Identificazione di topi di 7 giorni pre-svezzamento con biopsie del bordo del padiglione auricolare

Il protocollo presenta un nuovo approccio graduale alla produzione di una biopsia del bordo del padiglione auricolare (PEB) in 7 topi del giorno post-natale (PND) ai fini dell'identificazione e della genotipizzazione simultanea.

L'identificazione e la genotipizzazione dei topi è spesso una parte essenziale di molti studi scientifici in vivo . Sono stati descritti diversi metodi per l'identificazione e la genotipizzazione nei topi svezzati; Tuttavia, ad oggi, ci sono molte meno tecniche descritte per i topi pre-svezzamento. La biopsia del bordo del padiglione auricolare (PEB) è un metodo di identificazione con successivo utilizzo del tessuto per la genotipizzazione. Questo articolo descrive e fornisce istruzioni video su un approccio graduale alla PEB su 7 topi del giorno post-natale (PND). Vengono delineati otto diversi modelli di localizzazione e tecnica della biopsia del padiglione auricolare che hanno dimostrato di durare fino all'età adulta per l'identificazione. Questo articolo discute anche i modi per ottimizzare il PEB e mostra l'effetto benigno che questa tecnica ha sulla crescita e lo sviluppo dei cuccioli, con tutti i topi che mostrano un adeguato aumento di peso senza alcuna morbilità o mortalità durante lo studio. Questa tecnica fornirà ai ricercatori un metodo per l'identificazione dei topi in un'età in cui sono disponibili pochi metodi di identificazione e genotipizzazione.

In alcuni studi scientifici, il metodo per identificare e contemporaneamente genotipizzare un topo può essere cruciale. Quando si utilizza un modello murino, esistono diversi metodi di uso comune che sono stati sviluppati per genotipizzare e identificare gli animali allo stesso tempo (ad esempio, punzonatura dell'orecchio, marcatura auricolare) e altri metodi che identificano solo gli animali (ad esempio, tatuaggio, impianto di transponder sottocutaneo, applicazione di marcatori o coloranti) o solo animali genotipici (ad esempio, biopsia della coda)^1,2. La maggior parte di queste tecniche sono destinate ad essere eseguite al momento dello svezzamento. Le tecniche per identificare e genotipizzare simultaneamente negli animali più giovani prima dello svezzamento sono inferiori 1,2,3,4.

Per aiutare il lavoro che richiede l'identificazione e la genotipizzazione dei topi in età più giovane, è stato condotto uno studio per convalidare il PEB come metodo di identificazione e genotipizzazione affidabile per i cuccioli di PND 7 e confrontarlo con l'uso di PEB nei topi svezzati a PND 21⁵. Come descritto in dettaglio in questo studio, sono state selezionate fette di padiglioni auricolari orizzontali e verticali perché uno studio precedente che utilizzava carcasse di cuccioli PND 7 ha rilevato che i modelli di padiglioni auricolari creati utilizzando PEB erano chiari, veloci, fornivano una varietà di combinazioni di modelli, identificabili e il tessuto era facile da rimuovere⁵. Sono stati esplorati anche altri metodi, come i punzoni per le orecchie e le tacche per le orecchie, ma non c'era abbastanza superficie sui cuccioli di PND 7 per la creazione di punzoni o tacche circolari complete. Questo lavoro preliminare ha portato lo studio di riferimento a testare questi modelli in topi vivi PND 7⁵. Questo studio ha dimostrato che la dimensione del tessuto recuperata dalla biopsia del padiglione auricolare può essere utilizzata per una genotipizzazione di successo. I modelli PEB erano intatti anche nei topi di età pari a PND 63, indipendentemente da quando il padiglione auricolare è stato sottoposto a biopsia a PND 7 o PND 21⁵.

L'obiettivo dello sviluppo di questa tecnica è quello di fornire un metodo di identificazione e genotipizzazione simultanea per animali di età compresa tra 7 e 14 anni che, secondo la letteratura attuale, non hanno un metodo disponibile. Il presente articolo, accompagnato dal video guidato, illustra come eseguire una biopsia dell'orecchio auricolare sul bordo del padiglione auricolare dell'orecchio di un topo di 7 giorni per identificare e recuperare contemporaneamente una quantità sufficiente di tessuto per la genotipizzazione PCR. Ci sono otto diverse combinazioni di biopsia e una senza biopsia per un totale di nove modelli di padiglioni auricolari disponibili per l'uso per identificare i singoli topi. Vengono ulteriormente discussi i suggerimenti per l'esecuzione di biopsie del padiglione auricolare per massimizzare il successo per la chiara identificazione dei vari modelli di padiglione auricolare nei cuccioli di PND 7.

