耳介端生検を施した離乳前7日齢マウスの同定

このプロトコルは、同定と同時ジェノタイピングの目的で、出生後日(PND)7マウスで耳介エッジ生検(PEB)を作成するための新しい段階的なアプローチを提示します。

マウスの同定とジェノタイピングは、多くの場合、多くの in vivo 科学研究の重要な部分です。離乳マウスの同定とジェノタイピングについては、いくつかの方法が説明されています。しかし、今日まで、離乳前マウスについて記載されている技術ははるかに少ないです。耳介端生検(PEB)は、その後の組織をジェノタイピングに使用することで同定する方法です。この記事では、出生後日(PND)7マウスのPEBへの段階的アプローチについて説明し、ビデオ指導を提供します。耳介生検の位置と技術の 8 つの異なるパターンが概説されており、これらは識別のために成人期まで持続することが示されています。この記事では、PEBを最適化する方法についても説明し、この手法が子犬の成長と発達に与える良性の影響を示し、すべてのマウスが研究を通じて罹患率や死亡率なしに適切な体重増加を示しました。この技術は、利用可能な同定およびジェノタイピング方法がほとんどない年齢でのマウス同定の方法を研究者に提供します。

特定の科学的研究では、マウスを同定し、同時に遺伝子型を分類する方法が重要になる場合があります。マウスモデルを使用する場合、動物の遺伝子型決定と同定を同時に行うために開発された一般的に使用される方法(例:耳穿孔、耳のタグ付け)と、動物のみを識別する方法(例:タトゥー、皮下トランスポンダー移植、マーカーまたは色素の適用)、または動物のみの遺伝子型決定(例:尾部生検)^1,2.これらの技術のほとんどは、離乳時に行うことを意図しています。若年で離乳前の動物を同時に同定し、遺伝子型を分類する技術は少ない 1,2,3,4。

若い年齢でのマウスの同定とジェノタイピングを必要とする作業を支援するために、PEBがPND 7の子犬の信頼できる同定およびジェノタイピング方法として検証し、PND 21⁵で離乳したマウスのPEBの使用と比較する研究が行われました。この研究が詳述しているように、PND 7の子犬の死骸を使用した以前の研究では、PEBを使用して作成された耳介パターンが明確で迅速であり、さまざまなパターンの組み合わせを提供し、識別可能であり、^{組織を簡単に除去}できることがわかったため、水平および垂直の耳介スライスが選択されました5。耳のパンチや耳のノッチなどの他の方法も検討されましたが、PND 7の子犬には完全な円形のパンチやノッチを作成するのに十分な表面積がありませんでした。この予備的な研究により、参照された研究は、生きたPND7マウス⁵でこれらのパターンをテストすることになりました。この研究では、耳介の生検から得られた組織サイズをジェノタイピングの成功に使用できることが示されました。マウスがPND 63まで老化したときも、耳立たがPND 7またはPND 21⁵で生検された時期に関係なく、PEBパターンはそのままでした。

この技術の開発の目標は、現在の文献によれば利用可能な方法がないPND 7〜14歳の動物に対して、同時同定およびジェノタイピング方法を提供することです。本稿では、ガイド付きビデオとともに、7日間マウスの耳の耳介端で耳生検を行い、PCRジェノタイピングに十分な量の組織を同時に同定し、取得する方法を説明しています。8つの異なる生検の組み合わせと生検なしの組み合わせがあり、合計9つの耳介パターンを使用して個々のマウスを同定できます。耳介生検の実施に関するヒントは、PND 7 子犬のさまざまな耳介パターンを明確に識別するための成功を最大化するためにさらに議論されます。

プロトコルに概説されているすべての手順は、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイド⁶ に準拠して実施され、マサチューセッツ総合病院(MGH)の施設用動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。以下に述べる同定法は、雌雄のC57BL/6NCrlマウス5で試験^{されている。}この方法は、他の株、ストック、またはトランスジェニックでは使用されていません。耳介生検の同定は、治癒能力が高いマウス(MRLマウス系統^{など)には}適していない場合があります7。

1.マウスの子犬の拘束

1. マウスがPND 7以前であることを確認してください。マウスがPND 7より若い場合、このPEB法は実行できない可能性があります。
2. マウスを優しく拘束して、視覚化と耳へのアクセスを可能にします。ユーザーの非利き手で子犬を尻尾の付け根で持ち上げ、安定した表面に移します。
3. 利き手の親指と人差し指で子犬の背中に沿って優しく圧力をかけ、耳の間のゆるい皮膚をつまむことができます。頭が自由に動かないように皮膚をしっかりとつまみますが、動物が正常に呼吸していることを確認します(図1)。
4. 動物が左手で拘束されている場合は、子犬が右耳介にアクセスできる位置にあることを確認します(つまり、子犬の鼻が持ち手の体から離れている)。左耳介にアクセスするには、動物の左側がハンドラーに向くように手をつかむように仰向けます。
5. 動物が右手で拘束されている場合は、子犬が左耳介に簡単にアクセスできる位置にあることを確認します(つまり、子犬の鼻がハンドラーの体から離れている)。右耳介にアクセスするには、動物の右側がハンドラーに面するように、動物をつかむ手を仰向けにします。

