用耳廓边缘活检鉴定断奶前 7 日龄小鼠

该方案提出了一种新的逐步方法，用于在出生后第 7 天 （PND） 7 小鼠中产生耳廓边缘活检 （PEB），以进行鉴定和同步基因分型。

小鼠的鉴定和基因分型通常是许多 体内 科学研究的重要组成部分。已经描述了几种用于断奶小鼠鉴定和基因分型的方法;然而，迄今为止，针对断奶前小鼠描述的技术要少得多。耳廓边缘活检 （PEB） 是一种识别方法，随后使用组织进行基因分型。本文介绍并提供了有关出生后 （PND） 7 小鼠 PEB 逐步方法的视频说明。概述了耳廓活检位置和技术的八种不同模式，这些模式已被证明可以持续到成年以进行识别。本文还讨论了优化 PEB 的方法，并展示了该技术对幼崽生长发育的良性影响，在整个研究过程中，所有小鼠都表现出适当的体重增加，没有任何发病率或死亡率。这项技术将为研究人员提供一种在几乎没有识别和基因分型方法可用的年龄进行小鼠识别的方法。

在某些科学研究中，识别和同时对小鼠进行基因分型的方法可能至关重要。使用小鼠模型时，已经开发了几种常用的方法来同时对动物进行基因分型和识别（例如，打耳、耳标），以及其他仅识别动物的方法（例如，纹身、皮下应答器植入、标记物或染料应用）或仅对动物进行基因分型（例如，尾部活检）^1,2.这些技术中的大多数都是在脱机时进行的。在较年轻的断奶前动物中同时识别和基因分型的技术较少 1,2,3,4。

为了帮助需要对年轻小鼠进行鉴定和基因分型的工作，进行了一项研究，以验证 PEB 是 PND 7 幼崽的可靠鉴定和基因分型方法，并将其与 PND 21⁵ 断奶小鼠中使用 PEB 进行比较。正如这项研究所详述的，之所以选择水平和垂直耳廓切片，是因为先前使用 PND 7 幼崽尸体的研究发现，使用 PEB 创建的耳廓图案清晰、快速，提供多种图案组合，可识别，并且组织易于去除⁵。还探索了其他方法，例如打耳和耳槽，但 PND 7 幼崽上没有足够的表面积来创建完整的圆形打孔或缺口。这项初步工作导致参考研究在活体 PND 7 小鼠中测试这些模式⁵。这项研究表明，从耳廓活检中检索到的组织大小可用于成功的基因分型。无论在 PND 7 或 PND 21⁵ 对耳廓进行活检时，小鼠的 PND 63 的 PEB 模式也完好无损。

该技术开发的目标是为 PND 7 至 14 岁的动物提供一种同步鉴定和基因分型方法，根据目前的文献，这些动物没有可用的方法。本文附有指导视频，说明了如何在 7 天小鼠耳朵的耳廓边缘进行耳活检，以同时识别和检索足够数量的组织进行 PCR 基因分型。有八种不同的活检组合和一种无活检的组合，总共有九种耳廓模式可用于识别个体小鼠。进一步讨论了进行耳廓活检的技巧，以最大限度地提高 PND 7 幼崽中各种耳廓模式的成功率。

协议中概述的所有程序均按照 NIH 实验动物护理和使用指南⁶ 执行，并经马萨诸塞州总医院 （MGH） 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。以下描述的鉴定方法已在两性的 C57BL/6NCrl 小鼠中进行了测试⁵。该方法尚未用于其他菌株、原种或转基因。耳廓活检鉴定可能不适用于愈合能力增加的小鼠（例如 MRL 小鼠品系）⁷。

1. 老鼠幼崽约束

1. 确保鼠标为 PND 7 或更低版本。如果鼠标小于 PND 7，则这种 PEB 方法可能不可行。
2. 以允许可视化和接触耳朵的方式轻轻地抑制鼠标。用使用者的非惯用手抓住幼崽的尾巴根部，并将其转移到稳定的表面上。
3. 用惯用手的拇指和食指沿着幼犬的背部轻轻按压，直到可以捏住耳朵之间松弛的皮肤。将皮肤捏得足够紧，使头部不能自由移动，但要确保动物呼吸正常（图 1）。
4. 如果用左手束缚动物，请确保幼犬处于可触及右耳廓的位置（即，幼犬的鼻子背对着手的身体）。要接触到左耳廓，请旋后抓握的手，使动物的左侧面向驯兽师。
5. 如果用右手束缚动物，请确保幼犬处于使左耳廓易于触及的位置（即，幼犬的鼻子背对着训练员的身体）。要进入右耳廓，请旋后抓住动物的手，使动物的右侧面向驯兽师。

