Hepatosellüler Karsinomda Sistemik ve Lokal İmmün Yanıtların Kütle Sitometrisi Analizi

Bu protokol, hepatoselüler karsinomda (HCC) hem sistemik hem de lokal immün yanıtları değerlendirmek için kapsamlı bir kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) analiz yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Yaklaşım, tümör mikro çevresi ve ilişkili bağışıklık mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayış sunarak HCC'nin bağışıklık manzarası hakkında bilgi sağlamayı amaçlamaktadır.

Hepatosellüler karsinom (HCC), dünya çapında karaciğer kanserinin en yaygın ve en ölümcül formlarından biridir. Tedavideki ilerlemelere rağmen, HCC hastalarının prognozu, ilerlemesini yönlendiren genetik, çevresel ve immünolojik faktörlerin karmaşık etkileşimi nedeniyle zayıf kalmaktadır. HCC'nin bağışıklık ortamını anlamak, özellikle hasta sonuçlarını iyileştirmek için büyük vaatlerde bulunan immünoterapi alanında etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Bu çalışma, HCC'li hastalarda hem sistemik hem de lokal immün yanıtları araştırmak için kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) teknolojisini kullanmaktadır. Araştırma, periferik kan ve tümör örneklerini analiz ederek, benzersiz bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve bunların HCC ilerlemesi ile ilişkili fonksiyonel durumlarını tanımlamayı amaçlamaktadır. Bulgular, potansiyel biyobelirteçleri ve terapötik hedefleri vurgulayarak HCC'deki bağışıklık ortamına kapsamlı bir genel bakış sağlar. Bu yaklaşım, HCC'nin altında yatan bağışıklık mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve bu malignite için daha etkili immünoterapilerin geliştirilmesinin yolunu açar.

Hepatosellüler karsinom (HCC) en sık görülen primer karaciğer kanseridir ve yüksek insidansı ve mortalite oranları nedeniyle önemli bir küresel sağlık sorunudur¹. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, HCC dünya çapında en sık görülen beşinci kanser ve kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olarak yer almaktadır². Özellikle Doğu Asya ve Sahra altı Afrika gibi kronik hepatit B ve C enfeksiyonu oranlarının yüksek olduğu bölgelerde yaygındır³. Majör risk faktörleri arasında viral hepatit, siroz ve metabolik sendrom^{bulunur 4}. HCC, uzun süreli tedavi gerektirir, önemli fiziksel ve mali yükler getirir ve etkili önleme, erken teşhis ve yenilikçi tedavi stratejilerine duyulan ihtiyacın altını çizer⁵.

Bağışıklık sistemi, HCC'nin gelişiminde çok önemli bir rol oynar. Karaciğer, anormal hücrelerin izlenmesi ve ortadan kaldırılması için gerekli olan karaciğerde yerleşik makrofajlar, doğal öldürücü (NK) hücreler ve T hücreleri dahil olmak üzere bol miktarda bağışıklık hücresine sahip immünolojik olarak aktif bir organdır⁶. Bununla birlikte, HCC, immünosüpresif molekülleri eksprese ederek, immünosüpresif hücreleri işe alarak ve tümör mikroçevresini değiştirerek immün sürveyanstan kaçınabilir ^7,8. Bu immün kaçış sadece tümör büyümesini ve metastazı teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda immünoterapiye yanıtı da etkiler ^9,10.

Tümör mikroçevresindeki sistemik ve lokal immün yanıtlar, kanserin ilerlemesini ve terapötik sonuçları etkileyen anahtar faktörlerdir. Sistemik bağışıklık tepkileri, periferik T hücreleri, NK hücreleri ve vücuttaki tümör hücrelerini hedef alabilen monositler gibi uzak tümör hücrelerini tanıyabilen ve bunlara saldırabilen dolaşımdaki bağışıklık hücrelerini içerir. Lokal immün yanıtlar, tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler), tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar) ve düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) dahil olmak üzere tümör mikroçevresi içindeki immün hücre aktivitesine odaklanır. TIL'ler sıklıkla tümör hücrelerine karşı sitotoksik etkiler gösterirken, TAM'ler ve Treg'ler tipik olarak tümör büyümesini destekleyen immünosupresif bir ortama katkıda bulunur^11,12. Tümör hücreleri ve stromal hücreler, immünosupresyona teşvik etmek ve immün sürveyansın kaçışını önlemek için tümör mikroçevresini yeniden şekillendirebilir. Sistemik ve lokal immün yanıtlar arasındaki etkileşim, anti-tümör bağışıklığının genel etkinliğini belirler¹¹. Bu etkileşimi anlamak, daha etkili immünoterapi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Geleneksel akış sitometrisi ve immünohistokimya, immünolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmakla birlikte, kapsamlı, yüksek boyutlu analiz yapamamaları nedeniyle karmaşık bağışıklık manzaralarının analizi söz konusu olduğunda önemli sınırlamalar sergilemektedir. Akış sitometrisi, tek hücre düzeyinde yüzey ve fonksiyonel belirteçleri tespit etmek için oldukça etkilidir; Bununla birlikte, eşzamanlı çok işaretli analiz kapasitesi sınırlıdır, genellikle spektral örtüşme ve kullanılabilecek floresan etiketlerin sayısı üzerindeki pratik kısıtlamalarla sınırlıdır^13,14. Öte yandan immünohistokimya, belirli belirteçlerin doku bağlamına ilişkin değerli bilgiler sağlar, ancak benzer şekilde, sınırlı sayıda analiz edilebilir belirteç ve sağlam, nicel, yüksek boyutlu değerlendirmeler elde etmenin doğasında var olan zorluklar tarafından engellenir¹⁵.

