Polibütilen Adipat Tereftalat Bazlı Mikro ve Nano Plastiklerin Proton Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi Kullanılarak Topraktan Miktar Tayini

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak topraktaki polibütilen adiptat tereftalattan kaynaklanan mikro ve nano plastiklerin miktarını belirlemek için bir yöntem burada açıklanmaktadır. Bu teknik, nanoplastiklerin miktar tayinine kadar uzandığı ve çevresel numunelerin toplu olarak işlenmesi için kolayca uyarlanabildiği için mevcut metodolojiyi geliştirir.

Biyolojik olarak parçalanabilen plastik ürünlerin bozunmasını ve çevresel etkisini doğru bir şekilde değerlendirmek için biyolojik bozunma sırasında toprakta oluşan mikro ve nano plastiklerin (MP'ler ve NP'ler) geri kazanılması ve miktarının belirlenmesi için bir yönteme ihtiyaç vardır. Toprakta MP'lerin ve NP'lerin varlığı, toplanma davranışı gibi toprak özelliklerini değiştirebilir veya toprak biyotası üzerinde toksik etkilere neden olabilir. Mevcut MP geri kazanım yöntemleri, polibütilen adipat tereftalat (PBAT) gibi biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin ölçümü için her zaman uygun değildir; asitler veya oksitleyicilerle yapılan bazı yaygın sindirim prosedürleri, PBAT bazlı biyolojik olarak parçalanabilen MP'leri yok edebilir. Mikro-FTIR ve mikro-Raman spektroskopisi gibi tanımlama yöntemleri de geri kazanılabilecek ve analiz edilebilecek minimum partikül boyutu ile sınırlıdır. Bu nedenle, bu yöntem, PBAT'ı kimyasal olarak dönüştürmeden topraktaki MP'lerin ve NP'lerin kütle fraksiyonunu değerlendirmek için topraktan PBAT'ı çıkarmak ve miktarını belirlemek için geliştirilmiştir. Protokolde, PBAT'ı topraktan seçici olarak çıkarmak için bir kloroform-metanol çözeltisi kullanılır. Çözücü, ekstrakttan buharlaştırılır ve daha sonra ekstrakt, döteryumlu kloroform içinde yeniden çözülür. Ekstrakt, her bir numunedeki PBAT miktarını ölçmek için kantitatif parametreler altında proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (¹H-QNMR) ile analiz edilir. PBAT için solvent ekstraksiyon verimlilikleri, gölgeli tınlı bir toprakta %76 ile Elkhorn kumlu tınlı toprakta %45 arasında değişir. PBAT geri kazanımı, bozulmamış olanlara kıyasla foto-oksitlenmiş malzemeler için azaltılabilir ve yüksek kil içeriğine sahip topraklarda azaltılabilir. Ekstraksiyon verimlilikleri, test aralığındaki PBAT konsantrasyonuna bağlı değildir, ancak NP'ler için MP'lere göre daha düşük ekstraksiyon verimlilikleri gözlenmiştir. PBAT miktar tayin sonuçları, bir laboratuvar inkübasyon çalışmasında kümülatif toprak solunumunun ölçülmesiyle plastik bozunmanın miktar tayini ile karşılaştırılabilirdi.

Topraktaki MP kontaminasyonunu ölçme yöntemleri, küresel topraklardaki plastik kontaminasyonunun^{kapsamını 1}, plastik kontaminasyon kaynaklarını² ve potansiyel çözümleri³ anlamak için gereklidir. Tarım toprakları benzersiz bir şekilde plastik kirliliğine maruz kalmaktadır: 2021 itibariyle tarımda her yıl 15 milyon metrik tondan fazla plastik kullanılmaktadır⁴, 2,5 milyon ton plastik malç da dahil olmak üzere⁵. Plastik malç toprakla yakın temas halinde kullanılır, yılda bir veya daha fazla kez^{tekrar uygulanır 6} ve kullanım ömürlerinden sonra topraktan tamamen çıkarılması zor olabilir⁷. MP ölçüm yöntemlerine ihtiyaç duyulan önemli bir alan, bitkisel sistemlerde kullanım için biyolojik olarak parçalanabilen plastik malçlar gibi biyolojik olarak parçalanabilen plastik ürünlerin değerlendirilmesidir⁸.

Toprakta biyolojik olarak parçalanabilen plastik ürünler, geleneksel tarım plastiklerine umut verici alternatiflerdir, çünkü amaçlandığı gibi çalışırlarsa plastik malçlama yoluyla toprağın plastik kirlenmesini ortadan kaldırabilirler. 2022'de küresel olarak 1 milyon metrik tondan az biyolojik olarak parçalanabilen plastik üretildi ve endüstri için hızlı bir büyüme bekleniyor⁹. Biyolojik olarak parçalanabilen en yaygın dört polimer, polilaktik asit (PLA), polimerize nişasta, polihidroksialkanoatlar (PHA) ve polibütilen adipat tereftalat (PBAT), tarımsal biyolojik olarak parçalanabilen plastik malçlarda ticari veya deneysel olarak kullanılmaktadır¹⁰. Vaatlerine rağmen, bu biyolojik olarak parçalanabilen plastik ürünlerin saha koşullarında bozunması değişkendir¹¹. Sahada biyolojik olarak parçalanabilen plastik malç bozunması ile ilgili bazı çalışmalar makroplastik parçalara¹¹ odaklanmış olsa da, plastik malzemelerin tamamen bozunmasının değerlendirilmesi, MP'leri ve NP'leri topraktan geri kazanma yeteneğini gerektirir. Topraktan mikroplastik miktarının belirlenmesi, MP kirliliğinden kaynaklanan toprak ekosistemleri üzerindeki olumsuz etki potansiyelini değerlendirmek için de önemlidir¹².

MP tanımlama ve niceleme için yaygın olarak kullanılan bazı teknikler arasında görsel analiz, mikro-Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (μFTIR), mikro-Raman spektroskopisi (μRaman), gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi (piroliz GCMS ve termal ekstraksiyon desorpsiyon GCMS dahil GCMS) ve termogravimetrik analiz¹³. Diğer geliştirme teknikleri arasında topraklarda¹⁴ yerinde MP ölçümü için yakın kızılötesi spektroskopisi, GCMS analizi¹⁵ için yağ asidi metil esterifikasyon ekstraksiyonu ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi¹⁶ yer alır. Topraktaki MP'leri ölçen çalışmaların% 90'ı plastik parçacıkları tanımlamak için görsel analiz (tek başına veya diğer tekniklerle eşleştirilmiş) kullanırken,% 77'si FTIR, Raman veya GCMS spektroskopi tekniklerini kullandı¹⁷. Çok çeşitli MP niceleme tekniklerinin geliştirilmesi ve uyumlaştırılması, bilim camiasının çeşitli mikroplastik araştırma sorularını yanıtlama yeteneğini genişletmeye yardımcı olabilir¹⁸. Mikroplastiklerin miktarını belirlemek için toprak numuneleri hazırlamak için üç genel yaklaşım mevcuttur: 1) değişmemiş tek tek mikroplastik parçacıkların topraktan ayrılması (örn. yoğunluk ayrımı ile), 2) dönüştürülmüş plastik veya polimer malzemenin ekstrakte edilmesi (örn. çözünme yoluyla) veya 3) dökme toprağın analiz edilmesi. Hem μFTIR hem de μRaman spektroskopisi, kimyasal olarak tanımlanmadan önce bireysel MP'lerin topraktan ayrılmasını gerektirir¹⁹ oysa piro-GCMS, topraktan veya dökme topraktan ayrılan izole plastik parçacıklar^{üzerinde gerçekleştirilebilir 20}. Biyolojik olarak parçalanabilen MP'leri topraktan ayırmak zor olabilir, çünkü toprak organik maddesini uzaklaştırmak için kullanılan bazı çürütmeler, PBAT²¹ dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen polimerleri bozabilir veya başka bir şekilde kimyasal olarak değiştirebilir. Mikro-Raman ve μFTIR spektroskopisinin her ikisinin de bir uzamsal çözünürlük sınırı vardır: parçacıklar μFTIR için 10-20 μm'den ve μRaman için 1 μm'den büyük olmalıdır (eğer bu kadar küçük tek parçacıklar analiz için hazırlanabilirse)^19,22. Bu teknikler, MP polimerlerinin kimyasal olarak tanımlanmasını sağlayabilir ve MP boyutu^22'yi ölçmek için spektroskopik görüntüleme kullanılabilir. Tüm piro-GCMS türleri, numunelerin analiz sırasında imha edilmesi bakımından sınırlıdır.

