Pinna Edge 생검을 사용한 젖을 뗀 7일 전 마우스 식별

이 프로토콜은 식별 및 동시 유전형 분석을 위해 PND(Post-Natal Day) 7 마우스에서 귓바퀴 가장자리 생검(PEB)을 생성하는 새로운 단계적 접근 방식을 제시합니다.

마우스의 식별 및 유전형 분석은 종종 많은 생체 내 과학 연구에서 필수적인 부분입니다. 젖을 뗀 마우스에서 식별 및 유전형 분석을 위해 여러 가지 방법이 설명되었습니다. 그러나 현재까지 젖을 뗀 쥐에 대해 설명된 기술은 훨씬 적습니다. Pinna Edge Biopsy(PEB)는 유전형 분석을 위해 조직을 이후에 사용하는 식별 방법입니다. 이 문서에서는 PND(Post-Natal Day) 7 마우스에서 PEB에 대한 단계적 접근 방식에 대한 비디오 지침을 설명하고 제공합니다. 귓바퀴 생검의 8가지 다른 패턴, 위치 및 기술이 요약되어 있으며, 이는 식별을 위해 성인기까지 지속되는 것으로 나타났습니다. 이 기사는 또한 PEB를 최적화하는 방법에 대해 논의하고 이 기술이 새끼의 성장과 발달에 미치는 양성 효과를 보여주며, 모든 마우스는 연구 전반에 걸쳐 이환율이나 사망률 없이 적절한 체중 증가를 보여줍니다. 이 기술은 사용할 수 있는 식별 및 유전형 분석 방법이 거의 없는 연령에서 쥐 식별 방법을 조사자에게 제공할 것입니다.

특정 과학 연구에서는 마우스를 식별하고 동시에 유전형을 분석하는 방법이 중요할 수 있습니다. 마우스 모델을 사용할 때 동물의 유전형과 식별을 동시에 위해 개발된 몇 가지 일반적으로 사용되는 방법(예: 귀 펀칭, 귀 태깅)과 동물만 식별하는 방법(예: 문신, 피하 트랜스폰더 이식, 마커 또는 염료 적용) 또는 유전자형 동물만 식별하는 방법(예: 꼬리 생^검)1,2. 이러한 기술의 대부분은 이유식에 수행하도록 되어 있습니다. 젖을 뗀 지 않는 어린 동물에서 유전자형을 동시에 확인하는 기술은 더 적다 1,2,3,4.

어린 나이에 생쥐를 식별하고 유전형 분석을 수행해야 하는 작업을 지원하기 위해 PEB를 PND 7 새끼에 대한 신뢰할 수 있는 식별 및 유전형 분석 방법으로 검증하고 PND 21⁵에서 젖을 뗀 마우스에서 PEB를 사용하는 것과 비교하기 위한 연구가 수행되었습니다. 본 연구에서 자세히 설명하듯이, PND 7 새끼 사체를 사용한 선행 연구에서 PEB를 사용하여 생성된 귓바퀴 패턴이 명확하고 빠르며 다양한 패턴 조합을 제공하고 식별 가능하며 조직을 쉽게 제거할 수 있다는 사실이 밝혀졌기 때문에 수평 및 수직 귓바퀴 절편을 선택했습니다⁵. 귀 펀치 및 귀 노치와 같은 다른 방법도 탐색되었지만 PND 7 새끼에는 완전한 원형 펀치 또는 노치를 만들기에 충분한 표면적이 없었습니다. 이 예비 연구는 참조 된 연구로 이어졌으며 살아있는 PND 7 마우스⁵에서 이러한 패턴을 테스트했습니다. 이 연구는 귓바퀴의 생검에서 추출한 조직 크기가 성공적인 유전형 분석에 사용될 수 있음을 보여주었습니다. PEB 패턴은 PND 7 또는 PND 21⁵에서 귓바퀴를 생검한 시기에 관계없이 PND 63으로 숙성된 마우스에서도 손상되지 않았습니다.

이 기술의 개발 목표는 현재 문헌에 따르면 사용 가능한 방법이 없는 PND 7에서 14세 사이의 동물에 대한 동시 식별 및 유전형 분석 방법을 제공하는 것입니다. 안내 비디오와 함께 제공되는 현재 기사는 7일 된 쥐의 귀 귓바퀴 가장자리에서 귀 생검을 수행하여 PCR 유전형 분석을 위한 충분한 양의 조직을 동시에 식별하고 회수하는 방법을 보여줍니다. 8가지 생검 조합이 있으며 생검이 없는 조합은 총 9개의 귓바퀴 패턴에 대해 개별 마우스를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. PND 7 새끼에서 다양한 귓바퀴 패턴을 명확하게 식별하기 위한 성공을 극대화하기 위해 귓바퀴 생검 수행에 대한 팁에 대한 팁이 추가로 논의됩니다.

