Sütten Kesilme Öncesi 7 Günlük Farelerin Pinna Edge Biyopsileri ile Tanımlanması

Protokol, tanımlama ve eşzamanlı genotipleme amacıyla doğum sonrası gün (PND) 7 farelerinde kulak kepçesi biyopsisi (PEB) üretmek için yeni bir aşamalı yaklaşım sunmaktadır.

Farelerin tanımlanması ve genotiplendirilmesi genellikle birçok in vivo bilimsel çalışmanın önemli bir parçasıdır. Sütten kesilmiş farelerde tanımlama ve genotipleme için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır; Bununla birlikte, bugüne kadar, sütten kesme öncesi fareler için tanımlanmış çok daha az teknik vardır. Pinna Edge Biyopsisi (PEB), genotipleme için daha sonra doku kullanımı ile bir tanımlama yöntemidir. Bu makale, doğum sonrası gün (PND) 7 farelerinde PEB'ye aşamalı bir yaklaşım hakkında video talimatı açıklar ve sağlar. Sekiz farklı kulak kepçesi biyopsi yeri ve tekniği modeli ana hatlarıyla belirtilmiştir ve bunların tanımlanması için yetişkinliğe kadar devam ettiği gösterilmiştir. Bu makale aynı zamanda PEB'yi optimize etmenin yollarını tartışmakta ve bu tekniğin yavruların büyümesi ve gelişmesi üzerindeki iyi huylu etkisini göstermektedir ve tüm fareler çalışma boyunca herhangi bir morbidite veya mortalite olmaksızın uygun kilo alımı göstermiştir. Bu teknik, araştırmacılara az sayıda tanımlama ve genotipleme yönteminin mevcut olduğu bir yaşta fare tanımlama için bir yöntem sağlayacaktır.

Bazı bilimsel çalışmalarda, bir fareyi tanımlama ve aynı anda genotipleme yöntemi çok önemli olabilir. Bir fare modeli kullanılırken, hayvanları aynı anda genotiplemek ve tanımlamak için geliştirilmiş yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem (örneğin, kulak delme, kulak etiketleme) ve yalnızca hayvanları tanımlayan diğer yöntemler (örneğin, dövme, deri altı transponder implantasyonu, işaretleyici veya boya uygulaması) veya yalnızca genotip hayvanları (örneğin, kuyruk biyopsisi) ^vardır1,2. Bu tekniklerin çoğunun sütten kesme sırasında yapılması amaçlanmıştır. Daha genç, sütten kesilmeden önceki hayvanlarda aynı anda tanımlama ve genotipleme teknikleri daha azdır 1,2,3,4.

Farelerin genç yaşlarda tanımlanmasını ve genotiplenmesini gerektiren çalışmalara yardımcı olmak için, PEB'yi PND 7 yavruları için güvenilir bir tanımlama ve genotipleme yöntemi olarak doğrulamak ve PND 21^5'te sütten kesilen farelerde PEB kullanımıyla karşılaştırmak için bir çalışma yapılmıştır. Bu çalışma detaylandırıldığı gibi, yatay ve dikey kulak kepçesi dilimleri seçilmiştir, çünkü PND 7 yavru karkasları kullanılarak yapılan önceki bir çalışmada, PEB kullanılarak oluşturulan kulak kepçesi desenlerinin net, hızlı olduğu, çeşitli desen kombinasyonları sağladığı, tanımlanabilir olduğu ve dokunun çıkarılmasının kolay olduğu bulunmuştur⁵. Kulak zımbaları ve kulak çentikleri gibi diğer yöntemler de araştırıldı, ancak PND 7 yavrularında tam dairesel zımbalar veya çentikler oluşturmak için yeterli yüzey alanı yoktu. Bu ön çalışma, referans verilen çalışmanın bu modelleri canlı PND 7 farelerinde test etmesine yol açtı⁵. Bu çalışma, kulak kepçesi biyopsisinden elde edilen doku boyutunun başarılı bir genotipleme için kullanılabileceğini göstermiştir. PEB paternleri, kulak kepçesinin PND 7 veya PND^{21 5'te} ne zaman biyopsi yapıldığına bakılmaksızın, PND 63'e kadar olan fareler olarak da sağlamdı.

