Identifizierung von 7 Tage alten Mäusen vor dem Absetzen mit Pinna-Edge-Biopsien

Das Protokoll stellt einen neuartigen schrittweisen Ansatz zur Herstellung einer Pinna-Edge-Biopsie (PEB) bei Mäusen nach dem geburtlichen Tag (PND) 7 zum Zwecke der Identifizierung und gleichzeitigen Genotypisierung dar.

Die Identifizierung und Genotypisierung von Mäusen ist oft ein wesentlicher Bestandteil vieler wissenschaftlicher In-vivo-Studien . Es wurden mehrere Methoden zur Identifizierung und Genotypisierung bei entwöhnten Mäusen beschrieben; Bisher gibt es jedoch weitaus weniger Techniken, die für Mäuse vor der Entwöhnung beschrieben wurden. Die Pinna-Edge-Biopsie (PEB) ist eine Methode zur Identifizierung mit anschließender Verwendung von Gewebe für die Genotypisierung. Dieser Artikel beschreibt und bietet eine Videoanleitung zu einem schrittweisen Ansatz für PEB an 7 Mäusen am postnatalen Tag (PND). Es werden acht verschiedene Muster der Lokalisation und Technik der Ohrmuschelbiopsie skizziert, von denen gezeigt wurde, dass sie bis ins Erwachsenenalter zur Identifizierung erhalten bleiben. In diesem Artikel werden auch Möglichkeiten zur Optimierung des PEB erörtert und die gutartige Wirkung dieser Technik auf das Wachstum und die Entwicklung der Jungtiere gezeigt, wobei alle Mäuse während der gesamten Studie eine angemessene Gewichtszunahme ohne Morbidität oder Mortalität zeigten. Diese Technik wird den Forschern eine Methode zur Identifizierung von Mäusen in einem Alter an die Hand geben, in dem nur wenige Identifizierungs- und Genotypisierungsmethoden zur Verfügung stehen.

In bestimmten wissenschaftlichen Studien kann die Methode zur Identifizierung und gleichzeitigen Genotypisierung einer Maus entscheidend sein. Bei der Verwendung eines Mausmodells gibt es mehrere häufig verwendete Methoden, die entwickelt wurden, um Tiere gleichzeitig zu genotypisieren und zu identifizieren (z. B. Ohrstanzung, Ohrmarkierung), und andere Methoden, die nur Tiere identifizieren (z. B. Tätowierung, subkutane Transponderimplantation, Marker- oder Farbstoffapplikation) oder nur Tiere genotypisieren (z. B. Schwanzbiopsie)^1,2. Die meisten dieser Techniken sollen zum Zeitpunkt der Entwöhnung durchgeführt werden. Es gibt weniger Techniken zur gleichzeitigen Identifizierung und Genotypisierung bei jüngeren Tieren vor dem Absetzen 1,2,3,4.

Um die Arbeit zu unterstützen, die die Identifizierung und Genotypisierung von Mäusen in jüngeren Jahren erfordert, wurde eine Studie durchgeführt, um PEB als zuverlässige Identifizierungs- und Genotypisierungsmethode für PND 7-Jungtiere zu validieren und mit der Verwendung von PEB bei Mäusen zu vergleichen, die bei PND 21⁵ entwöhnt wurden. Wie in dieser Studie detailliert beschrieben, wurden horizontale und vertikale Ohrmuschelscheiben ausgewählt, da eine frühere Studie mit PND 7-Jungtierkörpern ergab, dass die mit PEB erstellten Ohrmuschelmuster klar und schnell waren, eine Vielzahl von Musterkombinationen boten, identifizierbar waren und das Gewebe leicht zu entfernen war⁵. Andere Methoden, wie z. B. Ohrstanzen und Ohrkerben, wurden ebenfalls untersucht, aber es gab nicht genügend Oberfläche auf PND 7 Welpen, um vollständige kreisförmige Stanzen oder Kerben zu erzeugen. Diese Vorarbeiten führten dazu, dass die referenzierte Studie diese Muster an lebenden PND 7-Mäusen testete⁵. Diese Studie zeigte, dass die Gewebegröße, die aus der Biopsie der Ohrmuschel gewonnen wurde, für eine erfolgreiche Genotypisierung verwendet werden kann. Die PEB-Muster waren auch als Mäuse im Alter von PND 63 intakt, unabhängig davon, wann die Ohrmuschel bei PND 7 oder PND 21⁵ biopsiert wurde.