Karmaşık bağışıklık ortamlarını etkili bir şekilde karakterize etmek için, kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) gibi yüksek boyutlu teknikler gereklidir. Kütle sitometrisi, tek hücrelerde birden fazla protein markörünü analiz etmek için kütle spektrometresi kullanan ileri bir teknolojidir. Geleneksel akış sitometrisinde¹⁶ görülen spektral örtüşme sorunları olmadan tek tek hücrelerin multiparametrik analizini sağlar. Metal etiketli antikorları kullanarak, düzinelerce belirteci aynı anda ölçebilir ve hücresel fenotiplerin ve işlevlerin kapsamlı ve tarafsız bir görünümünü sunar¹⁷. Örneğin, Gadalla ve ark. periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ve tümör dokusunun analizi için 40'tan fazla parametreye sahip bir CyTOF paneli geliştirdi ve yüksek boyutlu immünofenotip^18'deki avantajını gösterdi. Sınırlı sayıda saptanabilir parametresi olan geleneksel akış sitometrisi, benzersiz fenotipler sergileyen bu nadir hücre popülasyonlarını tanımlayamadı. Buna karşılık, kütle sitometrisi, bu hücrelerin fonksiyonel durumlarının kapsamlı bir değerlendirmesini mümkün kılarak daha ayrıntılı ve sağlam bir karakterizasyon sağladı. Behbehani ve ark. miyelodisplastik sendromlu (MDS) hastalardan alınan kemik iliği örneklerini analiz etmek için kitle sitometrisini kullandı ve nadir görülen anormal hematopoietik progenitör hücreleri başarılı bir şekilde tanımladı ve karakterize etti¹⁸. Kütle sitometrisinin 40'tan fazla yüzey ve hücre içi belirteci aynı anda tespit etme yeteneği, bu düşük frekanslı hücre alt kümelerinin tespitini önemli ölçüde artırdı¹⁹. Bu yetenekler, geleneksel sınırlamaların üstesinden gelir ve bağışıklık manzaraları hakkında daha derin bilgiler sağlayarak immünoloji ve terapötik geliştirmede ilerlemeyi sağlar. Hücresel fenotipleri ve fonksiyonları tek hücre düzeyinde kapsamlı bir şekilde profilleme yeteneği, immünolojik süreçlerin anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletir ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

Kütle sitometrisi, aynı anda birden fazla protein markörünü tespit ederek HCC'deki sistemik ve lokal immün hücre popülasyonları hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Bu teknoloji, efektör T hücreleri, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) ve tükenmiş T hücreleri gibi tümör mikroçevresi içindeki çeşitli T hücresi türleri arasında ayrım yapabilir ve tümör ilerlemesindeki spesifik rollerini açıklayabilir. Araştırmacılar, kütle sitometrisini kullanarak HCC prognozu²⁰ ile ilişkili bağışıklık belirteçlerini belirleyebilirler. Örneğin, yüksek Programlanmış Hücre Ölümü Proteini 1 (PD-1) ekspresyonuna sahip T hücresi alt kümeleri, bir hastanın bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerine²¹ verdiği yanıtın belirleyicileri olarak hizmet edebilir. Ek olarak, spesifik immünosupresif molekülleri tanımlayarak yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesini kolaylaştırır, böylece kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için bir temel sağlar. Teknolojinin birden fazla belirteci tespit etme yeteneği ve tek hücreli çözünürlüğü, onu yeni terapötik hedeflerin ortaya çıkarılması ve kombinasyon immünoterapilerinin tasarlanması için özellikle avantajlı kılmaktadır. Bu gelişmiş yaklaşım, bağışıklık ortamının ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayarak ve özel terapötik müdahalelerin geliştirilmesini sağlayarak HCC hastalarında tedavi sonuçlarını iyileştirmek için önemli bir potansiyele sahiptir.