Bu tekniğin geliştirilmesindeki amaç, mevcut literatüre göre mevcut bir yöntemi olmayan PND 7 ila 14 yaş arası hayvanlar için eş zamanlı bir tanımlama ve genotipleme yöntemi sağlamaktır. Rehberli videonun eşlik ettiği mevcut makale, PCR genotiplemesi için yeterli miktarda dokuyu aynı anda tanımlamak ve almak için 7 günlük bir farenin kulağının kulak kepçesi kenarında bir kulak biyopsisinin nasıl yapılacağını göstermektedir. Sekiz farklı biyopsi kombinasyonu vardır ve biri biyopsi içermez ve tek tek fareleri tanımlamak için kullanılabilecek toplam dokuz kulak kepçesi paterni vardır. PND 7 yavrularında çeşitli kulak kepçesi paternlerinin net bir şekilde tanımlanması için başarıyı en üst düzeye çıkarmak için kulak kepçesi biyopsilerinin yapılmasına ilişkin ipuçları daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.

Protokolde belirtilen tüm prosedürler, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu^6'ya uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Massachusetts General Hospital (MGH) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Aşağıda açıklanan tanımlama yöntemi, her iki cinsiyetten C57BL/6NCrl farelerinde^{test edilmiştir 5}. Bu yöntem diğer suşlarda, stoklarda veya transgeniklerde kullanılmamıştır. Pinna biyopsisi tanımlaması, iyileşme kapasitesi artmış fareler için uygun olmayabilir (ör., MRL fare suşu)⁷.

1. Fare yavrusu kısıtlaması

1. Farenin PND 7 veya daha eski olduğundan emin olun. Fare PND 7'den daha gençse, bu PEB yöntemi uygulanabilir olmayabilir.
2. Fareyi, görselleştirmeye ve kulaklara erişime izin verecek şekilde nazikçe tutun. Kullanıcının baskın olmayan eliyle yavruyu kuyruğun tabanından alın ve sabit bir yüzeye aktarın.
3. Kulaklar arasındaki gevşek deri sıkışana kadar baskın elin başparmağı ve işaret parmağı ile yavrunun sırtına hafif bir baskı uygulayın. Başın serbestçe hareket etmemesi için cildi yeterince sıkı bir şekilde sıkıştırın, ancak hayvanın normal nefes aldığından emin olun (Şekil 1).
4. Hayvan sol eliyle tutuluyorsa, yavrunun sağ kulak kepçesini erişilebilir kılacak bir konumda olduğundan emin olun (yani, yavrunun burnu elini tutan kişinin vücudundan uzağa bakmaktadır). Sol kulak kepçesine erişmek için, hayvanın sol tarafı işleyiciye bakacak şekilde elinizi kavrayın.
5. Hayvan sağ eliyle tutuluyorsa, yavrunun sol kulak kepçesini kolayca erişilebilir kılacak bir konumda olduğundan emin olun (yani, yavrunun burnu bakıcının vücudundan uzağa bakmaktadır). Sağ kulak kepçesine erişmek için, hayvanı kavrayan eli, hayvanın sağ tarafı işleyiciye bakacak şekilde sırtüstü yatırın.

2. Kulak kepçesi biyopsi paterni seçimi

1. Sekiz PEB paterni ve bir biyopsi paterni olmayan toplam dokuz desen kullanın (Şekil 2). Bir PEB deseni seçin ve kaydedin.