NMR, toprak bileşenlerini ve kirleticileri²³ karakterize etmek, MP'leri 16,24,25,26 ölçmek ve PBAT ve başka bir polimer olan polistiren 27,28'in bozunmasını değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır. Kantitatif parametreler altında çalıştırıldığında, ¹H-NMR spektroskopisi, her bir spektral tepe noktasının alanının numunedeki katkıda bulunan hidrojen sayısıyla doğru orantılı olduğu spektrumlar üretir; Bu, bir numunedeki bileşen bileşenlerin miktar tayinine izin^{verir 29}. NMR, aynı anda miktar tayini ve tanımlamasına izin verdiği, karmaşık ve saf olmayan karışımlar için uygun olduğu ve kimyasal olarak aynı referans standartları^30,31 gerektirmediği için toprak içinde PBAT da dahil olmak üzere bazı MP'lerin miktarını belirlemek için değerli bir analitik tekniktir. Bir çözücü ekstraktının NMR spektroskopisi, μFTIR, μRaman veya GCMS miktar tayini için işlenebilenlerden daha küçük MP'leri veya NP'leri ölçebilir. Bu avantajlara rağmen, kantitatif NMR yaklaşımları hala yıkıcı kütle spektroskopisi tabanlı yaklaşımlardan daha düşük duyarlılıklar sağlamaktadır³².

Şekil 1'de şematize edilen önerilen yöntem, nano boyutlu PBAT plastikleri de dahil olmak üzere PBAT içeren toprak örneklerini işlemek ve analiz etmek için bir iş akışını açıklamaktadır. Yöntemde, PBAT polimeri, toprağın kloroform ve metanol karışımı ile çalkalanmasıyla toprak örneklerinden ekstrakte edilir. PBAT içeren çözücü ekstraktları kurutulur ve daha sonra ilave bir iç kalibrant ile döteryumlu kloroform içinde yeniden çözülür. NMR spektroskopisi, kantitatif parametreler kullanılarak ekstraktlar üzerinde gerçekleştirilir. Elde edilen spektrumlar, PBAT'ın hidrojen atomlarına ve kalibrant moleküllerine karşılık gelen takılan tepe noktalarının alanını karşılaştırarak PBAT'ı ölçmek için analiz edilir. Bu yöntem, Nelson ve ^ark.33 tarafından gösterilen çözücü ekstraksiyonu ve proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (¹H-NMR) yaklaşımını uygular. Amaç, çevresel ölçekli numuneleri (~ 100 g toprak) işlemek için uygun bir yöntem kullanmak ve özel ekstraksiyon ekipmanı olmadan bir dizi numuneyi paralel olarak işlemekti.

1. Toprağın toplanması ve hazırlanması

NOT: Numune alma ve işleme ekipmanı, numune kontaminasyonunu önlemek için polimer PBAT veya bileşenlerini içermemelidir. Diğer polimer malzemeler, topraktan PBAT'ın miktar tayinine mutlaka müdahale etmez. Örneğin, polietilen ve polipropilen, kloroform ¹H-NMR'de PBAT^34'ün miktar tayinine müdahale eden spektral zirveler üretmez, ancak tereftalat grubuyla birlikte polietilen tereftalat, diğer polyesterler gibi büyük olasılıkla^35'e müdahale eder. Brandolini ve Hills³⁴ gibi referans metinleri, çeşitli polimerlerin ¹H-NMR spektrumunu belirlemek ve miktar tayini için kullanılan PBAT tepe noktaları ile örtüşen tepe noktalarını taramak için kullanılabilir (aşağıda açıklanmıştır).

1. Her numune için en az 100 g eşdeğer kuru ağırlık toprak toplayın. Temsili bir numune toplamak için beklenen plastik konsantrasyonuna göre toprak numune boyutunu belirleyin ve gerekirse bir alt numune toplamak için toprağı homojenize edin³⁶.
   NOT: Toprak sistemleri, içlerindeki kirletici dağılımlar (örneğin, MP'ler)³⁸ gibi, doğası gereği heterojendir³⁷. Kirletici konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılan yöntemlerle ilişkili değişkenlik de vardır³⁹. Bu nedenle, belirsizliği tahmin etmek ve plastik konsantrasyonuna⁴⁰ dayalı olarak temsili numune hacimlerini toplamak için bir araç olarak tekrarlanan numuneleri içeren bir numune alma tasarımı veya deneysel tasarım oluşturulması önerilir. Topraktaki MP konsantrasyonlarının, kg toprak başına sıfıra yakın ila 1 x 10⁷ öğe arasında değiştiği belgelenmiştir ve çoğu alan, kg toprak başına 10,000'den az öğe içerir⁴¹. Teorik bir temsili temel hacim, metrekare başına 10 maddelik bir MP konsantrasyonunda 23^m2 ile MP konsantrasyonları metrekare başına 10.000 öğe olduğunda 0,02^m2 arasında değişebilir³⁶.
   1. İşlenmesi gereken toprak miktarını en aza indirirken bir tarla sahasından etkili numune alma alanını artırmak için, geniş bir alandan (örneğin 1 m²) toprak toplayın, ardından numuneyi homojenize etmek ve konsolide etmek için çeyrekleme yöntemini kullanın (örneğin, 500 g toprağa)³⁶.
   2. Dörde bölme yönteminde, geniş bir alandaki toprağı bir muşamba veya başka bir yüzeye yığın, bir kürek kullanarak iyice karıştırın, ardından dörde bölün. Numunenin dörtte birini saklayın ve diğer dörtte üçünü atın. Numune istenen boyuta gelene kadar bu işlemi tekrarlayın.
2. Toprağı 2 mm'lik gözenekli bir elekten geçirin. Elek tamamen temizleyin ve toprak örnekleri arasındaki tavayı yakalayın.
3. Toprağı havayla kurutun, ardından kapalı numune torbalarında saklayın. Kuru toprak, PBAT ekstraksiyonundan önce bu durumda saklanabilir.

2. PBAT'ın topraktan çıkarılması

DİKKAT: Kloroform uçucu ve toksiktir. Karanlıkta, amber camda, oksitleyicilerden uzakta saklayın. Onunla çalışırken uygun eldiven, göz koruması ve koruyucu giysi giyin. Sadece çeker ocakta tutun. Metanol yanıcı, uçucu ve toksiktir. Metanolü yangına dayanıklı bir dolapta saklayın. Metanol ile çalışırken uygun eldiven, göz koruması ve koruyucu giysi giyin. Metanolü sadece çeker ocakta tutun. Cam eşyalar kırılabilir ve yaralanmaya neden olabilir. Cam eşyaları tutarken göz koruması kullanın. Kırık cama çıplak elle dokunmaktan kaçının. Bunun yerine, kırık camı kesilmeye dayanıklı eldiven, maşa, süpürge veya başka bir aletle temizleyin.

NOT: Kloroform çoğu plastik veya metalle uyumlu değildir. Tüm malzemelerin uyumlu olduğundan emin olun (örn. cam veya politetrafloroetilen, PTFE plastik).