Bu çalışmada HCC'li hastaların sistemik ve lokal immün hücre profillerini analiz etmek için kütle sitometrisinden yararlanılmalıdır. Amaç, immün hücre popülasyonlarını karakterize etmek, bu özellikleri klinik sonuçlar ve terapötik yanıtlarla ilişkilendirmek ve HCC prognozu ile ilişkili spesifik immün belirteçleri ve hücre alt kümelerini tanımlamaktır. Bu çalışma, çeşitli bağışıklık hücrelerinin tedavi yanıtlarındaki rollerini açıklayarak, kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için bir temel sağlamayı amaçlamaktadır. Bulguların mevcut immünoterapileri optimize etmesi ve yeni tedaviler geliştirmek için değerli bilgiler sunması ve sonuçta HCC hastaları için genel sağkalımı ve yaşam kalitesini iyileştirmeyi hedeflemesi bekleniyor.

Kan ve HCC örneği toplama, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) izolasyonu, tek hücre ayrışması ve boyama adımları aşağıdaki planda özetlenmiştir. Deneysel reaktifler ve malzemelerin tümü Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Birinci Bağlı Hastane Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi ve tümör örneklerinin toplanmasının patolojik tanıya müdahale etmediğinden emin olundu. Tüm insan deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. PBMC'lerin İzolasyonu

1. HCC hastalarının damarından bir kan örneği alın ve kanın pıhtılaşmasını önlemek için antikoagülan ile doldurulmuş bir tüp kullanın. Yaşları 50-60 arasında değişen, yaş ortalaması 55 olan 4 hastadan (2 erkek ve 2 kadın) kan örneği alındı. Her hasta için, hasta rahatsızlığını en aza indirirken sonraki PBMC izolasyonu için yeterli hacmi sağlamak için 10-20 mL periferik kan toplayın.
2. Belirli bir hacimde kan çekin (ör., 6 mL) ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne eşit hacimde periferik kan lenfosit ayırma sıvısı (Ficol-paque veya Lymphoprep) ekleyin.
   NOT: Uygun karıştırma için alan sağlamak ve taşmayı önlemek için toplam hacim ideal olarak 12 mL'yi geçmemelidir; 15 mL'lik bir santrifüj tüpü için önerilen maksimum hacim 14 mL'dir.
3. Santrifüj tüpünü 45 ° 'ye eğin ve kanı tüpün duvarı boyunca yavaşça ekleyin, iki katmanın karışmasını önlemek için kanı yavaşça periferik kan lenfosit ayırma sıvısının üzerine dikkatlice yerleştirin.
   NOT: Tüpün duvarı boyunca yavaşça kan eklemek için bir pipet kullanılabilir.
4. Santrifüj tüpünü santrifüje yerleştirin ve ivmeyi 8'e ve yavaşlamayı 3'e ayarlayın. 450 x g, 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, test tüpünde yukarıdan aşağıya doğru 4 katman oluşturulur: plazma katmanı, PBMC katmanı (beyaz zar katmanı), Ficol-Paque katmanı ve kırmızı kan hücresi ve granülosit katmanı.
5. Bir pipet kullanarak, PBMC katmanını dikkatlice yeni bir steril santrifüj tüpüne toplayın. PBS hacminin 3 katını ekleyin ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde bir pelet oluşur.
6. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın, hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL %2 Fetal Sığır Serum-Fosfat Tamponlu Salin (FBS-PBS) ekleyin ve ardından 3 mL Kırmızı Kan Hücresi (RBC) lizis tamponu ekleyin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'da santrifüjleyin.
7. Tüpün dibinde kırmızı kan hücrelerinin tamamen parçalandığını gösteren kırmızı kan hücresi olmadığından emin olun. Hücreleri %2 FBS-PBS'de yeniden süspanse edin ve doğrudan sonraki deneylere devam edin veya hücre kriyoprezervasyon solüsyonu ekleyin ve 2-3 ay boyunca -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Genel bir kural olarak, yeniden süspansiyon için 1 x 10⁶ hücre başına 0,5 mL %2 FBS-PBS kullanın. Hücre sayısı, canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için tripan mavisi boyamadan sonra bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanılarak belirlenir. Bu oran, sonraki prosedürler sırasında optimum hücre geri kazanımını ve canlılığını sağlamaya yardımcı olur.

2. Tümör dokusu hücrelerinin izolasyonu

NOT: Tümör doku hücrelerinin izolasyonu için yöntem Song ve ^ark.22'den uyarlanmıştır.