3. Kulak kepçesi kenarı biyopsisi

1. Her biyopsi için temiz aletler kullanın. Küçük diseksiyon makası veya McPherson-Vannas makası önerilir (bkz. Malzeme Tablosu). Aletlere dezenfektan püskürtün ve her kullanımdan sonra %70 izopropil alkol ile silerek temizleyin.
2. Makası baskın elinizle tutun.
3. Dikey bir PEB oluşturmak için, kulak kepçesinin yan kenarını dikey yönde kesin, böylece toplam kulak^{kepçesinin yaklaşık} 1/4'ü^{ila 1}/3'ü (yani yaklaşık 0,8 mm x 3 mm doku) kulağın yanından çıkarılır (Şekil 3G).
4. Yatay bir PEB oluşturmak için, kulak kepçesinin dorsal kenarını, toplam kulak^{kepçesinin yaklaşık} 1/4^ila 1/3'ü (yani yaklaşık 0,8 mm x 3 mm doku) çıkarılacak şekilde kesin (Şekil 3H). Kesimi düz bir çizgi yerine 45°'lik bir açıyla yapın (Şekil 4). Açı, zaman içinde kulak gelişimini ve büyümesini hesaba katar ve desenin doğası gereği yatay kalmasını sağlar.
   1. Sekiz kulak kepçesi deseni, solda, sağda veya her iki kulak kepçesinde dikey PEB ve yatay PEB'nin bir kombinasyonudur. Aşağıdaki sekiz kulak kepçesi biyopsi modelini yapın: sol dikey (LV), sağ dikey (RV), sol yatay (LH), sağ yatay (RH), sol dikey ve sağ yatay (LVRH), sol ve sağ dikey (LVRV), sol ve sağ yatay (LHRH) ve sol yatay ve sağ dikey (LHRV).
5. Eksize edilen kulak kepçesi dokusunu genotipleme için kullanılacak bir numune kabına dikkatlice bırakmak için ince forseps kullanın.
   1. Beklenmedik bir durumda, kulak kepçesi biyopsi bölgesinden kan toplanırsa, baskın el ile ve hayvan hala kısıtlanmış durumdayken, kanama durana kadar kanama bölgesine baskı uygulamak için bir parça temiz gazlı bez veya pamuklu uçlu bir aplikatör kullanın.
6. Yavruyu barajla birlikte yavaşça kafese geri yerleştirin. PEB bölgesinden daha fazla kanama olup olmadığını değerlendirmek için kafese geri yerleştirildikten sonra yavruları 1-2 dakika gözlemleyin.

Şekil 1, PND 7 farelerini kulakları manipülasyon için görünür olacak şekilde nazikçe kısıtlamanın manuel bir yöntemini göstermektedir. Kısıtlama, tırnağın fazla derisini kavramak için başparmak ve işaret parmağını kullanır. Kavranan deri miktarı hayvanın yaşına bağlıdır ve daha küçük hayvanlarda daha az doku bulunur.

Şekil 2'de listelenen PEB modellerinin PND 63'e kadar tanımlanabilir olduğu test edilmiştir ve anekdot olarak daha uzun süre (yani 2 yıl) sürdüğü görülmüştür. Şekil 3, başlangıçta PND 7'de fotoğraflanan ve PND 63'e kadar takip edilen üç fareyi göstermektedir. Bir yavruda PEB yoktu, ikinci yavruya sol dikey (LV) PEB verildi ve üçüncü yavruda sağ-yatay (RH) PEB vardı. Şekil, bu PEB'lerin PND 63'e kadar bile sağlam olduğunu göstermektedir.

Yatay PEB'ler için, Şekil 4'te gösterildiği gibi, kulak kepçesinin sırt kenarı 45°'lik bir açıyla kesilerek desen daha belirgin hale getirilebilir. Hayvan ve dolayısıyla kulak büyüdükçe, kulak kepçesi kenarı açıyı düzeltecek ve daha belirgin şekilde yatay görünecektir.

PEB'leri değerlendiren orijinal çalışmada, çeşitli klinik ve davranışsal parametreler gözlenmiştir. Şekil 5 , cinsiyete göre farklılaşan çeşitli yaşlardaki ağırlığı göstermektedir (Şekil 5A , dişi fareleri göstermektedir; Şekil 5B , her kombinasyondan bir PEB alan PND 7 yavrularının erkek farelerini^{göstermektedir 5}. PEB almayan yavrular da dahil olmak üzere fareler, yaşlandıkça ağırlıkta önemli bir fark gösterdi.