Das Ziel bei der Entwicklung dieser Technik ist es, eine gleichzeitige Identifizierungs- und Genotypisierungsmethode für Tiere im Alter von PND 7 bis 14 Jahren bereitzustellen, für die nach aktuellem Literaturstand keine Methode zur Verfügung steht. Der aktuelle Artikel, begleitet von dem geführten Video, zeigt, wie eine Ohrbiopsie am Ohr einer 7 Tage alten Maus durchgeführt wird, um gleichzeitig eine ausreichende Menge an Gewebe für die PCR-Genotypisierung zu identifizieren und zu gewinnen. Es gibt acht verschiedene Biopsiekombinationen und eine ohne Biopsie für insgesamt neun Ohrmuschelmuster, die zur Identifizierung einzelner Mäuse verwendet werden können. Tipps zur Durchführung von Ohrmuschel-Biopsien werden weiter diskutiert, um den Erfolg bei der eindeutigen Identifizierung der verschiedenen Ohrmuschelmuster bei PND 7-Welpen zu maximieren.

Alle im Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren⁶ durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital (MGH) genehmigt. Die unten beschriebene Identifizierungsmethode wurde an C57BL/6NCrl-Mäusen beider Geschlechter getestet⁵. Diese Methode wurde bei anderen Stämmen, Stammtieren oder Transgenen nicht angewendet. Die Identifizierung der Pinna-Biopsie ist möglicherweise nicht für Mäuse geeignet, die eine erhöhte Heilungskapazität aufweisen (z. B. MRL-Mausstamm)⁷.

1. Zurückhaltung von Mäusewelpen

1. Stellen Sie sicher, dass die Maus PND 7 oder älter ist. Wenn die Maus jünger als PND 7 ist, ist diese PEB-Methode möglicherweise nicht durchführbar.
2. Halten Sie die Maus vorsichtig so fest, dass sie sichtbar ist und Zugang zu den Ohren hat. Nehmen Sie den Welpen mit der nicht dominanten Hand des Benutzers an der Basis des Schwanzes auf und setzen Sie ihn auf eine stabile Oberfläche.
3. Üben Sie mit dem Daumen und Zeigefinger der dominanten Hand sanften Druck auf den Rücken des Welpen aus, bis die lose Haut zwischen den Ohren eingeklemmt werden kann. Kneifen Sie die Haut fest genug zusammen, damit sich der Kopf nicht frei bewegen kann, aber stellen Sie sicher, dass das Tier normal atmet (Abbildung 1).
4. Wenn das Tier mit der linken Hand fixiert wird, stellen Sie sicher, dass sich der Welpe in einer Position befindet, die die rechte Ohrmuschel zugänglich macht (d. h. die Nase des Welpen zeigt vom Körper des Handers weg). Um an die linke Ohrmuschel zu gelangen, supinieren Sie den Handgriff, so dass die linke Seite des Tieres dem Führer zugewandt ist.
5. Wenn das Tier mit der rechten Hand fixiert wird, stellen Sie sicher, dass sich der Welpe in einer Position befindet, die die linke Ohrmuschel leicht zugänglich macht (d. h. die Nase des Welpen zeigt vom Körper des Hundeführers weg). Um an die rechte Ohrmuschel zu gelangen, supinieren Sie die Hand, die das Tier greift, so, dass die rechte Seite des Tieres dem Führer zugewandt ist.

2. Auswahl des Ohrmuschel-Biopsiemusters

1. Verwenden Sie insgesamt neun Muster mit acht PEB-Mustern und einem No-Biopsie-Muster (Abbildung 2). Wählen Sie ein PEB-Muster aus und zeichnen Sie es auf.

