Identificación de ratones de 7 días de edad antes del destete con biopsias de borde auricular

El protocolo presenta un nuevo enfoque escalonado para producir una biopsia del borde del pabellón auricular (PEB) en 7 ratones después del día natal (PND) con el fin de identificarlo y genotiparlo simultáneamente.

La identificación y el genotipado de ratones suele ser una parte esencial de muchos estudios científicos in vivo . Se han descrito varios métodos para la identificación y el genotipado en ratones destetados; Sin embargo, hasta la fecha, hay muchas menos técnicas descritas para ratones pre-destete. La biopsia del borde auricular (PEB) es un método de identificación con el uso posterior de tejido para el genotipado. Este artículo describe y proporciona instrucciones en video sobre un enfoque escalonado de PEB en el día postnatal (PND) en 7 ratones. Se describen ocho patrones diferentes de ubicación y técnica de biopsia del pabellón auricular que se han demostrado que se mantienen hasta la edad adulta para su identificación. Este artículo también discute las formas de optimizar el PEB y muestra el efecto benigno que esta técnica tiene en el crecimiento y desarrollo de las crías, con todos los ratones mostrando un aumento de peso adecuado sin ninguna morbilidad o mortalidad durante todo el estudio. Esta técnica proporcionará a los investigadores un método para la identificación de ratones a una edad en la que hay pocos métodos de identificación y genotipado disponibles.

En ciertos estudios científicos, el método para identificar y genotipar simultáneamente a un ratón puede ser crucial. Cuando se utiliza un modelo de ratón, se han desarrollado varios métodos de uso común para genotipar e identificar animales al mismo tiempo (p. ej., punzonado en las orejas, marcaje en las orejas) y otros métodos que solo identifican a los animales (p. ej., tatuajes, implantación de transpondedores subcutáneos, aplicación de marcadores o tintes) o solo animales genotípicos (p. ej., biopsia de cola)^1,2. La mayoría de estas técnicas están pensadas para ser realizadas en el momento del destete. Las técnicas para identificar y genotipar simultáneamente en animales más jóvenes, antes del destete, son menos 1,2,3,4.

Para ayudar en el trabajo que requiere la identificación y el genotipado de ratones a edades más tempranas, se realizó un estudio para validar el PEB como un método confiable de identificación y genotipado para las crías de PND 7 y compararlo con el uso de PEB en ratones destetados en PND 21⁵. Como se detalla en este estudio, se seleccionaron cortes de pabellón auricular horizontales y verticales porque un estudio previo con canales de cachorros de PND 7 encontró que los patrones de pabellón auricular creados con PEB eran claros, rápidos, proporcionaban una variedad de combinaciones de patrones, identificables y el tejido era fácil de eliminar⁵. También se exploraron otros métodos, como los punzones en las orejas y las muescas en las orejas, pero no había suficiente superficie en las crías de PND 7 para la creación de punzones o muescas circulares completas. Este trabajo preliminar llevó al estudio referenciado a probar estos patrones en ratones PND 7 vivos⁵. Este estudio demostró que el tamaño del tejido recuperado de la biopsia del pabellón auricular se puede utilizar para un genotipado exitoso. Los patrones de PEB también estaban intactos cuando los ratones tenían hasta PND 63, independientemente de cuándo se realizó la biopsia del pabellón auricular en PND 7 o PND 21⁵.

El objetivo del desarrollo de esta técnica es proporcionar un método simultáneo de identificación y genotipado para animales de 7 a 14 años de edad PND que, según la literatura actual, no cuentan con un método disponible. El presente artículo, acompañado del vídeo guiado, ilustra cómo realizar una biopsia de oreja en el borde del pabellón auricular de un ratón de 7 días para identificar y recuperar simultáneamente una cantidad suficiente de tejido para el genotipado por PCR. Hay ocho combinaciones de biopsia diferentes y una sin biopsia para un total de nueve patrones de pabellón auricular disponibles para su uso en la identificación de ratones individuales. Los consejos sobre la realización de biopsias de pabellón auricular se discuten más a fondo para maximizar el éxito para la identificación clara de los diversos patrones de pabellón auricular en cachorros de PND 7.