1. Bir patolog tarafından yönlendirilen HCC'yi rezeke ettikten sonra, tümör dokusunun bir kısmını çıkarmak için steril bir neşter kullanın. Doku bloğu yaklaşık 1^cm3 boyutunda olmalıdır. Önceden soğutulmuş 1x PBS ile yüzey lekelerini durulayın. Dokuyu %10 FBS içeren yaklaşık 5 mL RPMI 1640 ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne daldırın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve daha sonraki işlemler için laboratuvara geri taşıyın.
2. Kan lekelerini iyice durulayın ve önceden soğutulmuş %2 FBS-PBS ile tam doku temizliğini sağlamak için forseps kullanarak yağlı bağ dokusunu manuel olarak çıkarın. Dokuyu, bir sindirim çözeltisi içeren doku kültürü ile muamele edilmiş bir tabağa aktarın. Tümör dokusunu forseps ile sabitleyin ve bir neşter ile 1 mm'den³ daha küçük parçalar halinde kesin. Doku sindirim solüsyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacim yaklaşık 15 mL olana kadar daha fazla doku sindirim solüsyonu ekleyin.
3. Doku sindirim karışımını içeren santrifüj tüpünü bir çalkalayıcıya yerleştirin. Eğin veya düzleştirin ve 150 rpm'de ve 37 °C'de 1 saat boyunca sindirim için sabitleyin. Sindirim solüsyonunu 70 μm'lik bir filtreden süzün.
   1. Bu prosedür sırasında, doku parçalarını öğütmek için 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanın. Filtreyi% 2 FBS-1640 çözeltisi ile durulayın. Süzüntüyü alın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
4. Süzüntüyü 500 x g'da 4 ^°C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın. Peletleri yaklaşık 10 mL% 36 Percoll çözeltisinde dikkatli bir şekilde yeniden süspanse edin. Ardından, 500 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da tekrar santrifüjleyin.
5. Hücre süspansiyonunu yeniden süspanse etmek için 1 mL RBC lizis tamponunu bir pipetle nazikçe aspire edin. Süspansiyonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve toplam 10 mL'lik bir hacme ulaşmak için RBC lizis tamponunu ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
   NOT: Tüp duvarındaki herhangi bir yabancı maddenin hücre süspansiyonuna yeniden girmesini önlemek için yeni bir santrifüj tüpü kullanılır, böylece hücre veriminin düşme riskini azaltır.
6. Hücre süspansiyonunu 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, ardından hücreleri uygun bir %2 FBS-PBS hacminde yeniden süspanse edin. Genel bir kural olarak, yeniden süspansiyon için 1 x 10⁶ hücre başına 0,5 mL% 2 FBS-PBS kullanın.
   NOT: Hücre sayısı, canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için tripan mavisi boyamadan sonra bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanılarak belirlenir. Yeniden süspansiyon hacmi, sonraki deneyler için gerekli hücre miktarına bağlıdır. Bu oran, sonraki prosedürler sırasında optimum hücre geri kazanımını ve canlılığını sağlamaya yardımcı olur.

3. Sisplatin boyama

1. Adım 1.7'de elde edilen PBMC'lerden ve adım 2.6'da izole edilen tümör hücrelerinden sırasıyla 3 x 10⁶ hücre alın. Hücre geri kazanımından sonra, bunları Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} olmadan 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 0.5 μM'lik bir son konsantrasyona sisplatin ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
   NOT: Sisplatin boyama, zar bütünlüğüne dayalı olarak ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırt etmek için yapılır. Zarları bozulmuş ölü hücreler sisplatin alır ve pozitif bir sinyal gösterirken, canlı hücreler lekesiz kalır²³. Hücre sayısı en az 1 x 10⁶ olmalıdır.
2. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın, ardından reaksiyonu durdurmak için adım 3.1'de hazırlanan hücre süspansiyonlarını içeren her tüpe 1 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve santrifüjlemeden sonra hücre peletinin tüpün duvarı boyunca doğrusal olarak dağılmadığından emin olun.

4. Fc reseptörü blokajı

1. Her numune için önceden 50 μL'lik bir blok karışımı hazırlayın: 48 μL hücre boyama tamponunu birleştirin, ardından 2 μL Fc bloke etme solüsyonu ekleyin (hücre boyama tamponu: Fc bloke etme solüsyonu = 9: 1).
2. Yukarıdaki karışımda adım 3.2'den hücreleri askıya alın ve 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.