프로토콜에 요약된 모든 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals⁶ 에 따라 수행되었으며 Massachusetts General Hospital(MGH) Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 아래에 설명된 식별 방법은 남녀 모두의 C57BL/6NCrl 마우스에서 테스트되었습니다⁵. 이 방법은 다른 균주, 스톡, 또는 형질전환 유전자 변형에는 사용되지 않았다. 귓바퀴 생검 식별은 치유 능력이 증가한 마우스(예: MRL 마우스 균주)에는 적합하지 않을 수 있습니다⁷.

1. 쥐 강아지 구속

1. 마우스가 PND 7 이하인지 확인하십시오. 마우스가 PND 7보다 어린 경우 이 PEB 방법이 적합하지 않을 수 있습니다.
2. 시각화하고 귀에 접근할 수 있는 방식으로 마우스를 부드럽게 제지합니다. 사용자의 지배하지 않는 손으로 강아지의 꼬리 밑부분을 잡고 안정된 표면으로 옮깁니다.
3. 귀 사이의 느슨한 피부가 꼬일 수 있을 때까지 주로 사용하는 손의 엄지와 검지로 강아지의 등을 따라 부드럽게 누릅니다. 머리가 자유롭게 움직이지 않도록 피부를 충분히 단단히 꼬집되 동물이 정상적으로 숨을 쉬고 있는지 확인합니다(그림 1).
4. 동물을 왼손으로 제지하는 경우 강아지가 오른쪽 귀 귓바퀴에 접근할 수 있는 위치에 있는지 확인하십시오(즉, 강아지의 코가 손잡이의 몸에서 반대쪽을 향하고 있음). 왼쪽 귓바퀴에 접근하려면 동물의 왼쪽이 조련사를 향하도록 손을 잡는 손을 받치십시오.
5. 동물을 오른손으로 제지하는 경우 강아지가 왼쪽 귀 귓바퀴에 쉽게 접근할 수 있는 위치에 있는지 확인하십시오(즉, 강아지의 코가 핸들러의 몸에서 반대쪽을 향하고 있음). 오른쪽 귓바퀴에 접근하려면 동물의 오른쪽이 조련사를 향하도록 동물을 잡고 있는 손을 받치십시오.

2. 귓바퀴 생검 패턴의 선택

1. 8개의 PEB 패턴과 1개의 비생검 패턴이 있는 총 9개의 패턴을 사용합니다(그림 2). PEB 패턴을 선택하고 기록합니다.

3. 귓바퀴 가장자리 생검

1. 각 생검에 대해 깨끗한 기구를 사용하십시오. 작은 해부 가위 또는 McPherson-Vannas 가위를 사용하는 것이 좋습니다( 자료표 참조). 사용 후에는 기구에 소독제를 뿌리고 70% 이소프로필 알코올로 깨끗이 닦으십시오.
2. 주로 사용하는 손으로 가위를 잡습니다.
3. 수직 PEB를 만들려면 귓바퀴의 측면 가장자리를 수직 방향으로 잘라 전체 귓바퀴의 약 1/4에서 1/3(즉, 약 0.8mm x 3mm 조직)이 귀 측면에서 제거되도록 합니다(그림 3G).
4. 수평 PEB를 만들려면 귓바퀴의 등쪽 가장자리를 잘라 전체 귓바퀴의 약 1/4에서 1/3(즉, 약 0.8mm x 3mm 조직)이 제거되도록 합니다(그림 3H). 직선 대신 45° 각도로 절단합니다(그림 4). 각도는 시간이 지남에 따라 귀의 발달과 성장을 설명하고 패턴이 본질적으로 수평으로 유지되도록 합니다.
   1. 8개의 귓바퀴 패턴은 왼쪽, 오른쪽 또는 양쪽 귓바퀴에 있는 수직 PEB와 수평 PEB의 조합입니다. 좌측 수직(LV), 우측 수직(RV), 좌측 수평(LH), 우측 수평(RH), 좌측 수직 및 우측 수평(LVRH), 좌측 및 우측 수직(LVRV), 좌측 및 우측 수평(LHRH), 좌측 수평 및 우측 수직(LHRV)의 8가지 귓바퀴 생검 패턴을 만듭니다.
5. 가는 집게를 사용하여 절제된 귓바퀴 조직을 유전형 분석에 사용할 샘플 용기에 조심스럽게 넣습니다.
   1. 드물게 귓바퀴 생검 부위에 혈액이 고이는 경우, 주로 사용하는 손으로 동물이 여전히 구속되어 있는 동안, 깨끗한 거즈 조각이나 면봉 어플리케이터를 사용하여 출혈이 멈출 때까지 출혈 부위에 압력을 가합니다.
6. 강아지를 댐이 있는 케이지에 부드럽게 다시 놓습니다. 케이지에 다시 넣은 후 1-2분 동안 새끼를 관찰하여 PEB 부위에서 추가 출혈이 있는지 평가합니다.

