Análise por citometria de massa das respostas imunes sistêmicas e locais no carcinoma hepatocelular

Este protocolo descreve um método abrangente de análise de citometria de massa (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para avaliar as respostas imunes sistêmicas e locais no carcinoma hepatocelular (CHC). A abordagem visa fornecer informações sobre a paisagem imunológica do CHC, oferecendo uma compreensão mais profunda do microambiente tumoral e dos mecanismos imunológicos associados.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma das formas mais comuns e mortais de câncer de fígado em todo o mundo. Apesar dos avanços no tratamento, o prognóstico para pacientes com CHC permanece ruim devido à complexa interação de fatores genéticos, ambientais e imunológicos que impulsionam sua progressão. Compreender o cenário imunológico do CHC é crucial para o desenvolvimento de terapias eficazes, particularmente no campo da imunoterapia, que traz grandes promessas para melhorar os resultados dos pacientes. Este estudo emprega a tecnologia de citometria de massa (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para investigar as respostas imunes sistêmicas e locais em pacientes com CHC. Ao analisar amostras de sangue periférico e tumores, a pesquisa visa identificar populações únicas de células imunes e seus estados funcionais associados à progressão do CHC. Os resultados fornecem uma visão abrangente do cenário imunológico no CHC, destacando potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos. Essa abordagem oferece informações valiosas sobre os mecanismos imunológicos subjacentes ao CHC e abre caminho para o desenvolvimento de imunoterapias mais eficazes para essa malignidade.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é o câncer primário de fígado mais comum e um importante problema de saúde global devido às suas altas taxas de incidência e mortalidade¹. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o CHC é o quinto câncer mais comum e a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo². É particularmente prevalente em regiões com altas taxas de infecções crônicas por hepatite B e C, como o Leste Asiático e a África Subsaariana³. Os principais fatores de risco incluem hepatite viral, cirrose e síndrome metabólica⁴. O CHC requer tratamento de longo prazo, impondo encargos físicos e financeiros substanciais, ressaltando a necessidade de prevenção eficaz, detecção precoce e estratégias de tratamento inovadoras⁵.

O sistema imunológico desempenha um papel crucial no desenvolvimento do CHC. O fígado é um órgão imunologicamente ativo com abundância de células imunes, incluindo macrófagos residentes no fígado, células natural killer (NK) e células T, que são essenciais para monitorar e eliminar células anormais⁶. No entanto, o CHC pode escapar da vigilância imunológica expressando moléculas imunossupressoras, recrutando células imunossupressoras e alterando o microambiente tumoral ^7,8. Esse escape imunológico não apenas promove o crescimento do tumor e a metástase, mas também afeta a resposta à imunoterapia ^9,10.

As respostas imunes sistêmicas e locais no microambiente tumoral são fatores-chave que influenciam a progressão do câncer e os resultados terapêuticos. As respostas imunes sistêmicas envolvem células imunes circulantes que podem reconhecer e atacar células tumorais distantes, como células T periféricas, células NK e monócitos que podem atingir células tumorais em todo o corpo. As respostas imunes locais se concentram na atividade das células imunes dentro do microambiente tumoral, incluindo linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), macrófagos associados ao tumor (TAMs) e células T reguladoras (Tregs). Embora os TILs frequentemente exerçam efeitos citotóxicos contra células tumorais, TAMs e Tregs normalmente contribuem para um ambiente imunossupressor que suporta o crescimento do tumor^11,12. As células tumorais e as células estromais podem remodelar o microambiente tumoral para promover a imunossupressão e evitar a vigilância imunológica. A interação entre as respostas imunes sistêmica e local determina a eficácia geral da imunidade antitumoral¹¹. Compreender essa interação pode ajudar no desenvolvimento de estratégias de imunoterapia mais eficazes.