1. Bir davlumbazda 100 mL 90:10 v/v kloroform karışımı hazırlayın (triklorometan; Ekstrakte edilecek numune başına CHCl₃) ve metanol (CH₃OH). Örneğin, 5 numuneden ekstrakte etmek için 450 mL kloroformu 50 mL metanol ile karıştırın.
2. Bir cam ekstraksiyon kavanozuna 100 g kuru toprak, 100 mL kloroform-metanol çözeltisi ve 20 cam boncuk ekleyin. Ekstraksiyon kavanozlarını, kavanozlardan solvent buharı çıkmayacak şekilde PTFE kaplı kapaklarla sıkıca kapatın.
   NOT: PBAT kloroformda yüksek oranda çözünür; bir kloroform-metanol karışımı kullanılmıştır, çünkü metanol çözünen maddelerle hidrojen bağları oluşturabilir, toprak minerali ve organik bileşenleriyle rekabet edebilir ve PBAT'ın topraktan geri kazanımını artırabilir³³.
3. Ekstraksiyon kavanozlarını 200 rpm'de 8 saat sallamak için bir çalkalayıcı tabla kullanın. Çalkaladıktan sonra, ekstraksiyon kavanozlarındaki toprağın en az 4 saat dinlenmesine izin verin.
4. Ekstraktı topraktan ayırın. Çeker ocakta, bir ekstraksiyon kavanozunun kapağını açın ve sıvıyı pipet ile gözenek boyutu 11 μm olan kalitatif bir kağıt filtreden etiketli temiz bir cam kavanoza aktarın. Ekstraksiyon kavanozundan geri kazanılan çözücü hacmini kaydedin. Ekstrakt ile toprak katılarını aktarmaktan kaçının; gerekirse birkaç mL çözücü bırakın.
   NOT: Filtre kağıdı, çözücü çözeltisinden büyük organik madde parçalarını çıkarmak için tasarlanmıştır.
5. Ekstraktları, çözücü tamamen buharlaşana kadar çeker ocakta bırakarak kurutun. Bu işlem 24 saate kadar sürebilir. Çeker ocaktaki toprağı da kurutun. Toprak tamamen kuruduktan sonra atın.
6. Ekstraktlar kuruduktan sonra, her bir numune kavanozunun kapağını kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar serin, karanlık ve kuru bir yerde saklayın.

3. NMR spektrumlarının toplanması

DİKKAT: Döteryumlu kloroform, yukarıda açıklanan protonlanmış kloroform ile aynı riskleri oluşturur ve aynı önlemleri gerektirir.

1. Örneğe bir iç kalibrant⁴² ekleyin. 1.00 mg 1,4-dimetoksibenzen (DMB; C₆H₁₄O) kurutulmuş bir ekstrakt içeren her bir numune kavanozuna.
2. Numuneyi döteryumlu kloroformda (CDCl₃; trikloro (deutero) metan) yeniden süspanse edin. Çeker ocakta, kurutulmuş numune özütü içeren kavanoza 500 μL döteryumlu kloroform eklemek için bir mikropipet kullanın.
3. Kavanozu kapatın ve kavanozu bir elinize veya tezgah üzerine, her iki tarafta yaklaşık 10 kez hafifçe vurarak kurutulmuş özü çözmek için sallayın. Ardından sıvıyı bir NMR tüpüne aktarmak için temiz bir pipet ucu kullanın.
4. Adım 3.2 ve 3.3'ü ilave 500 μL döteryumlu kloroform ile tekrarlayın ve numunenin ikinci kısmını birinciyle aynı NMR tüpüne ekleyin. İkinci durulama, kurutulmuş ekstraktın kaptan tamamen çözünmesini ve geri kazanılmasını sağlamak için tasarlanmıştır.
5. NMR tüpünü kapatın ve NMR spektrumlarını toplamadan önce 3 gün boyunca saklayın. Uygun depolama süresi, NMR tüpünden çözücünün buharlaşma hızına bağlı olacaktır. Numuneleri döteryumlu kloroform ile hazırladıktan kısa bir süre sonra analiz edin.
6. NMR tüplerini spektrometreye taşımak için uzun, hassas tüpleri desteklemek üzere tasarlanmış bir tutucu kullanın. Bunlar tipik olarak tabana ve tüpün tepesine yakın bir yerde desteğe sahiptir. Taşıma sırasında tüpleri dik konumda tutun.
7. 500 MHz'lik bir NMR spektrometresi kullanarak, ¹° darbe açısı²⁹, 90 μs darbe genişliği 8 μs³³, 25 s gecikme süresi (ters çevirme kurtarma deneyi 29,43 ile belirlenir), tarama başına^262K noktası ve 32 kompozit tarama^{toplayın 29,44} 12 ila -2 ppm arasında 25 kompozit tarama 25 dakikalık bir çalışma süresi için.
   NOT: 500 K kontrollü bir sıcaklıkta geniş bant optimize edilmiş prob ve otomatik örnekleyici ile bir Bruker Neo 300 MHz spektrometresi kullandık. Diğer benzer spektrometreler kullanılabilir. Farklı bir manyetik alan kuvvetine sahip bir alet kullanılıyorsa, uygun gecikme süresi, bir inversiyon geri kazanım deneyi^29,43 kullanılarak PBAT ve 1,4-dimetoksibenzen için T1 gevşeme süresine dayalı olarak hesaplanabilir.
8. Örnek çalıştırıldıktan sonra, spektral verileri gerektiği gibi kaydedin, aktarın veya bunlara erişin.
   Spektral verileri inceleyin. Nicelemede kullanılan tüm PBAT tepe noktalarının varsa net bir şekilde çözüldüğünü kontrol edin. Miktar tayini için PBAT tepe noktaları 5 (8.10 ppm), 6 (4.44 ppm), 6' (4.38 ppm), 3' (4.15 ppm) ve 3 (4.09 ppm) kullanın (ayrıntılar Tablo 1'de). Kantifikasyon için de DMB tepe noktaları A (6.84 ppm) ve B (3.77 ppm) kullanın (ayrıntılar Tablo 2'de). Birbirine çok yakın görünen ve üst üste gelebilen PBAT'ın 6, 6', 3' ve 3 tepe noktalarına özellikle dikkat edin.
9. Bazı tepe noktaları net bir şekilde çözülmezse, numuneyi seyreltin. 100 μL numune ve 500 μL döteryumlu kloroformu temiz bir NMR tüpünde birleştirin ve numuneyi adım 3.7'de tanımlanan aynı parametreler altında yeniden çalıştırın.

4. PBAT'ı ölçmek için NMR spektrumlarının analizi

NOT: Spektral analiz, toplandıktan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir. Herhangi bir sorun olması durumunda numunelerin yeniden çalıştırılmak üzere hala mevcut olduğundan emin olmak için verilerin spektrumların üretildiği gün analiz edilmesi tercih edilir.

1. Spektrometre tarafından oluşturulan FID dosyasını NMR FID işleme yazılımında açın (MestreLab'dan MestreNova'yı kullandık, diğer seçenekler ancak başka seçenekler de mevcuttur).
2. Spektrumlara satır genişletme uygulayın: FID işleme yazılımında, İşleme menüsünde İşleme Şablonu'nu seçin, ardından Apodizasyon bölümüne gidin. Büyüklüğü 0,5 Hz ve ilk noktası 0,5 Hz olan üstel bir model seçin.
3. İşleme menüsündeki Otomatik Faz Düzeltme düğmesine tıklayarak otomatik faz düzeltmesini uygulayın. İşleme menüsündeki Otomatik Taban Çizgisi Düzeltmesi düğmesini tıklatarak otomatik taban çizgisi düzeltmesi uygulayın.
4. Ölçülen spektral tepe noktalarına sığdırmak için tepe evrişimini kullanın: spektrum işleme yazılımının Analiz sekmesinde, Sığdırma bölümünde, Yeni Sığdır düğmesine tıklayın. 8,5 ppm'lik bir kaymada spektrumlara tıklamak için imleci kullanın, ardından imleci 3,0 kaymasına sürükleyin ve bırakın.
5. Takılan tüm tepe noktalarını görüntülemek için Montaj bölümünün altındaki Hat Uydurma Tablosu'na tıklayın.
6. Tablo 1 ve Tablo 2'de açıklandığı ve Şekil 2'de etiketlendiği gibi niceleme için kullanılan tepe noktalarını koruyun. Kantitasyonda PBAT Tepe Noktaları 5 (8.10 ppm), 6 (4.44 ppm), 6 '(4.38 ppm), 3 '(4.15 ppm) ve 3 (4.09 ppm) (Tablo 1'deki ayrıntılar) ve ayrıca DMB tepe noktaları A (6.84 ppm) ve B (3.77 ppm) kullanın. Tablo 1 ve Tablo 2'de listelenen her bir tepe noktasına karşılık gelen hidrojen atomları, Şekil 3A'daki yapısal diyagramlarda etiketlenmiştir, Şekil 3A, iki PBAT dimerinin yapısını gösterir, Şekil 3B, dimerlerin polimerdeki konumunun, 1,4-bütandiol monomerinden hidrojenlerdeki tepe kaymasını değiştirmek için nasıl etkileşime girdiğini gösterir, ve DMB'nin yapısını gösteren Şekil 3C.
7. İstenmeyen tepeleri seçip Tepeyi Sil'i tıklatarak diğer tüm tepeleri sığdırmadan silin.
8. Her bir tepe noktasının alanını hesaplamalar için bir elektronik tablo uygulamasına kopyalamak için Montaj Tablosunu kullanın (biz elektronik tablo kullanmayı seçtik).
9. Tepe alanlarını bir elektronik tabloya kopyalamak için, önce Satır Uydurma Tablosu'ndaki tüm tepe bilgilerini seçin. Ardından sağ tıklayın ve açılır menüden Kopyala'yı seçin. Verileri e-tabloya yapıştırın.
10. Denklemi kullanarak numuneye eklenen DMB'nin mol sayısını, n_DMB'yi hesaplayın
    