2. 耳介生検パターンの選択

1. 8つのPEBパターンと1つの非生検パターンの合計9パターンを使用します(図2)。PEB パターンを選択して記録します。

3.耳介端生検

1. 各生検には清潔な器具を使用してください。小さな解剖はさみまたはMcPherson-Vannasはさみをお勧めします( 材料の表を参照)。器具に消毒剤をスプレーし、使用するたびに70%イソプロピルアルコールできれいに拭いてください。
2. 利き手でハサミを持ちます。
3. 垂直PEBを作成するには、耳介の横端を垂直方向にトリミングして、耳介全体の約1/^4〜1/3rd(つまり、約0.8 mm x 3 mmの組織)が耳の側面から取り除かれます(図3G)。
4. 水平PEBを作成するには、耳介の背側縁をトリミングして、全耳介(つまり、約0.8 mm x 3 mmの組織^)の約1/^4〜1/3が除去されるようにします(図3H)。直線ではなく45°の角度でカットします(図4)。角度は、時間の経過に伴う耳の発達と成長を説明し、パターンが本質的に水平であることを保証します。
   1. 8つの耳介パターンは、左、右、または両方の耳介の垂直PEBと水平PEBの組み合わせです。左縦(LV)、右縦(RV)、左横(LH)、右横(RH)、左縦横(RH)、左縦横(LVRH)、左縦横(LVRH)、左右縦(LVRV)、左右横横(LHRH)、左横横右縦(LHRV)の8つの耳介生検パターンを作成します。
5. 細い鉗子を使用して、切除した耳介組織を慎重にサンプル容器に沈着させ、ジェノタイピングに使用します。
   1. 万が一、耳介生検部位から血液が溜まった場合は、利き手で動物を拘束したまま、清潔なガーゼまたは綿の先端アプリケーターを使用して、出血が止まるまで出血部位に圧力をかけます。
6. 子犬をダムのあるケージにそっと戻します。ケージに戻した後、子犬を1〜2分間観察して、PEB部位からのさらなる出血がないか評価します。

図1は、PND 7マウスを優しく拘束して、耳が見えるように操作する手動の方法を示しています。拘束具は親指と人差し指を使って首筋の余分な皮膚をつかみます。つかむ皮膚の量は動物の年齢によって異なり、小動物では利用できる組織が少なくなります。

図2にリストされているPEBパターンは、PND 63まで識別可能であることがテストされており、逸話的にはより長く(つまり、2年間)持続することが確認されています。図3は、PND 7で最初に撮影され、PND 63まで追跡された3匹のマウスを示しています。1匹の子犬はPEBを持たず、2匹目の子犬は左垂直(LV)PEBを受け取り、3匹目の子犬は右水平(RH)PEBを持っていました。この図は、これらのPEBがPND 63まで無傷であることを示しています。

水平型PEBの場合、 図4に示すように、耳介の背側縁を45°の角度で切断することで、パターンをより明確にすることができます。動物、ひいては耳が成長するにつれて、耳介の縁は角度を修正し、より顕著に水平に見えます。

PEBを評価した元の研究では、さまざまな臨床的および行動的パラメーターが観察されました。 図5 は、性別によって区別されたさまざまな年齢での体重を示しています(図5A は雌マウスを示しています。 図5B は、各組み合わせ⁵のPEBを投与されたPND7の仔犬の雄マウス)を示している。PEBを受けなかった子犬を含むマウスは、加齢とともに体重に大きな差を示しました。

図1:PND 7の子犬をPEBポジショニングに拘束する様子。 PND 7マウスを優しく擦り傷つけて、PEBが耳に簡単にアクセスできるようにする代表的な画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PND 7マウスの9つの耳介識別パターンを示す図。 耳の赤い線は、生検のおおよその位置を示しています。この数値は⁵から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:さまざまな時点でさまざまな耳介パターンを持つPND 7の子犬の代表的な画像 (A、B) 生検のないPND 7の子犬。(C、D) PND 21 の生検を受けていない PND 7 の子犬。(E、F) PND 63 の生検を受けていない PND 7 の子犬。(G、I、K)白い矢印は、PND 7、21、63の左耳の子犬に垂直PEBを持つPND 7の子犬を示しています。(H・J・L)赤い矢印は、それぞれPND 7、21、および63のPND 7 RH-PEBの子犬を示しています。この数値は⁵から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:斜めに生検された水平PEBパターン (A)PND 7の子犬左耳介水平PEBは45°の角度で作成されます。(B)同じ動物が描かれていますが、現在はPND63です。角度が修正され、PEB がより水平に表示されることに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:PND 7、10、14、18、21、30、63での雌と雄の子犬の平均体重。 PND 7から63までのPND 7の仔マウスの雌マウス(赤)と雄(青)マウスの平均体重(g)を性別別にプロットした。平均は、個々のマウス(n = 28匹の雌の子犬、n = 26匹の雄の子犬)にわたって計算した。エラーバーはSEMを表します。この数値は⁵から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