Todos los procedimientos descritos en el protocolo se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio⁶ y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts (MGH). El método de identificación descrito a continuación ha sido probado en ratones C57BL/6NCrl de ambos sexos⁵. Este método no se ha utilizado en otras cepas, cepas o transgénicos. La identificación de la biopsia del pabellón auricular puede no ser adecuada para los ratones que tienen una mayor capacidad de curación (p. ej., cepa de ratón MRL)⁷.

1. Restricción de cachorros de ratón

1. Asegúrese de que el mouse sea PND 7 o anterior. Si el ratón es menor que PND 7, es posible que este método PEB no sea factible.
2. Sujete suavemente el mouse de una manera que permita la visualización y el acceso a los oídos. Levante al cachorro por la base de la cola con la mano no dominante del usuario y transfiéralo a una superficie estable.
3. Aplique una presión suave a lo largo de la espalda del cachorro con el pulgar y el índice de la mano dominante hasta que se pueda pellizcar la piel suelta entre las orejas. Apriete la piel lo suficientemente fuerte para que la cabeza no se mueva libremente, pero asegúrese de que el animal respire normalmente (Figura 1).
4. Si el animal está siendo sujetado con la mano izquierda, asegúrese de que el cachorro esté en una posición que haga que el pabellón auricular derecho sea accesible (es decir, la nariz del cachorro esté de espaldas al cuerpo de la persona que lo entrega). Para acceder al pabellón auricular izquierdo, supine el agarre de la mano de modo que el lado izquierdo del animal mire hacia el guía.
5. Si el animal está siendo sujetado con la mano derecha, asegúrese de que el cachorro esté en una posición que haga que el pabellón auricular izquierdo sea fácilmente accesible (es decir, la nariz del cachorro esté en dirección opuesta al cuerpo del cuidador). Para acceder al pabellón auricular derecho, supine la mano que agarra al animal de modo que el lado derecho del animal mire hacia el guía.

2. Selección del patrón de biopsia del pabellón auricular

1. Utilice un total de nueve patrones con ocho patrones de PEB y un patrón sin biopsia (Figura 2). Seleccione y registre un patrón PEB.

3. Biopsia del borde auricular

1. Use instrumentos limpios para cada biopsia. Se recomiendan tijeras de disección pequeñas o tijeras McPherson-Vannas (ver Tabla de Materiales). Rocíe los instrumentos con desinfectantes y limpie con alcohol isopropílico al 70% después de cada uso.
2. Sostén las tijeras con la mano dominante.
3. Para crear un PEB vertical, recorte el borde lateral del pabellón auricular en dirección vertical de modo que aproximadamente 1/^{4 a 1}/3 del pabellón auricular total (es decir, aproximadamente 0,8 mm x 3 mm de tejido) se elimine del lado de la oreja (Figura 3G).
4. Para crear un PEB horizontal, recorte el borde dorsal del pabellón auricular de modo que se elimine aproximadamente de 1/^{4 a 1} /^{3 del pabellón} auricular total (es decir, aproximadamente 0,8 mm x 3 mm de tejido) (Figura 3H). Haga el corte en un ángulo de 45° en lugar de una línea recta (Figura 4). El ángulo tiene en cuenta el desarrollo y crecimiento de la oreja a lo largo del tiempo y asegura que el patrón permanezca horizontal por naturaleza.
   1. Los ocho patrones de pabellón auricular son una combinación del PEB vertical y el PEB horizontal a la izquierda, a la derecha o a ambos. Realice los siguientes ocho patrones de biopsia del pabellón auricular: vertical izquierdo (LV), vertical derecho (RV), horizontal izquierdo (LH), horizontal derecho (RH), vertical izquierdo y horizontal derecho (LVRH), vertical izquierdo y derecho (LVRV), horizontal izquierdo y derecho (LHRH) y horizontal izquierdo y vertical derecho (LHRV).
5. Utilice pinzas finas para depositar cuidadosamente el tejido del pabellón auricular extirpado en un recipiente de muestra que se utilizará para el genotipado.
   1. Si en el improbable caso de que la sangre se acumule en el sitio de la biopsia del pabellón auricular, con la mano dominante y mientras el animal aún está sujeto, use un trozo de gasa limpia o un aplicador de punta de algodón para ejercer presión en el sitio del sangrado hasta que el sangrado se detenga.
6. Coloque al cachorro suavemente en la jaula con la madre. Observe a las crías durante 1-2 minutos después de colocarlas de nuevo en la jaula para evaluar si hay más sangrado en el sitio de la PEB.