    burada m_DMB, numuneye gram cinsinden eklenen DMB kütlesidir (önerilen 1.00 mg) ve MM_DMB , DMB'nin molar kütlesidir (138.17 g/mol).
11. Denklemi kullanarak numunedeki n_BT'nin butilen tereftalat dimerinin mol sayısını hesaplayın
    
    burada A₅ , PBAT tepe 5'in ölçülen alanıdır, AA, DMB tepe A'nın ölçülen alanıdır ve AB, DMB tepe B'nin ölçülen alanıdır . Spektral analiz yazılımı tarafından üretilen alan birimleri isteğe bağlıdır.
12. Denklemi kullanarak numunedeki PBAT'ın bütilen adipat dimerinin mol sayısını, n_BA'yı hesaplayın
    
    burada A₃, PBAT tepe _3'ün ölçülen alanıdır, A 3', PBAT tepe 3'ün ölçülen alanıdır, A₆, PBAT tepe 6'nın ölçülen alanıdır ve A_6', PBAT tepe 6'nın ölçülen alanıdır. Spektral analiz yazılımı tarafından üretilen alan birimleri isteğe bağlıdır.
13. Numunedeki PBAT kütlesini hesaplayın, m_{PBAT,denklemi kullanarak geri kazanıldı}
    
    burada MM_BA , PBAT'tan (200 g/mol) bir BA dimerinin molar kütlesidir ve MM_BT , PBAT'tan (220 g/mol) bir BT dimerinin molar kütlesidir.
14. Numunede bilinen bir miktarda PBAT mevcutsa, denkleme göre ekstraksiyon verimliliğinin bir ölçüsü olarak numune için geri kazanım yüzdesi (η) hesaplanabilir
    
15. Denklemi kullanarak bir numunedeki (C_{PBAT) PBAT} konsantrasyonunu hesaplayın
    
    burada m_{kuru toprak} , ekstraktı üretmek için kullanılan kuru toprağın kütlesidir (0.1 kg),_{geri kazanılan V çözücü} , adım 2.4'te topraktan geri kazanılan çözücünün hacmidir ve eklenen V_sovlent , toprak numunesine eklenen ilk çözücü miktarıdır (100 mL).

5. Belirli bir topraktan PBAT miktarının belirlenmesi için kalibrasyon eğrisinin hazırlanması

NOT: Bilinen miktarlarda PBAT eklenmiş toprak örneklerine dayalı olarak oluşturulan bir kalibrasyon eğrisi, PBAT'ın belirli bir topraktan nasıl çıkarıldığı ve geri kazanıldığı hakkında yararlı bilgiler sağlayacaktır. Ekstraksiyon, tüm topraklar veya tüm PBAT formları için aynı değildir. Ekstraksiyon verimliliğinin toprak kiline ve organik madde içeriğine³³ bağlı olduğundan şüpheleniyoruz ve her toprak serisi ve ilgilenilen ufuk için bir kalibrasyon eğrisi oluşturulmasını öneriyoruz. Kalibrasyon eğrisi, bilinmeyen numuneler bu yöntemle işlenmeden önce veya sonra oluşturulabilir.

1. Adım 1.1-1.3'te açıklandığı gibi 2,5 kg kuru toprak eşdeğerini toplayın ve hazırlayın.
2. Kalibrasyon eğrisinin kapsayacağı aralığı belirleyin; kalibrasyon eğrisinde kullanılan maksimum PBAT konsantrasyonu, bilinmeyen numuneler arasındaki en yüksek PBAT konsantrasyonundan daha yüksek olmalıdır.
3. Maksimum konsantrasyonun %0, %25, %50, %75 ve %100'ü (toplam 25 numune) ile 100 g topraktan 5 çivili numune oluşturmak için yeterli PBAT plastiği hazırlayın veya edinin. Örneğin, istenen maksimum konsantrasyon 40 mg/kg ise, çivili numuneleri oluşturmak için toplam 50 mg PBAT gerekecektir.
4. Her biri 100 g topraktan oluşan 25 numune hazırlayın. PBAT bazlı plastiği tartarak ve öngörülen oranlarda toprak numunelerine ekleyerek numuneleri çivileyin. Örneğin, istenen maksimum konsantrasyon 40 mg/kg PBAT ise, PBAT'sız 5 örnek, 1 mg PBAT'lı 5 örnek, 2 mg PBAT'lı 5 örnek, 3 mg PBAT'lı 5 örnek ve 4 mg PBAT'lı 5 örnek oluşturun. Toprağa PBAT ekledikten sonra iyice karıştırın.
5. 25 çivili örnekten PBAT'ı çıkarın, ardından ekstraktlardan NMR spektrumlarını toplayın ve elde edilen spektrumları 2.1 ila 4.16 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi analiz edin.
6. Her çivili numunede ölçülen PBAT miktarı ile istatistiksel bir analiz aracına eklenen gerçek PBAT miktarı arasında doğrusal bir regresyon gerçekleştirerek bu toprakta PBAT için bir kalibrasyon eğrisinin denklemini tanımlayın. Bir elektronik tablo kullandık. PBAT eklenmemiş çivili örneklerde PBAT algılanmazsa, regresyonda b = 0'ı zorlayın.
   NOT: Doğrusal regresyon testi, y = mx + b ilişkisine göre iki sürekli sayısal değişken x ve y arasındaki doğrusal ilişkinin gücünü değerlendirir. Verilere en uygun m ve b değerleri test tarafından hesaplanır. Regresyon testinin r² katsayısı, iki değişkenin birbiriyle ne kadar yakından ilişkili olduğunu tanımlar.
7. İstatistiksel analiz aracını kullanarak ekstraksiyon verimliliği ile PBAT konsantrasyonu arasında anlamlı bir ilişki olup olmadığını test edin. Çivili numunelerden PBAT'ın ekstraksiyon verimliliğini şu şekilde hesaplayın:
   
8. Ekstraksiyon verimliliği ile PBAT konsantrasyonu arasında bir korelasyon olmadan gözlemlenen verilerin rastgele oluşma olasılığını hesaplamak için istatistiksel analiz aracını kullanın. Bu p değeri, α önceden belirlenmiş anlamlılık eşiğinden büyükse, iki değişken arasında bir ilişki olmadığı şeklindeki sıfır hipotezini reddedemez. Bu durumda, ekstraksiyon verimliliğinin test edilen aralıktaki tüm PBAT konsantrasyonları için sabit olduğu varsayılabilir. Sıfır hipotezi reddedilirse, burada açıklanan doğrusal model verileri modellemenin en iyi yolu olmayabilir.
9. Bu yöntem kullanılarak işlenen bilinmeyen örneklerdeki PBAT miktarını tahmin etmek için kalibrasyon eğrisi doğrusal regresyon denklemini kullanın. Regresyon x değişkeni, kalibrasyon eğrisi çivili numunelerdeki gerçek PBAT miktarıysa, y değişkeni ölçülen PBAT miktarıydı ve b 0 olarak ayarlandıysa, o zaman
   