5. Membran protein antikorlarının inkübasyonu

1. Adım 4.2'den elde edilen her hücre örneği için, her bir antikorun 1.1 μL birimi ekleyerek membran protein antikor karışımını hazırlayın. Ardından, 55 μL'lik bir nihai hacme ulaşmak için hücre boyama tamponu ekleyin. Bu noktada, toplam hacim yaklaşık 100 μL'dir.
   NOT: Karışım, CD163, CCR3, CD141, CD117 ve CD45^24,25 gibi anahtar zar proteinlerini hedefleyen antikorları içerir. Bu antikorlar, membran protein belirteçlerini tanımlamadaki özgüllükleri için seçildi ve ticari olarak mevcut kaynaklardan elde edildi (klon numaraları, üreticiler ve katalog numaraları dahil olmak üzere ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Her tüp örneğine 50 μL hazırlanmış antikor karışımı ekleyin, toplam hacmi 100 μL'ye getirin. Örnekleri yavaşça döndürün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
3. Her numuneye 2 mL hücre boyama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
4. Süpernatanı atın ve hücreyi yeniden askıya almak ve iyice dağıtmak için kalan sıvıyı hücre peleti ile kısaca girdaplayın.

6. Çekirdek protein boyama

1. Hücreler tamamen yeniden süspanse edildikten sonra, adım 5.4'teki her numuneye 500 μL karışık çözelti (fiksasyon: fiksasyon/geçirgenleştirme = 3: 1) ekleyin. Numuneleri nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
2. Geçirgenleştirme tamponunu (10x) deiyonize su ile seyreltin. İnkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri yıkamak için her tüpe 1000 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın.
3. Antikorları 1x geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin. Süpernatanı atın ve her bir hücre tüpüne 50 μL antikor karışımı ekleyin. Hücreleri karıştırmak için nazikçe pipetleyin, ardından oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe edin.
4. Her tüpe 1000 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
5. Hücreleri tekrar askıya almak için her tüpe 1000 μL hücre boyama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

7. Hücre fiksasyonu

1. PBS'de %1.6'lık bir formaldehit çözeltisi hazırlayın ve numune başına 1 mL gereklidir.
2. Adım 6.5'teki her numuneye 1 mL %1.6 formaldehit çözeltisi ekleyin, iyice karıştırmak için girdap yapın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   NOT: Formaldehit, hücre fiksasyonu için yaygın olarak kullanılırken, %4 paraformaldehit (PFA) veya metanol gibi alternatif reaktifler de kullanılabilir. Fiksatif seçimi, deneyin özel gereksinimlerine ve gözlemlenecek hücresel özelliklere dayanmalıdır.
3. Oda sıcaklığında 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

8. Nükleer İnterkalasyon Boyama

1. Hücre interkalasyon çözeltisini hazırlayın: Hücre Kimliği İnterkalatörü-İridyumu (Ir) Fix ve geçirgenlik tamponu ile 125 nM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Numune başına 1 mL çözelti hazırlayın.
2. Adım 7.3'ten itibaren her bir sabit örneğe hazırlanan hücre interkalasyon çözeltisinden 1 mL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve hemen girdaplayın. Bu, hücre agregatlarının oluşumunu en aza indirmeye yardımcı olur.
3. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

9. Hücre süspansiyonunun hazırlanması

1. Adım 8.3'ten tüpe 1000 μL hücre boyama tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
2. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 450 μL ila 900 μL deiyonize su ekleyin. Tripan mavisi boyamadan sonra bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Saydıktan sonra, kütle sitometrisi kullanarak veri toplama ve analizine devam edin.

10. Kütle sitometrisi ve veri analizi

1. Bir CyTOF sistemi kullanarak kütle sitometrisi verilerini alın ve Akış Sitometrisi Standardı (FCS) dosyaları olarak kaydedin. Üreticinin talimatlarına göre arka plan gürültüsünü ve toplu iş etkilerini azaltmak için uygun cihaz kalibrasyonunu ve kalite kontrolünü sağlayın.
2. İlgili yazılımı kullanarak FCS dosyasındaki CD45⁺ hücre popülasyonunu önceden işleyin. Hücre boyutuna (ileri saçılma, FSC) ve ayrıntı düzeyine (yan saçılma, SSC) göre kalıntıları temizleyin. FSC-A/FSC-H veya SSC-A/SSC-H grafiklerinin sıralı geçitiyle çiftleri hariç tutun. Sisplatin dışlaması gibi canlılık boyamasını kullanarak ölü hücreleri ortadan kaldırın. Bağışıklık hücrelerine odaklanmak için CD45⁺ popülasyonunu kapatın ve daha fazla analiz için kapılı popülasyonu dışa aktarın.
3. Verileri 5 kofaktörü ile dönüştürün ve kümeleme yazılımını kullanarak ana kümeleri tanımlayın. Benzer işaretleyici ifade profillerine sahip hücreleri kümeler halinde gruplandıran Yoğunluk Normalleştirilmiş Olayların Yayılma Ağacı İlerleme Analizi (SPADE) algoritmasına dayalı kümeleme gerçekleştirin²⁶. Boyutsallığın azaltılması ve farklı kümelerin tanımlanması için Hiyerarşik Stokastik Komşu Gömme (HSNE) kullanın²⁶.
4. Denetimsiz kümeleme için R yazılımındaki cytofkit paketini kullanarak ana kümelerin yeniden kümelenmesini gerçekleştirin. Varsayılan parametreleri kullanarak PhenoGraph ile alt kümeleri tanımlayın.
5. Boyutsallığın azaltılması için Tekdüzen Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) uygulayın. 0.05'< bir P değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul ederek Wilcoxon testini kullanarak istatistiksel analiz yapın. ggplot2 kullanarak sonuçları görselleştirin.