3. Biopsie an der Ohrmuschelkante

1. Verwenden Sie für jede Biopsie saubere Instrumente. Empfohlen wird eine kleine Sezierschere oder eine McPherson-Vannas-Schere (siehe Materialtabelle). Sprühen Sie die Instrumente mit Desinfektionsmitteln ein und wischen Sie sie nach jedem Gebrauch mit 70%igem Isopropylalkohol ab.
2. Halten Sie die Schere mit der dominanten Hand.
3. Um eine vertikale PEB zu erzeugen, schneiden Sie den lateralen Rand der Ohrmuschel in vertikaler Richtung ab, so dass etwa 1/^{4 bis 1} /^{3 der gesamten} Ohrmuscheln (d. h. etwa 0,8 mm x 3 mm Gewebe) von der Seite des Ohrs entfernt wird (Abbildung 3G).
4. Um einen horizontalen PEB zu erstellen, schneiden Sie den dorsalen Rand der Ohrmuschel so ab, dass etwa 1/^{4 bis 1} /^{3 der gesamten} Ohrmuschel (d. h. etwa 0,8 mm x 3 mm Gewebe) entfernt wird (Abbildung 3H). Führen Sie den Schnitt in einem Winkel von 45° statt einer geraden Linie aus (Abbildung 4). Der Winkel berücksichtigt die Entwicklung und das Wachstum der Ohren im Laufe der Zeit und stellt sicher, dass das Muster horizontal bleibt.
   1. Die acht Ohrmuschelmuster sind eine Kombination aus dem vertikalen PEB und dem horizontalen PEB auf der linken, rechten oder beiden Ohrmuscheln. Führen Sie die folgenden acht Ohrmuschel-Biopsiemuster durch: links vertikal (LV), rechts vertikal (RV), links horizontal (LH), rechts horizontal (RH), links vertikal und rechts horizontal (LVRH), links und rechts vertikal (LVRV), links und rechts horizontal (LHRH) und links horizontal und rechts vertikal (LHRV).
5. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das herausgeschnittene Ohrmuschelgewebe vorsichtig in ein Probengefäß zu legen, das für die Genotypisierung verwendet wird.
   1. Wenn sich in dem unwahrscheinlichen Fall, dass sich Blut aus der Ohrmuschel-Biopsiestelle ansammelt, mit der dominanten Hand und während das Tier noch fixiert ist, verwenden Sie ein Stück saubere Gaze oder einen Wattestäbchenapplikator, um Druck auf die Blutungsstelle auszuüben, bis die Blutung aufhört.
6. Setzen Sie den Welpen vorsichtig wieder in den Käfig mit der Hündin ein. Beobachten Sie die Welpen 1-2 Minuten lang, nachdem Sie sie wieder in den Käfig gesetzt haben, um zu beurteilen, ob es zu weiteren Blutungen an der PEB-Stelle kommt.

Abbildung 1 zeigt eine manuelle Methode, bei der PND 7-Mäuse sanft zurückgehalten werden, so dass ihre Ohren für die Manipulation sichtbar sind. Die Fessel greift mit Daumen und Zeigefinger die überschüssige Haut des Genicks. Die Menge der erfassten Haut hängt vom Alter des Tieres ab, wobei bei kleineren Tieren weniger Gewebe zur Verfügung steht.

Die in Abbildung 2 aufgeführten PEB-Muster wurden bis zu PND 63 auf ihre Identifizierbarkeit getestet und es wurde anekdotisch festgestellt, dass sie länger (d. h. 2 Jahre) halten. Abbildung 3 zeigt drei Mäuse, die zunächst bei PND 7 fotografiert und bis PND 63 verfolgt wurden. Ein Welpe hatte keinen PEB, der zweite Welpe einen linksvertikalen (LV) PEB und der dritte Welpe einen rechtshorizontalen (RH) PEB. Die Abbildung zeigt, dass diese PEBs sogar bis PND 63 intakt sind.

Bei horizontalen PEBs kann das Muster deutlicher gemacht werden, indem die dorsale Kante der Ohrmuschel in einem 45°-Winkel geschnitten wird, wie in Abbildung 4 gezeigt. Wenn das Tier und damit das Ohr wächst, korrigiert die Ohrmuschelkante den Winkel und erscheint deutlicher horizontal.

In der ursprünglichen Studie, in der die PEBs untersucht wurden, wurden verschiedene klinische und Verhaltensparameter beobachtet. Abbildung 5 zeigt das Gewicht in verschiedenen Altersstufen, differenziert nach Geschlecht (Abbildung 5A zeigt weibliche Mäuse; Abbildung 5B zeigt männliche Mäuse) von PND 7 Welpen, die einen PEB jeder Kombination^{erhielten 5}. Mäuse, einschließlich der Jungen, die keinen PEB erhielten, zeigten mit zunehmendem Alter einen signifikanten Gewichtsunterschied.