   NOT: Bir kalibrasyon eğrisi denklemi kullanılarak tahmin edilen tekrarlanan numunelerin PBAT içeriği, belirli bir topraktaki PBAT miktarı için bir güven aralığı oluşturmak için kullanılabilir veya tekrarlanan ekstraktlardaki PBAT konsantrasyonları için bir ortalama ve güven aralığı hesaplanabilirse, daha sonra topraktaki PBAT konsantrasyonunu tahmin etmek için kalibrasyon eğrisi uygulanabilir. Her iki işlem sırası da topraktaki PBAT içeriği için aynı güven aralığını üretir. Örneğin, PBAT konsantrasyonları 10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 ve 5 mg/kg olan 10 kopya numuneden alınan ekstraktları ve kalibrasyon eğrisi denklemi y _{(ekstraktta ölçülen PBAT)} =0.75 x _{(toprakta gerçek PBAT)} olan ekstraktları düşünün. Her bir kopyadaki toprak PBAT konsantrasyonları 13, 7, 3, 5, 13, 15, 3, 8, 11 ve 7 mg / kg olarak tahmin edilebilir. Daha sonra topraktaki ortalama PBAT konsantrasyonu, 4,4 mg/kg'lık bir standart sapma ile 8,4 mg/kg olarak tahmin edilecektir. Ekstrakt PBAT konsantrasyonları (10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 ve 5) için ilk olarak bir ortalama ve standart sapma hesaplanırsa, ortalama 6.3 mg / kg ve 3.3 mg / kg'lık bir standart sapma hesaplanacaktır. Daha sonra, topraktaki PBAT konsantrasyonunu tahmin etmek için kalibrasyon eğrisi hem ortalama hem de standart sapmaya uygulanabilir: ortalama 8.4 mg / kg, standart sapma 4.4 mg / kg.

Bu yöntemin topraktan PBAT polimerinin miktarını belirlemedeki etkinliğini değerlendirmek için, üç farklı topraktan oluşturulan çivili numunelerden PBAT ekstrakte edilerek kalibrasyon eğrileri oluşturuldu. Üç toprağın her biri için ( Tablo 3'teki detaylar), toprak 2 mm'lik bir elekten geçirildi ve daha sonra havayla kurutuldu. Çivili numuneler, 100 g kuru toprağa (her birinden 5 kopya) 0, 9, 18, 27 veya 36 mg PBAT bazlı MP eklenerek oluşturuldu. Bu, 0, 63, 126, 189 veya 252 mg / kg PBAT polimerine eşdeğerdir. MP'ler, Astner ve ^ark.45'te açıklanan öğütme prosedürüne göre kütlece %70 PBAT ve 50 μm kalınlığa sahip plastik malçtan yapılmıştır ve 840 μm'den daha küçüktür. Her bir kalibrasyon eğrisini oluşturmak için, yukarıda tanımlanan prosedür izlenerek her çivili numuneden PBAT ekstrakte edildi. PBAT geri kazanımı daha sonra her bir numuneye eklenen PBAT miktarı ile karşılaştırıldı. PBAT geri kazanım oranı ve miktar tayini, bir toprakta (Gölgeli balçık) NP'ler (ortalama çap 780 nm, polidispersite indeksi 0.77, Astner ve ^ark.45'e göre hazırlanmış) için de test edildi.

Tüm topraklar için, PBAT eklenmemiş numunelerde PBAT tespit edilmedi, yani bu yöntemle yanlış pozitif gözlenmedi. Ek Şekil 1 , PBAT içermeyen (ve hazırlama işlemi sırasında eklenen DMB içeren) Gölgeli bir tınlı topraktan toplanan bir spektrumu göstermektedir. Dahili kalibre DMB'den gelen iki karakteristik tepe noktası mevcuttur, ancak PBAT karakteristik tepe noktaları mevcut değildir. PBAT eklenmiş topraklar için, PBAT'ı tanımlamak için kullanılan beş karakteristik tepe mevcuttu. Şekil 2 , 63 mg / kg PBAT eklenmiş bir Gölgeli tınlı topraktan toplanan bir spektrumu göstermektedir. Miktar tayininde kullanılan tüm PBAT ve DMB tepe noktaları net bir şekilde çözülür. Ek Şekil 2 , Şekil 2'de gösterilen spektrumun takılan bölgesini entegre tepe noktaları üst üste bindirilmiş olarak göstermektedir. 3, 3', 6 ve 6' tepe noktalarının spektrumdaki diğer sinyallerle örtüşmesi nedeniyle, PBAT içeriğini basit tepe integralleri yerine takılan tepe noktalarının integrallerine dayalı olarak hesaplamak önemlidir. Bu, toprak ekstraktının diğer bileşenlerinin katkıda bulunduğu alanı ve üst üste binen PBAT zirvelerinden kaldırır. Ek Şekil 3 , seyreltmenin NMR spektral çözünürlüğü üzerindeki etkilerini göstermektedir. Şekil, 252 mg / kg PBAT eklenmiş bir Elkhorn kumlu balçıktan toplanan bir spektrumu göstermektedir. Panel A'da, 3 - 3 ppm aralığındaki 6, 4.5 ', 4.0 ve 4.0' PBAT tepe noktaları çözülemez. Ek Şekil 3B , ilave döteryumlu kloroform ile 1:5 oranında seyreltildikten sonra aynı numuneden toplanan bir spektrumu göstermektedir. Seyreltmeden sonra, dört tepe belirgindir ve alanları uygun hale getirilebilir.

Kalibrasyon eğrileri, test ettiğimiz üç toprak arasında değişiyordu. Şekil 4, toprağa eklenen gerçek PBAT (C_PBAT,a) miktarına kıyasla her bir ekstraktta ölçülen_{PBAT'a (C PBAT,m}) dayalı olarak her bir toprağın tahmini PBAT konsantrasyonlarını göstermektedir. Gölgeli tınlı topraklardan geri kazanılan PBAT miktarı, eklenen PBAT miktarı ile güçlü bir şekilde korele edildi (r² = 0.99). Kalibrasyon eğrisi denklemi için C_PBAT,m = m*C_PBAT,a, m = 0,76 ± 0,02 (ortalama ± bir standart hata) ve m sıfırdan önemli ölçüde farklıydı (df = 24; F = 2000; p < 1*^10-16). PBAT bu topraktan η = %76 ± %10 (ortalama ± bir standart sapma) verimlilikle geri kazanılmıştır. Gölgeli topraktan ekstraksiyon verimliliği, numunelerdeki PBAT miktarı ile ilişkili değildi (r² = 0.009; p = 0.7). NP, η = %59 ± %8 (ortalama ± bir standart sapma) verimlilikle geri kazanıldı. Şekil 5, Gölgeli balçıktan MP'lerin ve NP'lerin ekstraksiyon verimliliğini göstermektedir; etkinlik NP için anlamlı olarak daha düşüktü (p = 0.0002). Los Osos tınından geri kazanılan PBAT miktarı, eklenen PBAT miktarı (r² = 0.85) ile Gölgeli toprağa göre daha az güçlü bir şekilde ilişkilendirildi. Kalibrasyon eğrisi denklemi için C_PBAT,m = m*C_PBAT,a, m = 0.57 ± 0.05 (ortalama ± bir standart hata) ve m sıfırdan önemli ölçüde farklıydı (df = 23; F = 100; p = 8^*10-11). PBAT, bu topraktan η = %57 ± %22 (ortalama ± bir standart sapma) verimlilikle geri kazanılmıştır. Los Osos toprağındaki ekstraksiyon verimliliği, numunelerdeki PBAT miktarı ile ilişkili değildi (r² = 0.01; p = 0.6). Elkhorn kumlu balçıktan geri kazanılan PBAT miktarı, eklenen PBAT miktarı ile güçlü bir şekilde korele edildi (r² = 0.88). Kalibrasyon eğrisi denklemi için C_PBAT,m = m*C_PBAT,a, m = 0.70 ± 0.05 (ortalama ± bir standart hata) ve m sıfırdan önemli ölçüde farklıydı (df = 23; F = 200; p = 5^*10-12). PBAT, bu topraktan η = %70 ± %14 (ortalama ± bir standart sapma) verimlilikle geri kazanılmıştır. Ekstraksiyon verimliliği, Elkhorn toprağı için numunelerdeki PBAT miktarı (r² = 0.006; p = 0.7) ile ilişkili değildi.