A citometria de fluxo tradicional e a imuno-histoquímica, embora amplamente utilizadas em estudos imunológicos, exibem limitações significativas quando se trata de analisar paisagens imunológicas complexas devido à sua incapacidade de realizar análises abrangentes e de alta dimensão. A citometria de fluxo é altamente eficaz para detectar marcadores de superfície e funcionais no nível de célula única; no entanto, sua capacidade de análise simultânea de múltiplos marcadores é restrita, muitas vezes limitada por sobreposição espectral e restrições práticas sobre o número de etiquetas fluorescentes que podem ser usadas^13,14. A imuno-histoquímica, por outro lado, fornece informações valiosas sobre o contexto tecidual de marcadores específicos, mas é igualmente prejudicada pelo número limitado de marcadores analisáveis e pelas dificuldades inerentes de obter avaliações robustas, quantitativas e de alta dimensão¹⁵.

Para caracterizar efetivamente ambientes imunológicos complexos, técnicas de alta dimensão como citometria de massa (citometria por tempo de voo [CyTOF]) são essenciais. A citometria de massa é uma tecnologia avançada que emprega espectrometria de massa para analisar vários marcadores de proteínas em células únicas. Ele permite a análise multiparamétrica de células individuais sem os problemas de sobreposição espectral observados na citometria de fluxo tradicional¹⁶. Ao usar anticorpos marcados com metal, ele pode medir dezenas de marcadores simultaneamente, oferecendo uma visão abrangente e imparcial dos fenótipos e funções celulares¹⁷. Por exemplo, Gadalla et al. desenvolveram um painel CyTOF com mais de 40 parâmetros para a análise de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e tecido tumoral, demonstrando sua vantagem na imunofenotipagem de alta dimensão¹⁸. A citometria de fluxo tradicional, com seu número limitado de parâmetros detectáveis, foi incapaz de identificar essas populações de células raras exibindo fenótipos únicos. Em contraste, a citometria de massa permitiu uma avaliação abrangente dos estados funcionais dessas células, fornecendo uma caracterização mais detalhada e robusta. Behbehani e col. utilizaram citometria de massa para analisar amostras de medula óssea de pacientes com síndromes mielodisplásicas (SMD), identificando e caracterizando com sucesso células progenitoras hematopoiéticas aberrantes^{raras 18}. A capacidade da citometria de massa de detectar simultaneamente mais de 40 marcadores de superfície e intracelulares aumentou significativamente a detecção desses subconjuntos de células de baixa frequência¹⁹. Esses recursos superam as limitações tradicionais e fornecem insights mais profundos sobre as paisagens imunológicas, impulsionando o progresso na imunologia e no desenvolvimento terapêutico. A capacidade de traçar um perfil abrangente dos fenótipos e funções celulares no nível de uma única célula avança muito na compreensão dos processos imunológicos e auxilia no desenvolvimento de terapias direcionadas.

A citometria de massa fornece informações abrangentes sobre as populações de células imunes sistêmicas e locais no CHC, detectando simultaneamente vários marcadores de proteínas. Essa tecnologia pode distinguir entre vários tipos de células T dentro do microambiente tumoral, como células T efetoras, células T reguladoras (Tregs) e células T exaustas, elucidando seus papéis específicos na progressão do tumor. Ao utilizar a citometria de massa, os pesquisadores podem identificar marcadores imunológicos associados ao prognóstico do CHC²⁰. Por exemplo, subconjuntos de células T com alta expressão da Proteína de Morte Celular Programada 1 (PD-1) podem servir como preditores da resposta de um paciente aos inibidores do checkpoint imunológico²¹. Além disso, facilita a descoberta de novos alvos terapêuticos, identificando moléculas imunossupressoras específicas, fornecendo assim uma base para estratégias de tratamento personalizadas. A capacidade da tecnologia de detectar vários marcadores e sua resolução de célula única a tornam particularmente vantajosa para descobrir novos alvos terapêuticos e projetar imunoterapias combinadas. Essa abordagem avançada tem um potencial significativo para melhorar os resultados do tratamento em pacientes com CHC, oferecendo uma compreensão detalhada do cenário imunológico e permitindo o desenvolvimento de intervenções terapêuticas personalizadas.