HCC ile ilişkili immünolojik özellikleri aydınlatmak için, immün hücre popülasyonlarının kapsamlı bir analizi yapılmıştır. HCC'li 4 hastadan eşleştirilmiş PBMC'ler ve HCC doku örnekleri toplandı. Hem PBMC'ler hem de HCC doku örnekleri için iki antikor paneli kullanılarak, tek hücreli proteomik düzeyde bağışıklık hücresi popülasyonlarını incelemek için kütle sitometrisi profillemesi yapıldı.

Kalite kontrolünden sonra 45.326 hücre kütle sitometri analizine dahil edildi. PhenoGraph kümeleme algoritması, t-SNE ile birlikte, iki boyutlu grafikler oluşturmak ve hücreleri farklı fenotiplere bölmek için kullanıldı. Majör immün hücre alt kümeleri, CD3 (T hücreleri), CD4 (CD4⁺ T hücreleri), CD8 (CD8⁺ T hücreleri), CD56 (NK hücreleri), CD19 (B hücreleri) ve CD14 (monositler) gibi soy belirteçlerine dayalı olarak ^{tanımlanmıştır27,28}. İmmün hücre kümeleri, kütle sitometri teknolojileri kullanılarak karakterize edildi.

PBMC örneklerinde, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, CD4 T hücreleri, CD8 T hücreleri, NK hücreleri, B hücreleri, monositler, merkezi bellek CD8 T hücreleri (CD8Tcm), makrofajlar, plazmasitoid dendritik hücreler (pDC'ler), bazofiller, eozinofiller, efektör CD8 T hücreleri (CD8Teff), CD141⁺ konvansiyonel dendritik hücreler (CD141⁺ cDC'ler), nötrofiller ve CD1c⁺ konvansiyonel dendritik hücreler (CD1c⁺ cDC'ler). Her hücre tipi için ayrıntılı işaretleyici ifade modeli Şekil 1B'de gösterilmiştir. Ayrıca, Şekil 1C , bu hücre tiplerinin her bir numune içindeki dağılımını göstermektedir. PBMC örneklerinde, her hücre tipinin farklı oranları tanımlanmıştır. Özellikle, numune D, diğer numunelere kıyasla daha yüksek bir CD4 T hücresi oranı gösterdi. Örnekler A ve B, B hücrelerinde önemli bir zenginleşme gösterdi. Ek olarak, CD141⁺ konvansiyonel dendritik hücreler (CD141⁺ cDC'ler) ağırlıklı olarak numune C'de bulundu. Bu bulgular, farklı örneklerdeki spesifik hücre tiplerinin benzersiz dağılımını ve bolluğunu vurgulayarak, HCC'deki bağışıklık ortamının heterojenliği hakkında fikir vermektedir.

Benzer şekilde, doku örneklerinde, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, monositler, T hücreleri, nötrofiller, NK hücreleri, B hücreleri, pDC'ler, eozinofiller ve miyeloid dendritik hücreler (mDC'ler) dahil olmak üzere 8 hücre tipi tanımlanmıştır. Her hücre tipi için işaretleyici ifade modeli Şekil 2B'de verilmiştir ve Şekil 2C , bu hücre tiplerinin numuneler içindeki dağılımını görsel olarak temsil eder. Doku örnekleri, tüm hastalarda tutarlı bir hücre tipi oranı modeli gösterdi. Bu, HCC'deki bu hücre tiplerinin nispi bolluğu açısından ortak bir immünolojik özelliği düşündürmektedir. Bu tutarlı paterni anlamak, altta yatan bağışıklık manzarası ve bunun HCC patogenezi üzerindeki potansiyel etkileri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Bu analiz yoluyla oluşturulan bağışıklık hücresi atlası, HCC'nin bağışıklık manzarası hakkında değerli bilgiler sunarak hastalıkla ilişkili hücresel ve sistemik adaptasyonlara ışık tutar.