Tutte le procedure descritte nel protocollo sono state eseguite in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio⁶ e approvate dal Massachusetts General Hospital (MGH) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Il metodo di identificazione descritto di seguito è stato testato in topi C57BL/6NCrl di entrambi i sessi⁵. Questo metodo non è stato utilizzato in altri ceppi, ceppi o transgenici. L'identificazione della biopsia del padiglione auricolare potrebbe non essere adatta per i topi che hanno una maggiore capacità di guarigione (ad esempio, ceppo di topo MRL)⁷.

1. Contenimento del cucciolo di topo

1. Assicurati che il mouse sia PND 7 o precedente. Se il topo è più giovane di PND 7, questo metodo PEB potrebbe non essere fattibile.
2. Trattenere delicatamente il mouse in modo da consentire la visualizzazione e l'accesso alle orecchie. Raccogli il cucciolo per la base della coda con la mano non dominante dell'utente e trasferiscilo su una superficie stabile.
3. Applicare una leggera pressione lungo la schiena del cucciolo con il pollice e l'indice della mano dominante fino a quando la pelle flaccida tra le orecchie può essere pizzicata. Pizzicare la pelle abbastanza forte in modo che la testa non si muova liberamente, ma assicurarsi che l'animale respiri normalmente (Figura 1).
4. Se l'animale viene trattenuto con la mano sinistra, assicurati che il cucciolo sia in una posizione che renda accessibile il padiglione auricolare destro (cioè, il naso del cucciolo è rivolto lontano dal corpo della mano). Per accedere al padiglione auricolare sinistro, supinare la mano che afferra in modo che il lato sinistro dell'animale sia rivolto verso il conduttore.
5. Se l'animale viene trattenuto con la mano destra, assicurati che il cucciolo sia in una posizione che renda facilmente accessibile il padiglione auricolare sinistro (ad esempio, il naso del cucciolo è rivolto lontano dal corpo del conduttore). Per accedere al padiglione auricolare destro, supinare la mano che afferra l'animale in modo che il lato destro dell'animale sia rivolto verso il conduttore.

2. Selezione del modello di biopsia del padiglione auricolare

1. Utilizzare un totale di nove modelli con otto modelli PEB e un modello senza biopsia (Figura 2). Selezionare e registrare un modello PEB.

3. Biopsia del bordo del padiglione auricolare

1. Utilizzare strumenti puliti per ogni biopsia. Si consigliano piccole forbici da dissezione o forbici McPherson-Vannas (vedi Tabella dei materiali). Spruzzare gli strumenti con disinfettanti e pulire con alcol isopropilico al 70% dopo ogni utilizzo.
2. Tieni le forbici con la mano dominante.
3. Per creare un PEB verticale, tagliare il bordo laterale del padiglione auricolare in direzione verticale in modo che circa 1/^{4 a 1} /^{3 del padiglione} auricolare totale (cioè circa 0,8 mm x 3 mm di tessuto) venga rimosso dal lato dell'orecchio (Figura 3G).
4. Per creare un PEB orizzontale, tagliare il bordo dorsale del padiglione auricolare in modo da rimuovere circa 1/^{4 a 1} /^{3 del padiglione} auricolare totale (cioè circa 0,8 mm x 3 mm di tessuto) (Figura 3H). Eseguire il taglio con un angolo di 45° anziché in linea retta (Figura 4). L'angolo tiene conto dello sviluppo e della crescita dell'orecchio nel tempo e assicura che il modello rimanga di natura orizzontale.
   1. Gli otto modelli di padiglioni auricolari sono una combinazione del PEB verticale e del PEB orizzontale a sinistra, a destra o su entrambi i padiglioni auricolari. Eseguire i seguenti otto modelli di biopsia del padiglione auricolare: verticale sinistro (LV), verticale destro (RV), orizzontale sinistro (LH), orizzontale destro (RH), verticale sinistro e orizzontale destro (LVRH), verticale sinistro e destro (LVRV), orizzontale sinistro e destro (LHRH) e orizzontale sinistro e verticale destro (LHRV).
5. Utilizzare una pinza fine per depositare con cura il tessuto del padiglione auricolare asportato in un contenitore per campioni da utilizzare per la genotipizzazione.
   1. Se, nell'improbabile eventualità che il sangue si accumuli dal sito della biopsia del padiglione auricolare, con la mano dominante e mentre l'animale è ancora trattenuto, utilizzare un pezzo di garza pulita o un applicatore di cotton fioc per esercitare pressione sul sito di sanguinamento fino a quando l'emorragia non si ferma.
6. Rimetti delicatamente il cucciolo nella gabbia con la madre. Osservare i cuccioli per 1-2 minuti dopo essere stati rimessi nella gabbia per valutare eventuali ulteriori sanguinamenti dal sito PEB.