Ayrıca, bu yöntem, bir Elkhorn serisi toprakta PBAT'ın miktarını belirlemek için uygulandı. Bu deneyde, Elkhorn toprağı bir tarım alanı içindeki iki bölgeden toplandı, 2 mm'lik bir elek ile elendi ve daha sonra hava ile kurutuldu. Toprak, PBAT bazlı malç MP'leri (yukarıda tarif edildiği gibi oluşturulmuş, çap < 840 μm), her mezokozmda 50 mg MP ve 150 g kuru toprak (250 mg / kg PBAT) ile karıştırılarak A bölgesinden toprağa karıştırılmış MP'lerle 5 mezokozm ve B bölgesinden toprağa karıştırılmış MP'lerle 5 mezokozm oluşturuldu (toplam 10). Milletvekilleri eklenmeden her bölgeden topraktan oluşan beş mezokozm, negatif kontrol görevi gördü (toplam 10). Mezokozmlar, PBAT bazlı malç milletvekillerinin biyolojik bozunmasını araştırmak için 6 ay boyunca kuluçkaya yatırıldı. İnkübasyon sırasında, kümülatif toprak solunumu, üst boşluk_CO2 konsantrasyonları (bir kızılötesi gaz analizörü kullanılarak) yoluyla ölçüldü ve PBAT bozulmasını ölçmek için kullanıldı. İnkübasyon sonunda mezokozmlarda kalan plastik miktarı şu şekilde hesaplanmıştır:

_{Plastikten C Frac, final} = [m_{Plastik, i} / C_{frac plastik} - (C_{CO2, plastik eklendi} - C_{CO2 plastik yok})*m_{kuru toprak}]/(m_{Plastik, i}/ C_{frac plastik})

m_{kuru toprak} , her bir inkübasyon kavanozundaki toprak miktarıdır, C_{frac Plastik} , eklenen mikroplastiklerin karbon içeriğidir, C_{CO2, plastik eklenen,} kuru toprağın gramı başına plastik eklenen bir mezokozmda üretilen kümülatif CO₂ miktarıdır, C_{CO2 plastiksiz} , bir gram kuru toprak başına plastik eklenmemiş bir mezokozmda üretilen CO₂ miktarıdır, ve m_{plastik, i} eklenen plastiğin ilk kütlesidir.

Her bir bölgeden 10,000 deneysel mezokozmin rastgele eşleşmelerinin 10 teorik alt örneği ile kalan plastiği hesaplayarak A ve B topraklarında kalan plastik için güven aralıklarını tahmin etmek için önyüklemeyi kullandık. A bölgesinde, solunum verilerinden kalan tahmini ortalama plastik %86 idi ve önyüklemeli %95 güven aralığı aralığı %62 ila %>100 arasındaydı. B bölgesinde, kalan tahmini ortalama plastik %98 idi ve %95 güven aralığı aralığı %79 >ila %100 arasındaydı. 6 ayın sonunda, PBAT içeriği de bu makalede açıklanan ekstraksiyon ve NMR miktar tayini yöntemiyle ölçülmüştür (A bölgesi için n = 5 ve B bölgesi için n = 4). A bölgesinde, NMR verilerinden kalan tahmini ortalama plastik %79 idi ve %95 güven aralığı (ortalama 1.96xSE ±) %71 ile %87 arasında değişiyordu. B bölgesinde, kalan tahmini ortalama plastik miktarı %88 idi ve %95 güven aralığı aralığı %71 ile %100 arasındaydı. Şekil 6 , iki farklı yöntemle tahmin edilen iki bölgeden elde edilen toprağın plastik içeriği için güven aralıklarını göstermektedir. İki yöntemden elde edilen plastik içerik tahminleri, her bir güven aralığı çifti arasındaki örtüşmenin büyük kısmına bağlı olarak karşılıklı olarak tutarlı görünmektedir.

Şekil 1: Polibütilen adipat tereftalat (PBAT) ekstraksiyon ve miktar tayini prosedürüne görsel genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Polibütilen adiptat tereftalat (PBAT) MP'leri olan Gölgeli tınlı bir topraktan alınan bir ekstrakt üzerinde 500 MHz'lik bir spektrometreye sahip döteryumlu kloroform çözücü içinde toplanan ¹H-NMR spektrumu. NMR analizinden önce ekstrakta dahili bir kalibrant olarak 1,4-Dimetoksibenzen (DMB) ilave edildi. Spektrumda hem PBAT hem de DMB karakteristik tepe noktaları bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Etiketli protonlara sahip polibütilen adipat tereftalat (PBAT) ve 1,4-dimetoksibenzen (DMB) yapıları. Karşılık gelen yapılar Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmiştir. (A) Bir BA-BT PBAT ünitesinin yapısı. (B) PBAT'tan T-B-T, T-B-A ve ABA üçlülerinin yapısı. (c) DMB'nin yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Gölgeli tınlı bir toprağın, bir Los Osos balçıkının ve bilinen miktarlarda PBAT içeren bir Elkhorn kumlu balçıkın döteryumlu kloroform çözücüsündeki ekstraktlarda ¹H-QNMR ile ölçülen PBAT konsantrasyonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Gölgeli tınlı bir toprakta çivili numunelerden PBAT MP'lerinin ve NP'lerin ekstraksiyon verimliliği. PBAT geri kazanımı NP'ler için anlamlı olarak daha düşüktür (p = 0.0002). Her kutunun orta çizgisi, ölçülen veri noktalarının ortalamasını temsil ederken, kutunun üst ve alt sınırları sırasıyla Q3 ve Q1'i yansıtır. Yatay çizgilerin üst ve alt sınırları, sırasıyla maksimum ve minimum veri noktalarını yansıtır. Kutu ve yatay çizgiler içinde tek tek veri noktaları gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: İki Elkhorn toprağının plastik içeriği, kümülatif inkübasyon solunumu ve NMR ile birleştirilmiş solvent ekstraksiyonu ile ölçüldü. Solunumla ölçülen plastik içerik için çubuklar, önyüklemeli %95'lik bir güven aralığını temsil eder. NMR ile ölçülen plastik içerik için çubuklar, ortalama tahminin üstünde ve altında iki kat standart hataya dayalı olarak %95'lik bir güven aralığını temsil eder (a bölgesi için n = 5 ve b bölgesi için n = 4). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Döteryumlu kloroform çözücü içinde polibütilen adiptat tereftalatın (PBAT) 1 H-NMR spektral zirveleri. Her bir tepe noktasına atfedilen hidrojenler Şekil 3'te etiketlenmiştir. Tepe atamaları Herrera ve ^ark.27'ye dayanmaktadır.

Tablo 2: Döteryumlu kloroform çözücü içinde 1,4-dimetoksibenzenin (DMB) ¹H-NMR tepe noktaları. Her bir tepe noktasına atfedilen hidrojenler Şekil 3B'de etiketlenmiştir. Tepe atamaları Nelson ve ^ark.33'e dayanmaktadır.

Tablo 3: PBAT ekstraksiyon yöntemini göstermek için kullanılan üç toprağın özellikleri.