Şekil 1: PEB konumlandırması için bir PND 7 yavrusunun kısıtlanması. PEB'ler için kulakların kolayca erişilebilir olmasını sağlamak için bir PND 7 fareyi nazikçe sürtmenin temsili görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PND 7 farelerinde dokuz kulak kepçesi tanımlama modelini gösteren çizim. Kulaklardaki kırmızı çizgiler biyopsinin yaklaşık yerlerini gösterir. Bu rakam^5'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Çeşitli zaman noktalarında çeşitli kulak kepçesi desenlerine sahip PND 7 yavrularının temsili görüntüleri. (A, B) Biyopsisi olmayan bir PND 7 yavrusu; (C, D) PND 21'de biyopsisi yapılmamış bir PND 7 yavrusu; (E, F) PND 63'te biyopsi yapılmayan bir PND 7 yavrusu. (G, I, K) Beyaz oklar, sırasıyla PND 7, 21 ve 63'te sol kulak yavrusunda dikey bir PEB bulunan bir PND 7 yavrusunu göstermektedir. (H, J, L) Kırmızı oklar, sırasıyla PND 7, 21 ve 63'te bir PND 7 RH-PEB yavrusunu göstermektedir. Bu rakam^5'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir açıyla biyopsi yapılan yatay PEB paterni. (A) PND 7 yavru sol kulak kepçesi yatay PEB 45°'lik bir açıyla oluşturulur. (B) Aynı hayvan tasvir edilmiştir, ancak şimdi PND 63'tür. Açının artık düzeltildiğini ve PEB'nin daha yatay göründüğünü unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: PND 7, 10, 14, 18, 21, 30 ve 63'te dişi ve erkek yavruların ortalama vücut ağırlıkları. PND 7'den 63'e kadar olan PND 7 yavrularında dişi (kırmızı) ve erkek (mavi) farelerin ortalama vücut ağırlıkları (g) cinsiyete göre çizildi. Ortalamalar bireysel fareler arasında hesaplandı (n = 28 dişi yavru; n = 26 erkek yavru). Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu rakam^5'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mevcut yöntemlere göre önemi
Önceki makaleler, PND 14 hayvanları ve daha gençleri için, kulak kepçelerinin^{küçük boyutu 2,3} nedeniyle manipülasyon için uygun olmayabileceğini belirtmiştir. Kulak delme biyopsileri, kulak çentiği veya kulak küpeleri gibi mevcut kulak tanımlama sistemleri hem tanımlama hem de genotipleme yapabilirken, tanımlama için daha büyük kulak kepçeleri ve dolayısıyla daha yaşlı fareler gerektirebilir. PEB'in bu yeni yöntemi, daha önce tanımlama ve genotipleme yöntemlerine sahip olmayan yaşlardaki hayvanlar için bir tanımlama yöntemi sunmaktadır. Literatürde PND 7 ila 14 hayvanları için daha önce hiçbir yöntem tanımlanmamıştır. Bu nedenle, PEB'ler PND 7 kadar genç bir tanımlama sunar ve toplanan doku genotipleme için kullanılabilir.

Diğer yöntemler, tanımlamaya (örneğin, geçici kuyruk işaretleme, dövme ve transponder implantasyonu) veya genotiplemeye (örneğin, kuyruk biyopsisi) izin verebilir. Bu yöntem, tek bir kısıtlayıcı olayda hem tanımlamaya hem de genotiplemeye izin verir ve bu da hayvan üzerindeki stresi daha da azaltır.

Ayak parmağının kırpılması, genç hayvanların tanımlanması ve genotiplendirilmesi için bir seçenektir 3,8,9,10. Bununla birlikte, yalnızca Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ^6'da açıklandığı gibi, başka hiçbir bireysel tanımlama yönteminin mümkün olmadığı durumlarda kullanılmalıdır. Bu kriter, ayak parmağının kırpılmasının kullanımını sınırlar. Bu tavsiyeye dayanarak, PEB yöntemi, PND 7 veya daha büyük farelerde kullanılabilen ayak parmağı kırpmaya bir alternatiftir.