2. 耳廓活检模式的选择

1. 总共使用九种模式，其中八种 PEB 模式和一种无活检模式（图 2）。选择并记录 PEB 模式。

3. 耳廓边缘活检

1. 每次活检使用干净的器械。建议使用小解剖剪刀或 McPherson-Vannas 剪刀（见 材料表）。每次使用后，用消毒剂喷洒器械并用 70% 异丙醇擦拭干净。
2. 用惯用手握住剪刀。
3. 要创建垂直 PEB，沿垂直方向修剪耳廓的外侧边缘，以便从耳朵侧面去除大约 1/4^至 1/3 的总耳廓（即约 0.8 毫米 x 3 毫米组织）（图 3G）。
4. 要创建水平 PEB，请修剪耳廓的背侧边缘，以便去除总耳^廓的大约 1/^{4 至 1}/3（即约 0.8 毫米 x 3 毫米组织）（图 3H）。以 45° 角而不是直线进行切割（图 4）。这个角度考虑了耳朵随着时间的推移而发育和生长，并确保模式在本质上保持水平。
   1. 八种耳廓图案是左侧、右侧或两个耳廓上的垂直 PEB 和水平 PEB 的组合。制作以下八种耳廓活检模式：左垂直 （LV）、右垂直 （RV）、左水平 （LH）、右水平 （RH）、左垂直和右水平 （LVRH）、左和右垂直 （LVRV）、左和右水平 （LHRH）和左水平和右垂直 （LHRV）。
5. 使用细镊子小心地将切除的耳廓组织放入样品容器中，用于基因分型。
   1. 如果万一血液从耳廓活检部位淤积，用惯用手，当动物仍然被束缚时，使用一块干净的纱布或棉签涂抹器对出血部位施加压力，直到出血停止。
6. 将幼犬轻轻地放回带有母乳的笼子中。将幼崽放回笼子后观察幼崽 1-2 分钟，以评估 PEB 部位是否有任何进一步的出血。

图 1 说明了一种轻轻抑制 PND 7 小鼠的手动方法，以便可以看到它们的耳朵以供作。约束装置使用拇指和食指抓住 scruff 的多余皮肤。抓握的皮肤量取决于动物的年龄，较小的动物可用的组织较少。

图 2 中列出的 PEB 模式已经过测试，可在 PND 63 之前识别，并且据传闻持续时间更长（即 2 年）。图 3 显示了最初在 PND 7 拍摄的三只小鼠，然后一直拍摄到 PND 63。一只幼崽没有 PEB，第二只幼崽接受了左垂直 （LV） PEB，第三只幼崽接受了右水平 （RH） PEB。该图显示，这些 PEB 在 PND 63 之前仍然完好无损。

对于水平 PEB，通过将耳廓的背缘切成 45° 角，可以使图案更加明显，如图 4 所示。随着动物和耳朵的生长，耳廓边缘会校正角度并显得更明显地水平。

在评估 PEB 的原始研究中，观察到各种临床和行为参数。 图 5 显示了不同年龄的体重，按性别区分（图 5A 显示了雌性小鼠; 图 5B 显示了雄性小鼠）的 PND 7 幼崽，这些幼崽接受了每个组合⁵ 的 PEB。小鼠，包括未接受 PEB 的幼崽，随着年龄的增长，体重表现出显着差异。

图 1：约束 PND 7 幼崽以进行 PEB 定位。 轻轻擦伤 PND 7 鼠标以确保 PEB 可以轻松触及耳朵的代表性图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：显示 PND 7 小鼠的 9 种耳廓识别模式的插图。 耳朵上的红线表示活检的大致位置。此数字已从⁵ 修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：在不同时间点具有各种耳廓图案的 PND 7 幼崽的代表性图像。 （A、B） 未进行活检的 PND 7 幼崽;（C， D） PND 7 幼崽，未在 PND 21 上进行活检;（E， F） PND 7 幼崽，未在 PND 63 上进行活检。（G、I、K）白色箭头分别在 PND 7、21 和 63 上显示了 PND 7 幼崽，左耳幼崽上有垂直 PEB。（H、J、L）红色箭头分别显示 PND 7、21 和 63 上的 PND 7 RH-PEB 幼崽。此数字已从⁵ 修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：以一定角度活检的水平 PEB 模式。 （A） PND 7 幼崽左耳廓水平 PEB 以 45° 角创建。（B） 描绘了同一只动物，但现在是 PND 63。请注意，角度现在已更正，PEB 看起来更水平。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：PND 7、10、14、18、21、30 和 63 时雌性和雄性幼崽的平均体重。 按性别绘制 PND 7 至 63 幼仔中雌性（红色）和雄性（蓝色）小鼠的平均体重 （g）。计算单只小鼠的平均值 （n = 28 只雌性幼崽;n = 26 只雄性幼崽）。误差线表示 SEM。此数字已从⁵ 修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