La Figura 1 illustra un metodo manuale per trattenere delicatamente i topi PND 7 in modo che le loro orecchie siano visibili per la manipolazione. La contenzione utilizza il pollice e l'indice per afferrare la pelle in eccesso della collottola. La quantità di pelle afferrata dipende dall'età dell'animale, con meno tessuto disponibile negli animali più piccoli.

I modelli PEB elencati nella Figura 2 sono stati testati per essere identificabili fino a PND 63 e aneddoticamente è stato visto durare più a lungo (cioè 2 anni). La Figura 3 mostra tre topi fotografati inizialmente a PND 7 e seguiti fino a PND 63. Un cucciolo non aveva un PEB, il secondo cucciolo ha ricevuto un PEB verticale sinistro (LV) e il terzo cucciolo aveva un PEB orizzontale destro (RH). La figura mostra che questi PEB sono intatti anche fino a PND 63.

Per i PEB orizzontali, il motivo può essere reso più evidente tagliando il bordo dorsale del padiglione auricolare con un angolo di 45°, come mostrato nella Figura 4. Man mano che l'animale e quindi l'orecchio cresce, il bordo del padiglione auricolare correggerà l'angolo e apparirà più notevolmente orizzontale.

Nello studio originale che ha valutato i PEP, sono stati osservati vari parametri clinici e comportamentali. La Figura 5 mostra il peso a varie età, differenziato per sesso (la Figura 5A mostra topi femmine; La Figura 5B mostra i topi maschi) di cuccioli di PND 7 che hanno ricevuto un PEB di ogni combinazione⁵. I topi, compresi i cuccioli che non hanno ricevuto un PEB, hanno mostrato una differenza significativa di peso con l'avanzare dell'età.

Figura 1: Trattenimento di un cucciolo di PND 7 per il posizionamento PEB. Immagine rappresentativa di un leggero graffio di un mouse PND 7 per garantire che le orecchie siano facilmente accessibili per i PEB. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione che mostra i nove modelli di identificazione dei padiglioni auricolari sui topi PND 7. Le linee rosse sulle orecchie indicano le posizioni approssimative della biopsia. Questa cifra è stata modificata da⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative di cuccioli di PND 7 con vari modelli di padiglioni auricolari in vari punti temporali. (A, B) Un cucciolo di PND 7 senza biopsia; (C, D) un cucciolo di PND 7 senza biopsia su PND 21; (E, F) un cucciolo di PND 7 senza biopsia su PND 63. (G, I, K) Le frecce bianche mostrano un cucciolo PND 7 con un PEB verticale sul cucciolo dell'orecchio sinistro rispettivamente su PND 7, 21 e 63. (H, J, L) Le frecce rosse mostrano un cucciolo PND 7 RH-PEB rispettivamente su PND 7, 21 e 63. Questa cifra è stata modificata da⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Pattern PEB orizzontale biopsia ad angolo. (A) PND 7 pup pin PEB orizzontale del padiglione sinistro viene creato con un angolo di 45°. (B) È raffigurato lo stesso animale, ma ora è PND 63. Si noti che l'angolo è stato corretto e il PEB appare più orizzontale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Peso corporeo medio di cuccioli femmine e maschi a PND 7, 10, 14, 18, 21, 30 e 63. I pesi corporei medi (g) delle femmine (rosso) e dei maschi (blu) nei cuccioli di PND 7 da PND 7 a 63 sono stati tracciati in base al sesso. Le medie sono state calcolate tra i singoli topi (n = 28 cuccioli femmine; n = 26 cuccioli maschi). Le barre di errore rappresentano il SEM. Questa cifra è stata modificata da⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Importanza rispetto ai metodi esistenti
Articoli precedenti hanno affermato che per gli animali PND 14 e più giovani, il loro padiglione auricolare potrebbe non essere adatto alla manipolazione a causa delle piccole dimensioni ^2,3. Mentre i sistemi di identificazione dell'orecchio esistenti come le biopsie con punzone auricolare, l'intaglio dell'orecchio o i marchi auricolari possono eseguire sia l'identificazione che la genotipizzazione, possono richiedere padiglioni auricolari più grandi e, quindi, topi più anziani per l'identificazione. Questo nuovo metodo di PEB offre un metodo di identificazione per animali di età che in precedenza non disponevano di metodi di identificazione e genotipizzazione. In letteratura non sono stati descritti metodi precedenti per animali con PND da 7 a 14. Pertanto, i PEB offrono l'identificazione di giovani come PND 7 e il tessuto raccolto può essere utilizzato per la genotipizzazione.