Este estudo tem como objetivo utilizar a citometria de massa para analisar o perfil de células imunes sistêmicas e locais de pacientes com CHC. Os objetivos são caracterizar as populações de células imunes, correlacionar essas características com resultados clínicos e respostas terapêuticas e identificar marcadores imunológicos específicos e subconjuntos de células associados ao prognóstico do CHC. Ao elucidar os papéis de várias células imunes nas respostas ao tratamento, este estudo busca fornecer uma base para estratégias de tratamento personalizadas. Espera-se que as descobertas otimizem as imunoterapias existentes e ofereçam informações valiosas para o desenvolvimento de novos tratamentos, com o objetivo de melhorar a sobrevida geral e a qualidade de vida dos pacientes com CHC.

As etapas para coleta de amostras de sangue e CHC, isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), dissociação de célula única e coloração são descritas no plano a seguir. Os reagentes e materiais experimentais estão todos listados na Tabela de Materiais. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado, Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang, garantindo que a coleta de amostras tumorais não interferisse no diagnóstico patológico. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos humanos.

1. Isolamento de PBMCs

1. Retire uma amostra de sangue da veia de pacientes com CHC e use um tubo cheio de um anticoagulante para evitar a coagulação do sangue. Amostras de sangue foram obtidas de 4 pacientes (2 homens e 2 mulheres) com idades entre 50 e 60 anos, com idade média de 55 anos. Para cada paciente, colete 10-20 mL de sangue periférico para garantir volume suficiente para o isolamento subsequente de PBMCs, minimizando o desconforto do paciente.
2. Retire um volume específico de sangue (por exemplo, 6 mL) e adicione um volume igual de líquido de separação de linfócitos do sangue periférico (Ficol-paque ou Lymphoprep) a um tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: O volume total não deve exceder 12 mL para permitir espaço para uma mistura adequada e evitar transbordamento; o volume máximo recomendado para um tubo de centrífuga de 15 mL é de 14 mL.
3. Incline o tubo da centrífuga a 45° e adicione lentamente o sangue ao longo da parede do tubo, colocando cuidadosamente o sangue lentamente em cima do líquido de separação de linfócitos do sangue periférico para evitar misturar as duas camadas.
   NOTA: Uma pipeta pode ser usada para adicionar sangue lentamente ao longo da parede do tubo.
4. Coloque o tubo da centrífuga na centrífuga e ajuste a aceleração em 8 e a desaceleração em 3. Centrifugar a 450 x g, 4 °C, durante 30 min. Após a centrifugação, 4 camadas são formadas no tubo de ensaio, de cima para baixo: camada de plasma, camada de PBMCs (camada de membrana branca), camada Ficol-Paque e camada de glóbulos vermelhos e granulócitos.
5. Usando uma pipeta, colete cuidadosamente a camada de PBMCs em um novo tubo de centrífuga estéril. Adicione 3 vezes o volume de PBS e centrifugue a 500 x g a 4 ° C por 5 min. Após a centrifugação, um pellet é formado no fundo do tubo.
6. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta, adicione 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de soro bovino fetal a 2% (FBS-PBS) para ressuspender as células e, em seguida, adicione 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Centrifugue a 500 x g a 4°C por 5 min.
7. Certifique-se de que não haja glóbulos vermelhos no fundo do tubo, indicando que os glóbulos vermelhos foram completamente lisados. Ressuspenda as células em 2% de FBS-PBS e prossiga diretamente com os experimentos subsequentes, ou adicione a solução de criopreservação celular e armazene a -80 ° C por 2-3 meses.
   NOTA: Como diretriz geral, para ressuspensão, use 0,5 mL de 2% de FBS-PBS por 1 x 10⁶ células. A contagem de células é determinada usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado após a coloração com azul de tripano para distinguir células vivas de células mortas. Essa proporção ajuda a garantir a recuperação e a viabilidade celular ideais durante os procedimentos subsequentes.

2. Isolamento de células de tecido tumoral

NOTA: O método para o isolamento de células de tecido tumoral foi adaptado de Song et ^al.22.