相对于现有方法的重要性
以前的文章指出，对于 PND 14 及更年轻的动物，它们的耳廓可能由于体积小而不适合作 ^2,3。虽然现有的耳识别系统（如耳穿刺活检、耳槽或耳标）可以同时进行识别和基因分型，但它们可能需要更大的耳廓，因此需要年长的小鼠进行识别。这种新颖的 PEB 方法为以前没有识别和基因分型方法的年龄的动物提供了一种鉴定方法。以前在文献中没有描述过动物 PND 7 至 14 的方法。因此，PEB 可提供低至 PND 7 的鉴定，并且收集的组织可用于基因分型。

其他方法可能允许进行鉴定（例如，临时尾部标记、纹身和应答器植入）或基因分型（例如，尾部活检）。这种方法允许在一个约束事件中同时进行鉴定和基因分型，从而进一步减轻了对动物的压力。

剪趾是幼年动物鉴定和基因分型的一种选择 3,8,9,10。但是，只有在没有其他个体识别方法可行的情况下才应使用它，如《实验动物护理和使用指南^》6 中所述。此标准限制了脚趾剪裁的使用。基于这一建议，PEB 方法是夹脚的替代方法，可用于 PND 7 或更老的小鼠。

根据图 5 中封装的先前研究的结果，与无 PEB 小鼠相比，PEB 程序不会影响在不同时间点测量的小鼠的体重。此外，在任何时间点均未观察到 PND 7 幼崽的发病率或死亡率。所有在 PND 7 上活检的幼仔在 PND 10 上都有奶点，并且没有观察到母细胞排斥反应。基于这些参数，如果执行得当，该程序似乎对小鼠的生长发育有良性影响。

该技术的局限性
PEB 技术只允许 8 种鉴定组合，这些组合也支持基因分型。第九种模式，即无活检模式，由于没有获得组织，因此不允许进行基因分型。因此，可能需要使用其他身份识别方法来补充所提供的额外 9 种组合。可以添加其他 PEB。例如，对一个耳廓进行背侧活检和水平活检可以增加 6 种额外的组合。这将提供总共 15 种组合。但是，这些模式尚未执行或测试。

PEB 是可见的，并且可以单独区分，直到 PND 63。虽然在 PND 63 后没有正式监测，但小鼠在菌落中保存长达 2 年，并且有趣的是，PEB 模式仍然完好无损。

PEB 模式仅在 C57BL/6NCrl 小鼠中进行了测试。与其他耳朵识别技术一样，伤口愈合能力增强的小鼠不适合这种技术⁷。

协议中的关键步骤
确保牢固但温和的约束，以便看到松果，这对于正确执行 PEB 至关重要。与 PND 21 动物相比，PND 7 动物在约束和活检期间的挣扎较少⁵。对于水平组合，以 45° 角执行切片至关重要，如图 4 所示，以确保水平 PEB 随着小鼠年龄的增长而呈水平水平。

修改和故障排除
在测试 PEB 疗效的原始研究中，发现通常，在 PND 7 小鼠中至少活检 0.8 毫米 x 3 毫米的耳廓⁵。为了确保随着小鼠年龄的增长识别 PEB 模式，建议尽可能从耳廓中取出最大量的组织。

未来的应用
PEB 技术仅在 C57BL/6Crl 小鼠中进行了测试，但如果经过测试，此应用也可用于其他小鼠品系或原种。如前所述，可以识别进一步的 PEB 模式，以便为具有较大垃圾的母坝添加更多识别模式。最后，该方法由经验丰富的小鼠处理人员进行测试和执行，该处理人员执行过其他识别技术（例如，打耳）。可以开发进一步的研究来测试这种方法对小鼠处理经验不足的人的易用性。

作者没有任何可披露的内容。

作者要感谢本文原始论文的作者 Lori S Palley 博士和 Donna M Jarrell 博士的贡献。