se utiliza este protocolo para estudios cuantitativos, se debe tener en cuenta el CV intraensayo, especialmente con tamaños de muestra pequeños. Otra limitación de este procedimiento es que las trazas mínimas de polímero podrían interferir con ciertos análisis posteriores, como la espectrometría de masas. Por lo tanto, la combinación de este protocolo con métodos analíticos posteriores debe probarse para cada uso específico.

El protocolo descrito en este estudio ha sido validado para el enriquecimiento de marcadores astrocíticos y vesiculares en la fracción ADEV. La inmunocaptura de astrocitos EV se llevó a cabo utilizando GLAST como objetivo y validó el origen astrocítico de los EV, como lo demuestra el enriquecimiento séxtuple de un marcador astrocítico adicional, GFAP. Aunque este procedimiento ha sido probado y optimizado para el enriquecimiento de ADEV a partir de plasma humano de adultos mayores sanos, ciertos pasos del protocolo se pueden modificar y adaptar de acuerdo con la aplicación posterior que se vaya a utilizar. Por ejemplo, se prefiere el uso de agua ultrapura para la resuspensión de pellets para la inmunoprecipitación posterior. Además, la etapa de incubación de los anticuerpos y las perlas magnéticas (tiempo y concentración) se puede modificar para concentrar o diluir los ADEV según se desee.

Los pasos críticos en el protocolo incluyen la resuspensión mecánica de la peleta EV antes de la etapa de inmunocaptura. Los vehículos eléctricos granulados deben tratarse con mucho cuidado, evitando la formación de espuma durante la resuspensión. También se debe prestar atención al uso de inhibidores de proteasa 3x concentrados en los tampones, para inhibir las proteasas activas presentes en el plasma. Además, es crucial no empujar con el émbolo sobre la columna en pasos antes de la elución de los ADEV retenidos en la columna.

Si bien existen estudios que utilizan este enfoque (precipitación basada en polímeros + inmunoprecipitación) para aislar los ADEV de individuos con enfermedad de Alzheimer y lesión cerebral traumática 12,20,34, los ADEV siguen siendo poco investigados con respecto a los EV de otros orígenes celulares (por ejemplo, neuronas) y ameritan más investigación.

Ciertas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, se han asociado con anomalías endosomales y aumento de la secreción de EV 45,46,47. Una forma de explicar una mayor secreción de EV es cuantificar los niveles de un marcador EV, como Alix y CD81, como se hizo en este estudio, u otras tetraspaninas, como CD63 o CD9, para normalizar los niveles del analito de interés. Además de validar el enriquecimiento de marcadores astrocíticos y EV, se probó la utilidad del protocolo para medir citocinas inflamatorias en ADEVs. Utilizando una plataforma multiplex, se obtuvieron concentraciones detectables y cuantitativas de 25 citocinas y quimiocinas en la fracción ADEV.

Por lo tanto, este procedimiento permite la recolección de EVs que pueden ser utilizados como una plataforma de descubrimiento de biomarcadores, así como una herramienta no invasiva para el estudio de los mecanismos y vías moleculares relacionados con los astrocitos. De hecho, el estudio de los ADEV tiene un enorme potencial en los campos de las enfermedades neurológicas, ya que la carga de ADEV puede utilizarse como recurso para explorar el fenotipo de los astrocitos y los cambios a lo largo de las diferentes etapas de la enfermedad.

Si bien este manuscrito describe ampliamente la metodología, es esencial considerar las ventajas y limitaciones de este método y la aplicabilidad adecuada. De hecho, existen importantes esfuerzos de estandarización en el campo de los VE, como las extensas recomendaciones de investigación y los pasos de validación descritos por las directrices MISEV de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares⁴⁸, y la plataforma EV-track para el reporte de información metodológica sobre los estudios de VE⁴⁹.

El Dr. Belbin informó haber recibido honorarios personales de ADx NeuroSciences fuera del trabajo presentado. El Dr. Alcolea informó haber recibido honorarios personales por servicios de consejo asesor y/o honorarios de ponente de Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. y Esteve fuera del trabajo presentado. El Dr. Lleó ha trabajado como consultor o en consejos asesores de Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols y Nutricia fuera de los trabajos presentados. El Dr. Fortea informó haber recibido honorarios personales por su servicio en los consejos asesores, comités de adjudicación u honorarios de orador de AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio y Biogen fuera del trabajo presentado. Los Dres. Alcolea, Belbin, LLeó y Fortea informan de que son titulares de una patente de marcadores de sinaptopatía en enfermedades neurodegenerativas (licenciada a ADx, EPI8382175.0). No se reportaron otras revelaciones. Todos los demás autores no tienen nada más que revelar.

Los autores agradecen la ayuda de Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi y Oriol Sánchez López en la manipulación y preparación de las muestras. También queremos agradecer la colaboración de José Amable Bernabé, de la ICTS "NANBIOSIS", unidad 6 (Unidad del CIBER en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina) del Barcelona Materials Science Institute, Martí de Cabo Jaume de la Unidad de Microscopía Electrónica de la Universitat Autònoma de Barcelona, la Dra. Marta Soler Castany y Lia Ros Blanco de la Plataforma de Citometría de Flujo del Instituto de Investigación Biomédica de Sant Pau (IIB-Sant Pau), así como al Dr. Joan Carles Escolà-Gil del grupo de Fisiopatología de las enfermedades relacionadas con lípidos del IIB-Sant Pau por su ayuda en las determinaciones de NTA, crio-EM, Luminex y ApoB, respectivamente.

Los autores agradecen el apoyo financiero de la Fundación Jérôme Lejeune (Proyecto #1941 y #1913 a MFI y MCI), el Instituto de Salud Carlos III (PI20/01473 a JF, PI20/01330 a AL, PI18/00435 a DA e INT19/00016 a DA), el Instituto Nacional de Salud (1R01AG056850-01A1, R21AG056974 y R01AG061566 a JF), la Alzheimer's Association y el Global Brain Health Institute (GBHI_ALZ-18-543740 a MCI), la Asociación para la Degeneración Frontotemporal (Beca Postdoctoral de Investigación Clínica, AFTD 2019-2021) a ODI, y la Societat Catalana de Neurologia (Premi Beca Fundació SCN 2020 a MCI). Este trabajo también fue apoyado por el programa CIBERNED (Programa 1, Enfermedad de Alzheimer a AL y estudio SIGNAL. SS es beneficiario de una beca postdoctoral "Juan de la Cierva-Incorporación" (IJC2019-038962-I) de la Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España).