1. Após ressecar o CHC, guiado por um patologista, use um bisturi estéril para extirpar uma parte do tecido tumoral. O bloco de tecido deve ter aproximadamente 1 cm³ de tamanho. Enxágue todas as manchas superficiais com PBS 1x pré-resfriado. Mergulhe o tecido em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo cerca de 5 mL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Coloque o tubo no gelo e transporte-o de volta ao laboratório para processamento posterior.
2. Enxágue bem as manchas de sangue e remova manualmente o tecido conjuntivo gorduroso usando uma pinça para garantir a limpeza completa do tecido com FBS-PBS 2% pré-resfriado. Transfira o tecido para um prato tratado com cultura de tecidos contendo uma solução de digestão. Prenda o tecido tumoral com uma pinça e corte-o em pedaços menores que 1 mm³ com um bisturi. Transfira a solução de digestão tecidual para um tubo centrífugo de 50 mL, adicionando mais solução de digestão tecidual até que o volume total seja de aproximadamente 15 mL.
3. Coloque o tubo de centrifugação contendo a mistura de digestão de tecidos em um agitador. Incline-o ou alise-o e fixe-o para digestão a 150 rpm e 37 °C por 1 h. Filtrar a solução de digestão através de um filtro de 70 μm.
   1. Durante este procedimento, use um êmbolo de seringa de 1 mL para triturar os fragmentos de tecido. Enxágue o filtro com uma solução FBS-1640 a 2%. Pegue o filtrado e transfira-o para um tubo de centrífuga de 15 mL.
4. Centrifugar o filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 ^°C. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet em aproximadamente 10 mL de solução de Percoll a 36%. Em seguida, centrifugue-o novamente a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspire suavemente 1 mL de tampão de lise de hemácias com uma pipeta para ressuspender a suspensão celular. Transfira a suspensão para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e adicione o tampão de lise de hemácias para atingir um volume total de 10 mL. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10 min.
   NOTA: Um novo tubo de centrífuga é usado para evitar que quaisquer impurezas na parede do tubo entrem novamente na suspensão celular, reduzindo assim o risco de diminuição do rendimento celular.
6. Centrifugue a suspensão celular a 500 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, ressuspenda as células em um volume apropriado de 2% de FBS-PBS. Como diretriz geral, use 0,5 mL de FBS-PBS a 2% por 1 x 10⁶ células para ressuspensão.
   NOTA: A contagem de células é determinada usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado após a coloração com azul de tripano para distinguir células vivas de células mortas. O volume de ressuspensão depende da quantidade de células necessária para experimentos subsequentes. Essa proporção ajuda a garantir a recuperação e a viabilidade celular ideais durante os procedimentos subsequentes.

3. Coloração de cisplatina

1. Pegue 3 x 10⁶ células das PBMCs obtidas na etapa 1.7 e das células tumorais isoladas na etapa 2.6, respectivamente. Após a recuperação celular, ressuspendê-los em 1 mL de PBS sem Ca²⁺ e Mg²⁺. Adicione cisplatina a uma concentração final de 0,5 μM, misture bem e incube em temperatura ambiente por 2 min.
   NOTA: A coloração com cisplatina é realizada para distinguir células mortas de células vivas com base na integridade da membrana. As células mortas com membranas comprometidas captarão cisplatina e mostrarão um sinal positivo, enquanto as células vivas permanecerão sem coloração²³. O número de células deve ser de pelo menos 1 x 10⁶.
2. Centrifugue os tubos a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de coloração celular a cada tubo contendo as suspensões celulares preparadas na etapa 3.1 para interromper a reação. Centrifugue a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e certifique-se de que o pellet celular não seja distribuído linearmente ao longo da parede do tubo após a centrifugação.

4. Bloqueio do receptor Fc

1. Prepare uma mistura de blocos de 50 μL com antecedência para cada amostra: Combine 48 μL de tampão de coloração celular e, em seguida, adicione 2 μL de solução de bloqueio Fc (tampão de coloração celular: solução de bloqueio Fc = 9: 1).
2. Suspenda as células da etapa 3.2 na mistura acima e deixe-as descansar em temperatura ambiente por 10 min.