그림 1은 PND 7 마우스의 귀가 조작을 위해 보이도록 부드럽게 제지하는 수동 방법을 보여줍니다. 구속구는 엄지와 검지를 사용하여 목덜미의 여분의 피부를 잡습니다. 움켜쥔 피부의 양은 동물의 나이에 따라 다르며, 작은 동물에서는 사용할 수 있는 조직이 더 적습니다.

그림 2에 나열된 PEB 패턴은 PND 63까지 식별할 수 있는 것으로 테스트되었으며 일화적으로 더 오래(즉, 2년) 지속되는 것으로 나타났습니다. 그림 3은 처음에 PND 7에서 촬영한 3마리의 생쥐를 보여주며 PND 63까지 추적했습니다. 한 강아지는 PEB가 없었고, 두 번째 강아지는 좌측 수직(LV) PEB를, 세 번째 강아지는 우측 수평(RH) PEB를 받았습니다. 그림은 이러한 PEB가 PND 63까지 손상되지 않았음을 보여줍니다.

수평 PEB의 경우 그림 4와 같이 귓바퀴의 등쪽 가장자리를 45° 각도로 절단하여 패턴을 더 명확하게 만들 수 있습니다. 동물과 귀가 성장함에 따라 귓바퀴 가장자리가 각도를 수정하고 더 눈에 띄게 수평으로 보입니다.

PEB를 평가한 기존 연구에서는 다양한 임상 및 행동 매개변수가 관찰되었습니다. 그림 5 는 성별에 따라 구별된 다양한 연령의 체중을 보여줍니다(그림 5A 는 암컷 마우스를 보여줍니다. 그림 5B 는 PND 7 새끼의 수컷 마우스)를 보여주며, 각 조합⁵의 PEB를 받았다. PEB를 투여받지 않은 새끼를 포함한 생쥐는 나이가 들면서 체중에 상당한 차이를 보였다.

그림 1: PEB 포지셔닝을 위해 PND 7 강아지 제한. PEB가 귀에 쉽게 접근할 수 있도록 PND 7 마우스를 부드럽게 긁는 대표적인 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PND 7 마우스에서 9개의 귓바퀴 식별 패턴을 보여주는 그림. 귀의 빨간색 선은 생검의 대략적인 위치를 나타냅니다. 이 수치는⁵에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 다양한 시점에서 다양한 귓바퀴 패턴을 가진 PND 7 새끼의 대표 이미지. (A, B) 생검이 없는 PND 7 새끼; (C, D) PND 21에 대한 생검이 없는 PND 7 새끼; (E, F) PND 63에 대한 생검이 없는 PND 7 강아지. (지, 나, 케이) 흰색 화살표는 각각 PND 7, 7, 21의 왼쪽 귀 강아지에 수직 PEB가 있는 PND 63 강아지를 보여줍니다. (H, J, L) 빨간색 화살표는 각각 PND 7, 21 및 63에 있는 PND 7 RH-PEB 강아지를 나타냅니다. 이 수치는⁵에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 비스듬히 생검한 수평 PEB 패턴. (A) PND 7 강아지 왼쪽 귓바퀴 수평 PEB는 45° 각도로 생성됩니다. (B) 동일한 동물이 묘사되어 있지만 지금은 PND 63입니다. 이제 각도가 수정되었으며 PEB가 더 수평으로 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: PND 7, 10, 14, 18, 21, 30 및 63에서 암컷과 수컷 새끼의 평균 체중. PND 7에서 PND 7까지의 새끼에서 암컷(빨간색) 및 수컷(파란색) 마우스의 평균 체중(g)은 성별로 표시되었습니다. 평균은 개별 마우스(n = 암컷 새끼 28마리, n = 수컷 새끼 26마리)에 걸쳐 계산되었습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 수치는⁵에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기존 방법과 관련된 중요성
이전 기사에서는 PND 14 이하 동물의 경우 귓바퀴가 ^2,3 크기의 작기 때문에 조작에 적합하지 않을 수 있다고 밝혔습니다. 귀 펀치 생검, 귀 노칭 또는 귀 태그와 같은 기존 귀 식별 시스템은 식별과 유전형 분석을 모두 수행할 수 있지만 더 큰 귓바퀴가 필요하므로 식별을 위해 더 나이가 많은 마우스가 필요할 수 있습니다. PEB의 이 새로운 방법은 이전에는 식별 및 유전형 분석 방법을 사용할 수 없었던 연령의 동물에 대한 식별 방법을 제공합니다. 동물 PND 7 내지 14에 대한 문헌에는 이전에 어떤 방법도 기술되어 있지 않다. 따라서 PEB는 PND 7만큼 어린 나이에 식별을 제공하며 수집된 조직은 유전형 분석에 사용할 수 있습니다.