既存の方法に対する意義
以前の記事では、PND 14以下の動物の場合、サイズ^が小さいため、耳介が操作に適していない可能性があると述べています^2,3。イヤーパンチ生検、イヤーノッチング、イヤータグなどの既存の耳識別システムは、同定とジェノタイピングの両方を実行できますが、同定にはより大きな耳介、したがって高齢のマウスが必要になる場合があります。この新しいPEB法は、これまで同定法やジェノタイピング法が利用できなかった年齢の動物に同定法を提供します。動物PND 7〜14の方法に関する文献には、これまでに記載されていない方法があります。したがって、PEBはPND 7という若さで同定でき、収集された組織はジェノタイピングに使用できます。

他の方法では、同定(一時的なテールマーキング、タトゥー、トランスポンダー埋め込みなど)やジェノタイピング(テールバイオプシーなど)が可能です。この方法により、1回の拘束イベントで同定とジェノタイピングの両方が可能になり、動物へのストレスがさらに軽減されます。

つま先のクリッピングは、若い動物の同定とジェノタイピングのためのオプションです3,8,9,10。ただし、実験動物の手引き⁶に記載されているように、他の個体識別方法が実行不可能な場合にのみ使用してください。この基準は、つま先のクリッピングの使用を制限します。この推奨事項に基づいて、PEB法は、PND 7以上のマウスで使用できるつま先のクリッピングの代替手段です。

図5にカプセル化されている以前の研究の結果に基づくと、PEB手順は、PEBなしマウスと比較した場合、さまざまな時点で測定されたマウスの体重に影響を与えませんでした。さらに、PND 7の子犬では、どの時点でも罹患率や死亡率は観察されませんでした。PND 7で生検されたすべての子犬は、PND 10にミルクスポットがあり、母犬の拒絶反応は観察されませんでした。これらのパラメータに基づくと、この手順は、適切に実施された場合、マウスの成長および発達に良性の影響を及ぼすようである。

手法の制限事項
PEB技術では、ジェノタイピングも可能にする8つの同定組み合わせのみが可能です。9番目のパターンである生検なしパターンでは、組織が調達されないため、ジェノタイピングは許可されません。したがって、提供される追加の9つの組み合わせを補完するために、他の識別方法を使用する必要がある場合があります。PEBを追加することができます。たとえば、1つの耳介に背側生検と水平生検を行うと、6つの追加組み合わせを追加できます。これにより、合計 15 の組み合わせが提供されます。ただし、これらのパターンは実行もテストもされていません。

PEBは視認でき、PND 63まで個別に区別できました。PND 63以降は正式にはモニタリングされていませんが、マウスは最大2年間コロニーに飼育され、PEBパターンはそのままであったという逸話があります。

PEBパターンは、C57BL/6NCrlマウスでのみ試験されました。他の耳識別技術と同様に、創傷治癒能力が増加したマウスは、この技術には適していない⁷。

プロトコル内の重要なステップ
ピナの視覚化を可能にするしっかりとした穏やかな拘束を確保することは、適切なPEBの実行に不可欠です。PND 7の動物は、PND 21の動物⁵と比較して、拘束中および生検中の闘争が少ないことが認められました。水平方向の組み合わせでは、 図4に示すように、マウスの年齢に応じて水平方向のPEBが水平に見えるように、45°の角度でスライスを実行することが重要です。

変更とトラブルシューティング
PEBの有効性を検証した最初の研究では、一般に、少なくとも0.8 mm x 3 mmの耳介がPND 7マウスで生検されることが発見され^{ました5。}マウスの加齢に伴うPEBパターンの同定を確実にするために、可能な限り耳介から最大量の組織を採取することをお勧めします。

将来のアプリケーション
PEB技術はC57BL/6Crlマウスでのみ試験されましたが、このアプリケーションは、試験された場合、他のマウス系統やストックでも使用できます。前述のように、さらにPEBパターンを特定して、より大きな同腹児のダムの識別パターンをさらに追加することができます。最後に、この方法は、他の識別技術(例えば、耳のパンチ)を実行した経験豊富なマウスハンドラーによってテストされ、実行されました。マウスの取り扱いにあまり経験がない人のために、この方法の容易さをテストするために、さらなる研究が開発される可能性があります。

著者は何も開示していません。

著者らは、本研究の原著論文の著者であるLori S Palley博士とDonna M Jarrell博士の貢献に感謝します。