Abbildung 1: Fixieren eines PND 7 Welpen für die PEB-Positionierung. Repräsentatives Bild des sanften Abreibens einer PND 7-Maus, um sicherzustellen, dass die Ohren für die PEBs leicht zugänglich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Abbildung der neun Ohrmuscheln an PND 7 Mäusen. Die roten Linien an den Ohren zeigen die ungefähren Orte der Biopsie an. Diese Zahl wurde von⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder von PND 7 Jungtieren mit unterschiedlichen Ohrmuschelmustern zu verschiedenen Zeitpunkten. (A, B) Ein PND 7 Junges ohne Biopsie; (C, D) ein PND 7-Welpe ohne Biopsie auf PND 21; (E, F) ein PND 7 Welpen ohne Biopsie auf PND 63. (G, I, K) Weiße Pfeile zeigen einen PND 7-Welpen mit einem vertikalen PEB auf dem linken Ohr-Welpen auf PND 7, 21 bzw. 63. (H, J, L) Rote Pfeile zeigen ein PND 7 RH-PEB-Welpen auf PND 7, 21 bzw. 63. Diese Zahl wurde von⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Horizontales PEB-Muster, das in einem Winkel von 45° biopsiert wurde. (A) PND 7 pup linker Ohrmuschel horizontales PEB wird in einem Winkel von 45° erstellt. (B) Das gleiche Tier ist abgebildet, aber jetzt ist es PND 63. Beachten Sie, dass der Winkel jetzt korrigiert wurde und das PEB horizontaler erscheint. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Mittleres Körpergewicht von weiblichen und männlichen Jungtieren bei PND 7, 10, 14, 18, 21, 30 und 63. Das mittlere Körpergewicht (g) von weiblichen (rot) und männlichen (blau) Mäusen bei PND 7-Jungtieren von PND 7 bis 63 wurde nach Geschlecht aufgetragen. Die Mittelwerte wurden für einzelne Mäuse berechnet (n = 28 weibliche Jungtiere; n = 26 männliche Jungtiere). Fehlerbalken stellen SEM dar. Diese Zahl wurde von⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
In früheren Artikeln wurde darauf hingewiesen, dass bei Tieren mit PND 14 und jünger die Ohrmuschel aufgrund der geringen Größe ^2,3 möglicherweise nicht für die Manipulation geeignet ist. Während bestehende Ohridentifikationssysteme wie Ohrlochbiopsien, Ohrkerben oder Ohrmarken sowohl die Identifizierung als auch die Genotypisierung durchführen können, können sie für die Identifizierung größere Ohrmuscheln und damit ältere Mäuse erfordern. Diese neuartige PEB-Methode bietet eine Identifizierungsmethode für Tiere in einem Alter, für das bisher keine Identifizierungs- und Genotypisierungsmethoden zur Verfügung standen. Für die Tiere PND 7 bis 14 wurden bisher keine Methoden in der Literatur beschrieben. Somit ermöglichen PEBs eine Identifizierung bereits ab PND 7, und das entnommene Gewebe kann für die Genotypisierung verwendet werden.

Andere Verfahren können eine Identifizierung (z. B. vorübergehende Schwanzmarkierung, Tätowierung und Transponderimplantation) oder eine Genotypisierung (z. B. Schwanzbiopsie) ermöglichen. Diese Methode ermöglicht sowohl die Identifizierung als auch die Genotypisierung in nur einem Fixierungsereignis, was den Stress für das Tier weiter reduziert.

Das Zehenkürzen ist eine Option zur Identifizierung und Genotypisierung von Jungtieren 3,8,9,10. Sie sollte jedoch nur verwendet werden, wenn keine andere individuelle Identifizierungsmethode durchführbar ist, wie im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren ⁶ beschrieben. Dieses Kriterium schränkt die Verwendung von Zehenschnitten ein. Basierend auf dieser Empfehlung ist die PEB-Methode eine Alternative zum Zehenclipping, die bei Mäusen ab PND 7 angewendet werden kann.