Şekil 1: PBMC ekosisteminin çoklu omik profili. (A) PBMC örneklerinden tanımlanan ve bir t-SNE grafiğinde gösterilen 14 hücre kümesi. (B) (A)'da gösterilen hücre kümeleri için protein belirteçleri. (C) Kütle sitometrisi verilerine dayalı olarak alt kümelerin 4 numune boyunca dağılım modeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HCC doku ekosisteminin multi-omik profili. (A) HCC doku örneklerinden tanımlanan ve bir t-SNE grafiğinde gösterilen 8 hücre kümesi. (B) (A)'da gösterilen hücre kümeleri için protein belirteçleri. (C) Kütle sitometrisi verilerine dayalı olarak alt kümelerin 4 numune boyunca dağılım modeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, HCC'de hem sistemik hem de lokal immün yanıtların derinlemesine bir analizini sağlamak için kütle sitometrisi teknolojisinden yararlanmaktadır. Bu bağlamda kütle sitometrisinin uygulanması, tek hücre düzeyinde birden fazla markörün aynı anda saptanmasını sağlayarak, HCC'nin karmaşık bağışıklık manzarasını anlamak için çok önemli olan ayrıntılı bir immünofenotipik karakterizasyon sunar. Kitle sitometrisi, yüksek boyutlu tek hücreli analizi kolaylaştırarak immünolojik çalışmalarda devrim yaratmıştır. Bu teknik, antikorlara konjuge edilmiş nadir metal izotop etiketlerini kullanır ve tek bir çalışmada 40'tan fazla parametrenin aynı anda ölçülmesine izin verir. Bu yetenek, tümör mikroçevresinin (TME) yüksek derecede hücresel heterojenlik ve karmaşık bağışıklık etkileşimleri ile karakterize edildiği HCC'nin incelenmesinde özellikle avantajlıdır^18,29.

Kütle sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre önemli bir avantajı, gelişmiş çoğullama yeteneğidir. Konvansiyonel akış sitometrisi, floresan belirteçler kullanılırken spektral örtüşmelerle sınırlıyken, kütle sitometrisi, bu sorundan muzdarip olmayan metal izotopları kullanır. Bu, karmaşık kompanzasyon algoritmalarına³⁰ ihtiyaç duymadan daha fazla sayıda işaretleyicinin aynı anda algılanmasını sağlar. Bu yetenek, çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarının ve durumlarının profilini çıkarmanın tümör-bağışıklık etkileşimlerini anlamak için kritik olduğu HCC araştırmalarında çok önemlidir. Kütle sitometrisi, tek hücre çözünürlüğünde yüksek boyutlu veriler sağlayarak TME³¹ içindeki bağışıklık hücrelerinin kapsamlı bir analizine olanak tanır. Bu ayrıntı düzeyi, nadir hücre popülasyonlarını tanımlamak ve bunların tümör ilerlemesi ve bağışıklık kaçışındaki rollerini anlamak için çok önemlidir. Örneğin, kütle sitometrisi, T hücrelerinin, makrofajların ve diğer bağışıklık hücrelerinin alt kümeleri arasında ayrım yapabilir ve bunların işlevsel durumları ve tümör¹⁸ içindeki etkileşimleri hakkında bilgi sağlar.

Protokoldeki bir dizi kritik adım, elde edilen verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlar. Ayırma sıvısı üzerine kan katmanlaması sırasında, katmanların bütünlüğünü korumak ve PBMC'lerin³² başarılı bir şekilde izole edilmesi için çok önemli olan karışmayı önlemek için dikkatli ve yavaş ekleme şarttır. Benzer şekilde, tümör dokularının enzimatik sindirimi, ayrışma ve hücre canlılığını dengelemek için dikkatli bir zamanlama gerektirir³³. Bu aşamalar sırasında uygun kullanım, aşağı akış boyama ve kütle sitometrisi analizi için gerekli olan PBMC'lerin ve tümör hücrelerinin yüksek geri kazanımını ve saflığını sağlar. Ayrıca, sisplatin boyama işlemi, canlı hücreleri ölü hücrelerden doğru bir şekilde ayırt etmede çok önemli bir rol oynar; Yanlış zamanlama veya konsantrasyon, yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlara yol açarak veri kalitesini etkileyebilir³⁴. Ek olarak, Fc reseptör blokajı, spesifik olmayan antikor bağlanmasını en aza indirerek hücre yüzey belirteçlerinin hassas bir şekilde tanımlanmasını sağlarken, doğru kütle sitometrisi sonuçları için kritik olan hücresel bütünlüğü ve hücre içi antijenleri korumak için fiksasyon ve geçirgenlik aşamaları dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir³⁵.