Şekil 5'te kapsüllenen önceki bir çalışmanın sonuçlarına dayanarak, PEB prosedürü, PEB olmayan fareye kıyasla çeşitli zaman noktalarında ölçülen farelerin ağırlıklarını etkilememiştir. Ek olarak, PND 7 yavrularında herhangi bir zaman noktasında morbidite veya mortalite gözlenmedi. PND 7'de biyopsi yapılan tüm yavrularda PND 10'da süt lekeleri vardı ve baraj reddi gözlenmedi. Bu parametrelere dayanarak, bu prosedür uygun şekilde gerçekleştirildiğinde farelerin büyümesi ve gelişmesi üzerinde iyi huylu bir etkiye sahip gibi görünmektedir.

Tekniğin sınırlamaları
PEB tekniği, yalnızca genotiplemeyi de mümkün kılan sekiz tanımlama kombinasyonuna izin verir. Dokuzuncu patern olan biyopsi yok paterni, doku temin edilmediği için genotiplemeye izin vermez. Bu nedenle, sunulan ek dokuz kombinasyonu desteklemek için başka tanımlama yöntemlerinin kullanılması gerekebilir. Ek PEB'ler eklenebilir. Örneğin, bir kulak kepçesi üzerinde dorsal ve yatay biyopsi yapılması altı ekstra kombinasyon ekleyebilir. Bu, toplam 15 kombinasyon sağlayacaktır. Ancak, bu modeller gerçekleştirilmemiş veya test edilmemiştir.

PEB'ler PND 63'e kadar görünür ve ayrı ayrı ayırt edilebilirdi. PND 63'ten sonra resmi olarak izlenmese de, fareler kolonide 2 yıla kadar tutuldu ve anekdot olarak, PEB modelleri hala sağlamdı.

PEB modelleri sadece C57BL / 6NCrl farelerinde test edildi. Diğer kulak tanımlama tekniklerinde olduğu gibi, yara iyileşme kabiliyeti artmış fareler bu teknik için uygun olmayacaktır⁷.

Protokol içindeki kritik adımlar
Pina'nın görselleştirilmesine izin veren sağlam ama nazik bir kısıtlamanın sağlanması, uygun PEB uygulaması için çok önemlidir. PND 7 hayvanlarının, PND 21 hayvanlarına kıyasla kısıtlama sırasında ve biyopsi sırasında daha az mücadele ettiği kaydedildi⁵. Yatay kombinasyonlar için, fare yaşlandıkça yatay PEB'lerin yatay görünmesini sağlamak için dilimi Şekil 4'te gösterildiği gibi 45° açıyla gerçekleştirmek çok önemlidir.

Değişiklikler ve sorun giderme
PEB'lerin etkinliğini test eden orijinal çalışmada, genel olarak, PND 7 farelerinde en az 0.8 mm x 3 mm kulak kepçesi biyopsisi yapıldığı keşfedilmiştir⁵. Fare yaşlandıkça PEB paterninin tanımlanmasını sağlamak için, kulak kepçesinden mümkün olduğunca maksimum miktarda doku alınması önerilir.

Gelecekteki uygulamalar
PEB tekniği sadece C57BL / 6Crl farelerinde test edildi, ancak bu uygulama test edilirse diğer fare suşlarında veya stoklarında da kullanılabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, daha büyük litrelere sahip barajlar için daha fazla tanımlama modeli eklemek için daha fazla PEB modeli tanımlanabilir. Son olarak, bu yöntem, diğer tanımlama tekniklerini (örneğin, kulak yumruğu) gerçekleştirmiş deneyimli bir fare işleyicisi tarafından test edildi ve gerçekleştirildi. Fare kullanımı konusunda daha az deneyimli olanlar için bu yöntemin kolaylığını test etmek için daha fazla çalışma geliştirilebilir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Yazarlar, bu çalışmadaki orijinal makalenin yazarları Dr. Lori S Palley ve Donna M Jarrell'e katkılarından dolayı teşekkür eder.