Altri metodi possono consentire l'identificazione (ad esempio, marcatura temporanea della coda, tatuaggio e impianto di transponder) o la genotipizzazione (ad esempio, biopsia della coda). Questo metodo consente sia l'identificazione che la genotipizzazione in un solo evento di contenzione, riducendo ulteriormente lo stress sull'animale.

Il tosatura delle dita dei piedi è un'opzione per l'identificazione e la genotipizzazione di animali giovani 3,8,9,10. Tuttavia, dovrebbe essere utilizzato solo quando non è possibile utilizzare altri metodi di identificazione individuale, come descritto nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio ⁶. Questo criterio limita l'uso del taglio delle dita. Sulla base di questa raccomandazione, il metodo PEB è un'alternativa al taglio delle dita dei piedi che può essere utilizzato nei topi PND 7 o più vecchi.

Sulla base dei risultati di uno studio precedente incapsulato nella Figura 5, la procedura PEB non ha influenzato i pesi dei topi misurati in vari punti temporali rispetto al topo senza PEP. Inoltre, non è stata osservata morbilità o mortalità nei cuccioli di PND 7 in nessun momento. Tutti i cuccioli che sono stati sottoposti a biopsia su PND 7 avevano macchie di latte su PND 10 e non è stato osservato rigetto della madre. Sulla base di questi parametri, questa procedura sembra avere un effetto benigno sulla crescita e lo sviluppo dei topi se eseguita in modo appropriato.

Limiti della tecnica
La tecnica PEB consente solo otto combinazioni di identificazione che consentono anche la genotipizzazione. Il nono modello, il modello senza biopsia, non consente la genotipizzazione in quanto non viene prelevato alcun tessuto. Pertanto, potrebbe essere necessario utilizzare altri metodi di identificazione per integrare le nove combinazioni aggiuntive offerte. È possibile aggiungere ulteriori PEB. Ad esempio, avere una biopsia dorsale e una orizzontale su un padiglione auricolare può aggiungere sei combinazioni extra. Ciò fornirebbe un totale di 15 combinazioni. Tuttavia, questi modelli non sono stati eseguiti né testati.

I PEB erano visibili e distinguibili individualmente fino a PND 63. Sebbene non fossero stati formalmente monitorati dopo la PND 63, i topi sono stati tenuti nella colonia per un massimo di 2 anni e, aneddoticamente, i modelli PEB erano ancora intatti.

I modelli PEB sono stati testati solo nei topi C57BL/6NCrl. Come con altre tecniche di identificazione dell'orecchio, i topi con una maggiore capacità di guarigione delle ferite non sarebbero adatti per questa tecnica⁷.

Passaggi critici all'interno del protocollo
Garantire un contenimento fermo ma delicato che consenta la visualizzazione della pina è essenziale per una corretta esecuzione del PEB. È stato notato che gli animali PND 7 faticavano meno durante la contenzione e durante la biopsia rispetto agli animali PND 21⁵. Per le combinazioni orizzontali, è fondamentale eseguire la fetta con un angolo di 45°, come illustrato nella Figura 4, per garantire che i PEB orizzontali appaiano orizzontali man mano che il mouse invecchia.

Modifiche e risoluzione dei problemi
Nello studio originale che ha testato l'efficacia dei PEB, è stato scoperto che generalmente, almeno 0,8 mm x 3 mm del padiglione auricolare sono stati sottoposti a biopsia nei topi PND 7⁵. Per garantire l'identificazione del modello PEB con l'avanzare dell'età del topo, si raccomanda di prelevare la massima quantità di tessuto dal padiglione auricolare.

Applicazioni future
La tecnica PEB è stata testata solo nei topi C57BL/6Crl, ma questa applicazione potrebbe essere utilizzata anche in altri ceppi o ceppi di topi, se testata. Come accennato in precedenza, è possibile identificare ulteriori modelli di PEB per aggiungere ulteriori modelli di identificazione per le dighe con lettiere più grandi. Infine, questo metodo è stato testato ed eseguito da un conduttore di topi esperto che ha eseguito altre tecniche di identificazione (ad esempio, punch all'orecchio). Ulteriori studi potrebbero essere sviluppati per testare la facilità di questo metodo per coloro che sono meno esperti nella manipolazione dei topi.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori desiderano ringraziare le dottoresse Lori S Palley e Donna M Jarrell, autrici dell'articolo originale di questo lavoro, per i loro contributi.