Basierend auf den Ergebnissen einer früheren Studie, die in Abbildung 5 eingekapselt ist, hatte das PEB-Verfahren keinen Einfluss auf die Gewichte der Mäuse, die zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen wurden, im Vergleich zur Maus ohne PEB. Darüber hinaus wurde bei den PND 7-Welpen zu keinem Zeitpunkt eine Morbidität oder Mortalität beobachtet. Alle Jungtiere, die an PND 7 biopsiert wurden, wiesen Milchflecken an PND 10 auf, und eine Abstoßung der Hündin wurde nicht beobachtet. Basierend auf diesen Parametern scheint dieses Verfahren bei sachgemäßer Anwendung einen gutartigen Effekt auf das Wachstum und die Entwicklung von Mäusen zu haben.

Grenzen der Technik
Die PEB-Technik erlaubt nur acht Identifizierungskombinationen, die auch eine Genotypisierung ermöglichen. Das neunte Muster, das Muster ohne Biopsie, erlaubt keine Genotypisierung, da kein Gewebe gewonnen wird. Daher müssen möglicherweise andere Identifizierungsmethoden verwendet werden, um die zusätzlich angebotenen neun Kombinationen zu ergänzen. Zusätzliche PEBs können hinzugefügt werden. Zum Beispiel kann eine dorsale und eine horizontale Biopsie an einer Ohrmuschel sechs zusätzliche Kombinationen hinzufügen. Dies würde insgesamt 15 Kombinationen ergeben. Diese Muster wurden jedoch weder durchgeführt noch getestet.

Die PEBs waren bis PND 63 sichtbar und individuell unterscheidbar. Obwohl die Mäuse nach PND 63 nicht formell überwacht wurden, wurden sie bis zu 2 Jahre in der Kolonie gehalten, und anekdotisch waren die PEB-Muster noch intakt.

PEB-Muster wurden nur an C57BL/6NCrl-Mäusen getestet. Wie bei anderen Techniken zur Ohrbestimmung wären Mäuse mit erhöhter Wundheilungsfähigkeit für diese Technik nicht geeignet⁷.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Die Gewährleistung einer festen, aber sanften Fixierung, die eine Visualisierung der Pina ermöglicht, ist für eine ordnungsgemäße PEB-Ausführung unerlässlich. Es wurde festgestellt, dass PND 7-Tiere während der Fixierung und während der Biopsie weniger Probleme hatten als PND 21-Tiere⁵. Bei den horizontalen Kombinationen ist es wichtig, den Slice im 45°-Winkel auszuführen, wie in Abbildung 4 dargestellt, um sicherzustellen, dass die horizontalen PEBs mit zunehmendem Alter der Maus horizontal erscheinen.

Modifikationen und Fehlerbehebung
In der ursprünglichen Studie, in der die Wirksamkeit von PEBs getestet wurde, wurde festgestellt, dass im Allgemeinen mindestens 0,8 mm x 3 mm der Ohrmuschel bei PND 7-Mäusen biopsiert wurden⁵. Um die Identifizierung des PEB-Musters mit zunehmendem Alter der Maus zu gewährleisten, wird empfohlen, so viel Gewebe wie möglich aus der Ohrmuschel zu entnehmen.

Zukünftige Anwendungen
Die PEB-Technik wurde nur an C57BL/6Crl-Mäusen getestet, aber diese Anwendung könnte auch in anderen Mausstämmen oder -stämmen eingesetzt werden, wenn sie getestet wird. Wie bereits erwähnt, können weitere PEB-Muster identifiziert werden, um weitere Identifizierungsmuster für Dämme mit größeren Würfen hinzuzufügen. Schließlich wurde diese Methode von einem erfahrenen Maushandler getestet und durchgeführt, der bereits andere Identifikationstechniken (z. B. Ohrstanz) durchgeführt hat. Weitere Studien könnten entwickelt werden, um die Einfachheit dieser Methode für diejenigen zu testen, die weniger Erfahrung im Umgang mit der Maus haben.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Autoren danken Dr. Lori S. Palley und Dr. Donna M. Jarrell, den Autoren des ursprünglichen Artikels in dieser Arbeit, für ihre Beiträge.