La Figura 1 ilustra un método manual para sujetar suavemente a ratones PND 7 para que sus orejas sean visibles para la manipulación. La sujeción utiliza el pulgar y el índice para agarrar el exceso de piel del pescuezo. La cantidad de piel agarrada depende de la edad del animal, con menos tejido disponible en los animales más pequeños.

Se ha probado que los patrones de PEB enumerados en la Figura 2 son identificables hasta PND 63 y, anecdóticamente, se ha visto que duran más tiempo (es decir, 2 años). La Figura 3 muestra tres ratones fotografiados inicialmente en el PND 7 y seguidos hasta el PND 63. Un cachorro no tenía un PEB, el segundo cachorro recibió un PEB vertical a la izquierda (LV) y el tercer cachorro tenía un PEB horizontal a la derecha (RH). La figura muestra que estos PEB están intactos incluso hasta PND 63.

En el caso de los PEB horizontales, el patrón se puede hacer más evidente cortando el borde dorsal del pabellón auricular en un ángulo de 45°, como se muestra en la Figura 4. A medida que el animal y, por lo tanto, la oreja crecen, el borde del pabellón auricular corregirá el ángulo y aparecerá más notablemente horizontal.

En el estudio original que evaluó los PEBs, se observaron diversos parámetros clínicos y conductuales. En la Figura 5 se muestra el peso a distintas edades, diferenciado por sexo (en la Figura 5A se muestran ratones hembra; La Figura 5B muestra ratones machos) de crías de PND 7 que recibieron un PEB de cada combinación⁵. Los ratones, incluidos los cachorros que no recibieron un PEB, mostraron una diferencia significativa en el peso a medida que envejecían.

Figura 1: Sujeción de un cachorro PND 7 para el posicionamiento de PEB. Imagen representativa de un ratón PND 7 raspando suavemente para garantizar que las orejas sean fácilmente accesibles para los PEB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ilustración que muestra los nueve patrones de identificación del pabellón auricular en ratones PND 7. Las líneas rojas en las orejas indican las ubicaciones aproximadas de la biopsia. Esta cifra ha sido modificada de⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de crías de PND 7 con varios patrones de pabellón auricular en varios puntos de tiempo. (A, B) Un cachorro de PND 7 sin biopsia; (C, D) un cachorro de PND 7 sin biopsia en PND 21; (E, F) un cachorro de PND 7 sin biopsia en PND 63. (G, I, K) Las flechas blancas muestran un cachorro de PND 7 con un PEB vertical en el cachorro de la oreja izquierda en PND 7, 21 y 63, respectivamente. (H, J, L) Las flechas rojas muestran un cachorro PND 7 RH-PEB en PND 7, 21 y 63, respectivamente. Esta cifra ha sido modificada de⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Patrón horizontal de PEB biopsiado en ángulo. (A) Se crea el pabellón inferior izquierdo de la pup PND 7 en un ángulo de 45°. (B) Se representa el mismo animal, pero ahora es PND 63. Tenga en cuenta que el ángulo ahora se ha corregido y el PEB parece más horizontal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Peso corporal medio de las crías hembras y machos en PND 7, 10, 14, 18, 21, 30 y 63. Los pesos corporales medios (g) de ratones hembra (rojo) y macho (azul) en crías de PND 7 de PND 7 a 63 se graficaron por sexo. Se calcularon las medias en ratones individuales (n = 28 cachorros hembras; n = 26 cachorros machos). Las barras de error representan SEM. Esta cifra ha sido modificada de⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Importancia con respecto a los métodos existentes
En artículos anteriores se ha indicado que en el caso de los animales con PND 14 y más jóvenes, su pabellón auricular puede no ser adecuado para la manipulación debido a su pequeño tamaño ^2,3. Si bien los sistemas de identificación de orejas existentes, como las biopsias con punción de orejas, las muescas en las orejas o los crotales pueden realizar tanto la identificación como el genotipado, es posible que requieran pinnas más grandes y, por lo tanto, ratones más viejos para su identificación. Este novedoso método de PEB ofrece un método de identificación para animales a edades que anteriormente no disponían de métodos de identificación y genotipado. No se han descrito métodos previamente en la literatura para animales PND 7 a 14. Por lo tanto, los PEB ofrecen una identificación tan temprana como PND 7, y el tejido recolectado se puede utilizar para el genotipado.