Ek Şekil 1: ^PBATpolimeri bulunmayan bir Shady balçık ekstraktı üzerinde 500 MHz'lik bir spektrometre ile döteryumlu kloroform çözücü içinde toplanan 1 H-NMR spektrumu. PBAT karakteristik tepe noktaları mevcut değildir, DMB (dahili kalibant olarak eklenir) tepe noktaları mevcuttur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Şekil 4'te gösterildiği gibi ¹H-NMR spektrumunun takılan bölgesi. Spektrum, döteryumlu kloroform çözücü içinde toplandı. Yeşil arka plan, spektrumun uygun olan bölgesini gösterir. Mor çizgiler takılan tepe noktalarını gösterirken, kırmızı çizgiler hatayı gösterir (spektrum sinyalinin bazı kısımları takılan tepe noktalarına dahil değildir). PBAT tepe noktaları 5, 6, 6 ', 3' ve 3, DMB tepe noktaları A ve B ile birlikte uyuma dahildir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: PBAT MP'leri eklenmiş bir Elkhorn kumlu balçık ekstraktı üzerinde 500 MHz'lik bir spektrometre ile toplanan döteryumlu kloroform çözücü içinde ¹H-NMR spektrumu. Spektrumda hem PBAT hem de DMB karakteristik tepe noktaları bulunur. (A) Polimeri ölçmek için PBAT tepe noktaları ayırt edilemez. Numune ekstraktları bu şekilde spektrumlar üretirse, numuneyi seyreltin ve ardından yeni bir ¹H-NMR spektrumu toplamak için kullanın. (B) Aynı ekstrakt, tüm spektral zirvelerin net bir şekilde çözülmesi için seyreltilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ekstrakttaki PBAT'ı ölçmek için ¹H-NMR ile birleştirilmiş PBAT'ın topraktan çözücü ekstraksiyonu için bir yöntem öneriyoruz. Ekstraksiyon işleminin temel unsurları, ekstraksiyon tekniği ve ekipmanı, ekstraksiyon için kullanılan çözücü ve zaman gereksinimlerini içerir. Nelson ve ^ark.33 tarafından gösterilen Soxhlet ekstraksiyonu ve hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu (ASE) ile karşılaştırıldığında nispeten basit ve ucuz ekipman (cam kavanozlar, cam boncuklar ve bir çalkalayıcı masası) gerektiren bir ekstraksiyon tekniği kullanmayı seçtik. Bu yöntemin amacı, dökme toprak numunelerinin işlenmesindeki hıza paralel olarak birçok numunenin ekstrakte edilebilmesidir. Basit çözücü çalkalama ekstraksiyonunun bir başka avantajı, Soxhlet veya ASE yaklaşımlarına kıyasla daha büyük hacimlerde toprağın yerleştirilebilmesidir ve bu da çevreyi temsil eden numunelerin daha kolay işlenmesine olanak tanır^13,36. Nelson ve ^ark.33 tarafından sunulan başarılı sonuçlara ve ¹H-NMR çözücü olarak döteryumlu kloroformun mevcudiyetine dayanarak kloroform-metanol çözücü çözeltisini seçtik. Nelson ve ^ark.33'te açıklanan protokolle uyumlu çözücü-matris karışımlarının ultrasonikasyonunu basit çözücü çalkalama yöntemiyle karşılaştırıldığında test ettik ve iki yöntem arasında PBAT geri kazanım oranlarında önemli bir fark bulamadık. Test ettiğimiz üç toprak için 8 g toprak matrisindeki toprak agregalarını kırmak için 200 rpm'de 100 saatlik çalkalamanın yeterli olduğunu, daha kısa sarsıntı sürelerinin veya daha düşük sarsıntı hızlarının yetersiz olduğunu bulduk. Daha sonra toprak parçacıkları olmadan çözücüyü geri kazanmak için çökeltme gerekliydi. PBAT geri kazanımı nano boyutlu plastiklerle test edildi ve geri kazanım milletvekillerininkinden önemli ölçüde daha düşüktü. Bu, bilinmeyen NP'lerin çevresel örneklerini doğru bir şekilde ölçmek için yöntemin daha fazla geliştirmeye ihtiyaç duyabileceği anlamına gelir, ancak NP'lerin kısmi geri kazanımı ve ölçümü, bu yöntemle partikül boyutu bilgisi elde edilemese de, diğer boyut sınırlı yöntemlere kıyasla hala değerlidir.

Nelson ve ^ark.33, bir ultrasonikasyon ekstraksiyon yöntemi için% 100'e yakın ekstraksiyon verimlilikleri bildirirken, ultrasonikasyon ve burada açıklanan çalkalayıcı bazlı ekstraksiyon yönteminin her ikisinin de% 100'ün altında ekstraksiyon verimliliğine yol açtığını bulduk. Bunun, plastik malç üzerindeki fotooksidasyon da dahil olmak üzere çevresel ayrışmanın etkilerinden kaynaklanabileceğine inanıyoruz. Nelson ve ^ark.33, UV ışınlanmış PBAT MP'leri için hava koşullarına maruz kalmamış malzemeye kıyasla ekstraksiyon verimliliğinin önemli ölçüde azaldığını gözlemledi. Bu niceleme yöntemini test etmek için kullandığımız plastik, MP'lere işlenmeden önce tam bir büyüme mevsimi boyunca güneş ışığında sahada yıprandı. Ticari plastik malç filmlerine eklenen foto-stabilizatörlere rağmen, malçların polimerinin yapısı UV radyasyonu nedeniyle değişir (örneğin, malzemenin jel içeriğini artıran zincir çapraz bağlanması)⁴⁶ çevresel hava koşullarında ve polimerin bozunması NMR spektrumunu^{değiştirebilir 47}. Bu, Nelson ve ^ark.33 ile karşılaştırıldığında gözlemlediğimiz daha düşük PBAT geri kazanım oranlarına katkıda bulunabilir. Ayrıca, PBAT ekstraksiyon verimliliğinin test ettiğimiz üç toprak arasında değiştiğini bulduk. Gölgeli toprak çoğunlukla düşük aktiviteli killer içerirken, diğer iki toprak smektitik (Los Osos) ve karışık, süper aktif (Elkhorn) killere sahiptir. Yüksek aktivite ve 2:1 kil minerallerinin varlığı, bu topraklardan ^33,48 PBAT'ın çözücü ekstraksiyonunu engellemiş olabilir^ve bu da gözlemlediğimiz daha düşük PBAT geri kazanımına yol açmış olabilir. PBAT dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen MP'ler ve NP'lerin yanı sıra geleneksel bozunmayan polimer MP'ler ve NP'ler için topraktaki plastik-mineral ilişkilerini araştıran daha fazla araştırma yapılmasını öneriyoruz. Bu, hem MP polimerlerinin topraktan nasıl çıkarılabileceğini ve ölçülebileceğini anlamak hem de biyolojik olarak nasıl parçalanabileceklerini veya toprak sistemlerini başka bir şekilde nasıl etkileyebileceklerini anlamak için önemlidir.

NMR spektrum toplama işleminin temel unsurları arasında cihaz mıknatıs gücü, kullanılan tarama sayısı, taramalar arasındaki numune gevşeme süresi ve numune başına toplam ölçüm süresi yer alır. 500 MHz'lik bir spektrometre kullandık; daha yüksek manyetik alan kuvvetleri, NMR spektrumlarında daha fazla hassasiyet ve çözünürlük sağlar. Spektral sinyal-gürültü oranı, aynı numunenin tekrarlanan taramaları toplanarak ve bunları bir araya getirerek artırılabilir. N taramanın toplanması, sinyal-gürültü oranını √ kat artıracak, ancak ölçüm süresini n²⁹ kat artıracaktır. Bu, bir numunedeki PBAT'ı ölçmek için daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına ihtiyaç duyulursa, daha uzun numune çalışma süreleri pahasına tarama sayısının artırılabileceği anlamına gelir. Niceleme 44'te %<1'lik bir hatayı korumak için belirli bir sinyal için^150'lik bir sinyal-gürültü oranı gereklidir. Elde etme parametrelerimiz (alet, prob, tarama sayısı) altında, 150'lik bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için numune başına yaklaşık 5 mg PBAT (veya mL ekstrakt başına 50 μg PBAT) gerekliydi ve bu nedenle miktar belirlemede %<1 hata; Bu konsantrasyon, veri toplama kurulumumuza özgüdür. Bu PBAT konsantrasyonu, toprak ^16,24 yokluğunda diğer MP türlerini ölçmek için 1 H-NMR kullanan diğerleri tarafından elde edilen miktar belirleme sınırlarından daha yüksektir ve bu da toprak organik maddesinin ve diğer birlikte ekstrakte edilen bileşiklerin miktar belirleme yöntemi üzerindeki etkisini gösterir. Ölçülebilir PBAT aralığı, numune başına 25 mg'dan (mL ekstrakt başına 250 μg PBAT) daha yüksek PBAT konsantrasyonlarında görülen çizgi genişlemesi nedeniyle üst uçta da sınırlıdır, bu da temsili sonuçlarda açıklandığı gibi PBAT tepe örtüşmesine yol açmıştır ve Ek Şekil 3'te gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, numunelerin ölçülebilir olmasını sağlamak için bu sınırlamalara yanıt vermede esneklik sağlar. Ekstraktları oluşturmak için kullanılan toprak miktarı arttırılabilir veya azaltılabilir ve ekstraktlar, PBAT konsantrasyonunu optimum aralığa ayarlamak için seyreltilebilir ve yeniden analiz edilebilir.