다른 방법은 식별(예: 임시 꼬리 표시, 문신 및 트랜스폰더 이식) 또는 유전형 분석(예: 꼬리 생검)을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 단 한 번의 억제 이벤트로 식별과 유전형 분석을 모두 허용하여 동물에 대한 스트레스를 더욱 줄여줍니다.

발가락 깎기는 어린 동물의 식별 및 유전형 분석을 위한 옵션입니다 ^3,8,9,10. 그러나, 실험동물의 관리 및 사용을 위한 안내서 ⁶에 기술된 바와 같이 다른 개체 식별 방법이 실현 가능하지 않은 경우에만 사용해야 한다. 이 기준은 발가락 클리핑의 사용을 제한합니다. 이 권장 사항에 따라 PEB 방법은 PND 7 이상의 마우스에서 사용할 수 있는 발가락 깎기의 대안입니다.

그림 5에 요약된 이전 연구의 결과에 기초하여, PEB 절차는 PEB가 없는 마우스와 비교할 때 다양한 시점에서 측정된 마우스의 체중에 영향을 미치지 않았습니다. 또한 어느 시점에서도 PND 7 새끼에서 이환율이나 사망률이 관찰되지 않았습니다. PND 7에서 생검한 모든 새끼는 PND 10에서 우유 반점이 있었고 댐 거부는 관찰되지 않았습니다. 이러한 매개 변수를 기반으로 이 절차는 적절하게 수행될 경우 마우스의 성장 및 발달에 유익한 영향을 미치는 것으로 보입니다.

기술의 한계
PEB 기법은 유전형 분석을 가능하게 하는 8개의 식별 조합만 허용합니다. 아홉 번째 패턴인 무생검 패턴은 조직이 조달되지 않기 때문에 유전형 분석을 허용하지 않습니다. 그러므로, 제공되는 추가적인 9개의 조합을 보완하기 위해 다른 식별 방법을 사용해야 할 수도 있다. PEB를 더 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 한 귓바퀴에 등쪽과 수평 생검을 하면 6개의 추가 조합을 추가할 수 있습니다. 이렇게 하면 총 15개의 조합이 제공됩니다. 그러나 이러한 패턴은 수행되거나 테스트되지 않았습니다.

PEB는 PND 63까지 볼 수 있고 개별적으로 구별할 수 있었습니다. PND 63 이후 공식적으로 모니터링되지는 않았지만 생쥐는 최대 2년 동안 군체에 보관되었으며 일화적으로 PEB 패턴은 여전히 손상되지 않았습니다.

PEB 패턴은 C57BL/6NCrl 마우스에서만 테스트되었습니다. 다른 귀 식별 기법과 마찬가지로, 상처 치유 능력이 증가된 마우스는 이 기법에 적합하지 않을 수 있다⁷.

프로토콜 내의 중요한 단계
귓바퀴를 시각화할 수 있도록 확고하면서도 부드러운 구속을 보장하는 것은 적절한 PEB 실행을 위해 필수적입니다. PND 7 동물은 PND 21 동물에 비해 구속 및 생검 중 어려움을 덜 겪는 것으로 나타났습니다⁵. 수평 조합의 경우 그림 4와 같이 45° 각도로 슬라이스를 수행하여 마우스가 노화됨에 따라 수평 PEB가 수평으로 나타나도록 하는 것이 중요합니다.

수정 및 문제 해결
PEB의 효능을 테스트한 기존 연구에서는 일반적으로 PND 7 마우스⁵에서 귓바퀴의 최소 0.8mm x 3mm를 생검하는 것으로 밝혀졌습니다. 마우스가 노화됨에 따라 PEB 패턴을 식별하려면 가능한 한 귓바퀴에서 최대한의 조직을 취하는 것이 좋습니다.

미래의 응용 분야
PEB 기술은 C57BL/6Crl 마우스에서만 테스트되었지만, 테스트를 거친 경우 다른 마우스 균주 또는 스톡에도 이 애플리케이션을 사용할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이 더 큰 쓰레기가 있는 댐에 대한 더 많은 식별 패턴을 추가하기 위해 추가 PEB 패턴을 식별할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 다른 식별 기술(예: 귀 펀치)을 수행한 경험이 있는 숙련된 마우스 핸들러에 의해 테스트 및 수행되었습니다. 마우스 취급 경험이 적은 사람들을 위해 이 방법의 용이성을 테스트하기 위해 추가 연구를 개발할 수 있습니다.

저자는 공개할 내용이 없습니다.

저자들은 이 연구의 원래 논문의 저자인 Lori S Palley 박사와 Donna M Jarrell 박사의 기여에 감사를 표합니다.