Otros métodos pueden permitir la identificación (p. ej., marcación temporal de la cola, tatuajes e implantación de transpondedores) o el genotipado (p. ej., biopsia de cola). Este método permite tanto la identificación como el genotipado en un solo evento de restricción, lo que reduce aún más el estrés en el animal.

El corte de dedos del pie es una opción para la identificación y genotipado de animales jóvenes 3,8,9,10. Sin embargo, sólo debe utilizarse cuando no sea factible otro método de identificación individual, como se describe en la Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio ⁶. Este criterio limita el uso del corte de dedos de los pies. Con base en esta recomendación, el método PEB es una alternativa al corte de dedos que se puede utilizar en ratones PND 7 o mayores.

Con base en los resultados de un estudio previo que se encapsula en la Figura 5, el procedimiento PEB no afectó los pesos de los ratones medidos en varios puntos de tiempo en comparación con el ratón sin PEB. Además, no se observó morbilidad ni mortalidad en las crías de PND 7 en ningún momento. Todas las crías a las que se les realizó una biopsia en PND 7 tenían manchas de leche en PND 10 y no se observó rechazo de la madre. Sobre la base de estos parámetros, este procedimiento parece tener un efecto benigno sobre el crecimiento y desarrollo de los ratones cuando se realiza adecuadamente.

Limitaciones de la técnica
La técnica PEB solo permite ocho combinaciones de identificación que también permiten el genotipado. El noveno patrón, el patrón sin biopsia, no permite el genotipado ya que no se obtiene tejido. Por lo tanto, puede ser necesario utilizar otros métodos de identificación para complementar las nueve combinaciones adicionales ofrecidas. Se pueden agregar PEB adicionales. Por ejemplo, tener una biopsia dorsal y una biopsia horizontal en un pabellón auricular puede agregar seis combinaciones adicionales. Esto proporcionaría un total de 15 combinaciones. Sin embargo, esos patrones no se han realizado ni probado.

Los PEB eran visibles y distinguibles individualmente hasta el PND 63. Si bien no se monitoreó formalmente después de PND 63, los ratones se mantuvieron en la colonia hasta por 2 años y, anecdóticamente, los patrones de PEB aún estaban intactos.

Los patrones de PEB solo se probaron en ratones C57BL/6NCrl. Al igual que con otras técnicas de identificación de orejas, los ratones con mayor capacidad de cicatrización de heridas no serían adecuados para esta técnica⁷.

Pasos críticos dentro del protocolo
Asegurar una sujeción firme pero suave que permita la visualización de la piña es esencial para la correcta ejecución del PEB. Se observó que los animales PND 7 lucharon menos durante la inmovilización y durante la biopsia en comparación con los animales PND 21⁵. Para las combinaciones horizontales, es fundamental realizar el corte en un ángulo de 45°, como se muestra en la Figura 4, para garantizar que los PEB horizontales parezcan horizontales a medida que el mouse envejece.

Modificaciones y solución de problemas
En el estudio original que probó la eficacia de los PEB, se descubrió que, en general, se biopsiaron al menos 0,8 mm x 3 mm del pabellón auricular en ratones PND 7⁵. Para asegurar la identificación del patrón de PEB a medida que el ratón envejece, se recomienda tomar la máxima cantidad de tejido del pabellón auricular como sea posible.

Aplicaciones futuras
La técnica PEB solo se probó en ratones C57BL/6Crl, pero esta aplicación también podría usarse en otras cepas o poblaciones de ratones si se prueba. Como se mencionó anteriormente, se pueden identificar patrones adicionales de PEB para agregar más patrones de identificación para presas con camadas más grandes. Finalmente, este método fue probado y realizado por un manipulador de ratón experimentado que ha realizado otras técnicas de identificación (por ejemplo, puñetazo en la oreja). Se podrían desarrollar más estudios para probar la facilidad de este método para aquellos que tienen menos experiencia en el manejo del mouse.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean agradecer a las Dras. Lori S Palley y Donna M Jarrell, autoras del artículo original de este trabajo, por sus contribuciones.