NMR spektrumlarına dayalı olarak PBAT'ı ölçme sürecinin temel unsurları arasında PBAT'ı ölçmek için kullanılan tepe noktaları, tepe alanlarını hesaplamak için hat uydurma kullanımı ve kalibrasyon eğrisi yer alır. Kavramsal olarak, herhangi bir PBAT ve DMB tepe noktası çifti, bir numunedeki iki bileşiğin oranını hesaplamak için karşılaştırılabilir. BT: DMB oranını 5: A tepe alanlarının ve 5: B tepe alanlarının ortalaması (ilgili proton sayıları ile normalleştirilmiş) olarak hesapladığımızda en doğru sonuçları bulduk. PBAT tepe 5 sadece 1,4-bütandiol-tereftalat (BT) monomerinin miktar tayinini sağlar, bu nedenle 3 ve 3' tepe alanı (1,4-bütandiol-adipat veya BA monomerini temsil eder) numunede bulunan BA gruplarını ölçmek için 6 ve 6' tepe (BT monomerini temsil eder) alanıyla karşılaştırıldı. BT ve BA miktarı, kalan toplam PBAT miktarını temsil edecek şekilde toplandı. 2.7-0.7 ppm aralığında çok sayıda geniş tepe oluşturan koekstrakte edilmiş bileşiklerin (toprak organik maddesi olduğu varsayılmaktadır) girişimi nedeniyle BA kantitasyonunda PBAT tepe 1 veya 2'yi kullanmak mümkün değildi. Bu istenmeyen sinyalleri arka plan düzeltmesi ile spektrumlardan kaldırmayı araştırdık (yani, her örnek spektrumundan boş bir spektrum çıkarmak), ancak bir kalibrant kullanmadan eşdeğer karşılaştırılabilir arka plan ve numune spektrumları oluşturmanın güvenilmez olduğunu gördük. Spektral tepe noktalarını doğrudan entegre etmek yerine, takılan tepe noktalarının alanını hesaplamak için hat uydurma kullanıldı. PBAT 3 ve 3' tepe noktaları ile 6 ve 6' tepe noktaları arasındaki örtüşme nedeniyle, bu, ön analize dayalı olarak PBAT içeriğinin daha doğru tahminlerini sağladı. Farklı topraklardan değişen PBAT geri kazanım oranlarını hesaba katmak için bir kalibrasyon eğrisi oluşturulmasını öneririz. PBAT geri kazanım oranları, kalibrasyon eğrisi eğimi için örtüşmeyen% 95 güven aralıkları ile belirtildiği gibi, test ettiğimiz üç topraktan bir çift için önemli ölçüde farklıydı. Üçüncü bir topraktaki PBAT geri kazanımı, diğer ikisinden de önemli ölçüde farklı değildi. Toprak bileşiminin PBAT geri kazanımını nasıl etkilediğine dair mekanik bir anlayışın yokluğunda, ilgilenilen her toprak serisinde ve bir toprak profili içindeki her ufuk için PBAT geri kazanımını değerlendirmek için kalibrasyon eğrilerinin oluşturulmasını öneririz. Kalibrasyon eğrilerinin topraklar arasında istatistiksel olarak benzer olduğu bulunursa, topraklar kombinasyon halinde kolayca analiz edilebilir.

Bu yöntemin, topraktaki PBAT MP'lerini ve NP'leri ölçmekle ilgilenenlere, özellikle benzer topraklarda toplanan çok sayıda numunede, örneğin uzun vadeli bir plastik biyolojik bozunma saha çalışmasında PBAT'ı ölçmek için değerli bir araç sağlayabileceğine inanıyoruz. Topraktan MP'leri ölçmek için bir NMR yöntemi değerlidir, çünkü NMR'ye erişimi ve uzmanlığı olan araştırmacıların, toprak sistemlerinde MP'lerin varlığı ve davranışı hakkında önemli soruları yanıtlayarak ortaya çıkan alanın ihtiyaçlarının karşılanmasına katkıda bulunmalarına olanak tanır. Enstrümantasyon ve uzmanlığa erişim, araştırmacıların niceleme tekniklerinin seçimini sınırlayan ilk pratik kaygılardan bazıları olsa da, NMR, her koşulda topraktan mikroplastiklerin miktarını belirlemek için en verimli veya en uygun araç değildir. Partikül şekli ve boyutu bilgisi bir solvent ekstraksiyon tekniği ile elde edilemez; MP şekli ve boyutu ilgi çekiyorsa, araştırmacılara FTIR veya Raman spektroskopisi gibi bireysel MP parçacıklarını tanımlamak için bir teknikle daha iyi hizmet verilecektir. Burada ve Nelson ve ^ark.33'te sunulanlar gibi solvent ekstraksiyon yöntemlerinin, FTIR veya Raman spektroskopisi gibi diğer MP miktar tayin yaklaşımlarına kıyasla bir avantajı, kavramsal olarak MP'ler ve NP'ler için nicelleştirilebilecek bir boyut sınırı olmamasıdır; Solvent ekstraksiyonu, partikül boyutu bilgisi gerekli olmadığında veya ilgilenilen partiküllerin başka yollarla ayrılması çok zor olduğunda en faydalı olabilir. Piroliz GCMS, NMR'den daha yüksek bir hassasiyete sahip olduğu için değerli olabilir, ancak sonuçlar, PBAT çözücü ekstraksiyonu muhtemelen olduğu gibi matris etkilerine de tabidir.

Daha fazla çalışmanın, NMR spektrumlarında PBAT tepe çözünürlüğüne müdahale eden birlikte çıkarılan toprak bileşenlerini ele alarak bu yöntemin sağlamlığını artıracağını umuyoruz. Bu yöntem aracılığıyla PBAT plastik ayrışma ve ekstraksiyon verimlilikleri arasındaki ilişkiyi kurmak için, belki de PBAT bozunma ürünlerinin ve bunların ¹H-NMR spektrumlarının daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasıyla birlikte daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Sonuçlarımıza ve Nelson ve ^ark.33'ün sonuçlarına dayanarak, bu miktar belirleme prosedürü, düşük organik maddeli ve yüksek aktiviteli killer içermeyen topraklarda yıpranmamış PBAT plastiklerinin miktarını belirlemek için en iyi performansı gösterir. Bu yöntemi yalnızca topraktan PBAT bazlı MP'leri ölçmek için kullanmış olsak da, çözücü ekstraksiyonu ve ¹H-NMR miktar tayini prosedürü, ek topraklardan diğer MP'leri ve NP'leri ölçmek için yararlı olabilir^26,49. Yöntemin başka bir polimerden yapılmış MP'leri kapsayacak şekilde genişletilmesi, polimerin çözücü içindeki çözünürlüğünün sağlanmasını ve seçilen çözücüdeki polimerden karakteristik NMR piklerinin tanımlanmasını gerektirir. Seçilen çözücüde çözünür olan ve ilgilenilen polimerin⁴² taneleriyle örtüşen tepe noktaları üretmeyen yeni bir iç kalibrantın seçilmesi gerekebilir.

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

SMS'e 2020-67019-31167 numaralı ödül numarasıyla bu projeyi finanse ettiği için USDA-NIFA'ya ve dahili bir hibe DGH ve SMS için Tennessee Üniversitesi Stratejik Planlama Araştırma Girişimleri (SPRINT) programına teşekkür ederiz. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama, analiz, yorumlama, rapor yazma veya makaleyi yayınlanmak üzere gönderme kararında hiçbir rolü yoktu.