Kütle sitometrisinin yüksek boyutlu analiz yetenekleri, onu HCC'de biyobelirteç keşfi için paha biçilmez bir araç haline getirir. Araştırmacılar, bağışıklık ortamını tek hücre düzeyinde profilleyerek, hastalığın ilerlemesi, terapötik yanıt ve genel prognoz ile ilişkili potansiyel biyobelirteçleri belirleyebilirler³⁶. Bu çalışmada PBMC ve doku örneklerinde gözlemlenen farklı bağışıklık hücresi dağılımları, hasta tabakalaşması için kritik bilgiler sağlar. Örneğin, daha yüksek efektör CD8 T hücresi seviyelerine sahip hastalar, sitotoksik T hücresi aktivitesini artıran tedavilere daha iyi yanıt verebilirken, Tregs gibi yüksek seviyelerde immünosupresif hücrelere sahip olanlar, bağışıklık ortamını etkili bir şekilde modüle etmek için kombinasyon tedavilerinden yararlanabilir. Bu tabakalı yaklaşım, HCC için daha kişiselleştirilmiş ve etkili tedavi stratejilerine yol açabilir.

Kütle sitometrisi, immünoterapi için potansiyel hedeflerin belirlenmesine katkıda bulunarak, TME içindeki bağışıklık hücresi popülasyonları ve fonksiyonel durumları hakkında ayrıntılı bilgiler sağlar³⁷. Bu biyobelirteçler doğrulanabilir ve hedefe yönelik tedaviler ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için kullanılabilir³⁰. Treg'ler ve miyeloid türevli baskılayıcı hücreler (MDSC'ler) gibi immünosüpresif hücre popülasyonlarının tanımlanması, anti-tümör bağışıklığını geliştirmek için bu hücreleri modüle etmeyi amaçlayan tedavilerin geliştirilmesini bilgilendirebilir³⁸. Kütle sitometrisi, TME³⁹ içindeki karmaşık etkileşimleri anlamak için gerekli olan kapsamlı immün profillemeyi mümkün kılar. Bu, bağışıklık hücrelerinin mekansal dağılımını, fenotipik ve fonksiyonel durumlarını ve tümör hücreleri ile etkileşimlerini karakterize etmeyi içerir⁴⁰. Bu tür ayrıntılı profilleme, immün kaçınma ve direnç mekanizmaları hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir ve çoklu yolları hedef alan kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesine rehberlik edebilir.

Kütle sitometri teknolojisi, HCC'de sistemik ve lokal immün yanıtların analizinde önemli avantajlar sunmaktadır. Gelişmiş çoğullama yetenekleri, yüksek boyutluluğu ve tek hücreli çözünürlüğü, HCC^41'in bağışıklık manzarası hakkında ayrıntılı bilgiler sağlar. Araştırmacılar, bu ayrıntılı immünofenotipik verilerden yararlanarak, HCC'deki immün kaçırma mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayış kazanabilir ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için daha etkili immünoterapötik stratejiler geliştirebilirler.

Kütle sitometri teknolojisinin avantajlarına ve HCC'nin immün manzarasının profilini çıkarmadaki uygulamasına rağmen, aynı zamanda sınırlamaları da vardır. Çok aşamalı izolasyon ve boyama işlemi, özellikle kırılgan bağışıklık hücresi popülasyonları için hücre kaybına yol açabilir. Fiksasyon, epitop tanımayı değiştirebilir ve potansiyel olarak işaretleyici algılama doğruluğunu etkileyebilir. Ayrıca, kütle sitometrisi veri analizi, artefaktlara neden olabilecek toplu etkilere karşı hassastır. Son olarak, önemli sayıda canlı hücreye duyulan ihtiyaç, protokolün küçük tümör örneklerine uygulanabilirliğini sınırlar⁴². Bu sınırlamaları ele almak ve metodolojinin sağlamlığını artırmak için gelecekteki optimizasyonlara ihtiyaç vardır. Gelecekteki çalışmalarda kütle sitometrisi verilerinin diğer yüksek boyutlu tekniklerle entegre edilmesi, HCC'deki immün yanıtların anlaşılmasını daha da ilerletecek ve yenilikçi tedavilerin geliştirilmesine rehberlik edecektir.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (JS'ye 2019YFA0803000 hibe), Zhejiang Scientific Mükemmel Gençlik Vakfı (JS'ye R22H1610037 hibe), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (JS'ye hibe 82173078), Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (JS'ye 2022C03037 hibe).