5. Incubação de anticorpos proteicos de membrana

1. Para cada amostra de célula obtida na etapa 4.2, prepare a mistura de anticorpos de proteína de membrana adicionando unidades de 1,1 μL de cada anticorpo. Em seguida, adicione tampão de coloração celular para atingir um volume final de 55 μL. Neste ponto, o volume total é de aproximadamente 100 μL.
   NOTA: A mistura inclui anticorpos direcionados às principais proteínas de membrana, como CD163, CCR3, CD141, CD117 e CD45^24,25. Esses anticorpos foram selecionados por sua especificidade na identificação de marcadores de proteínas de membrana e foram obtidos de fontes comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes, incluindo números de clones, fabricantes e números de catálogo).
2. Adicione 50 μL de mistura de anticorpos preparada a cada amostra de tubo, traga o volume total para 100 μL. Agite suavemente as amostras e incube-as em temperatura ambiente por 15 min.
3. Adicione 2 mL de tampão de coloração celular a cada amostra, centrifugue a 500 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa 2x.
4. Descarte o sobrenadante e subtraia brevemente o líquido restante com o pellet celular para ressuspender e dispersar completamente a célula.

6. Coloração de proteínas do núcleo

1. Uma vez que as células tenham sido totalmente ressuspensas, adicione 500 μL da solução misturada (fixação: fixação/permeabilização = 3:1) a cada amostra da etapa 5.4. Misture delicadamente as amostras e incube em temperatura ambiente por 30 min.
2. Diluir o tampão de permeabilização (10x) com água desionizada. Após a incubação, centrifugue a 500 g durante 5 min à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante. Adicione 1000 μL de tampão de permeabilização 1x a cada tubo para lavar as células. Centrifugue à temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min e, em seguida, descarte o sobrenadante.
3. Ressuspenda os anticorpos em tampão de permeabilização 1x. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 50 μL da mistura de anticorpos a cada tubo de células. Pipete suavemente as células para misturar e incube em temperatura ambiente por 30-45 min.
4. Adicione 1000 μL de tampão de permeabilização 1x a cada tubo, centrifugue à temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
5. Adicione 1000 μL de tampão de coloração celular a cada tubo para ressuspender as células novamente, centrifugue em temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.

7. Fixação celular

1. Prepare uma solução de formaldeído a 1,6% em PBS, com 1 mL necessário por amostra.
2. Adicione 1 mL de solução de formaldeído a 1,6% a cada amostra da etapa 6.5, vortex para misturar bem e incube em temperatura ambiente por 10 min.
   NOTA: Embora o formaldeído seja comumente usado para fixação celular, reagentes alternativos, como paraformaldeído a 4% (PFA) ou metanol, também podem ser usados. A escolha do fixador deve basear-se nas necessidades específicas da experiência e nas características celulares a observar.
3. Centrifugue à temperatura ambiente a 800 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.

8. Coloração de intercalação nuclear

1. Preparar a solução de intercalação celular: Diluir o Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) com Fix e tampão de permeabilização até uma concentração final de 125 nM. Prepare 1 ml da solução por amostra.
2. Adicionar 1 ml da solução de intercalação celular preparada a cada amostra fixa do passo 7.3. Misture delicadamente e vortex imediatamente. Isso ajuda a minimizar a formação de agregados celulares.
3. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4°C durante a noite. Centrifugue a 500 g por 5 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.

9. Preparação da suspensão celular

1. Adicione 1000 μL de tampão de coloração celular ao tubo da etapa 8.3 e centrifugue a 800 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Repita esta etapa 2x.
2. Adicione 450 μL a 900 μL de água deionizada para ressuspender as células. Conte as células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado após a coloração com azul de tripano. Após a contagem, prossiga com a coleta e análise de dados usando citometria de massa.

10. Citometria de massa e análise de dados

1. Adquira dados de citometria de massa usando um sistema CyTOF e salve-os como arquivos Flow Cytometry Standard (FCS). Garanta a calibração adequada do instrumento e o controle de qualidade para reduzir o ruído de fundo e os efeitos do lote de acordo com as instruções do fabricante.
2. Pré-processe a população de células CD45⁺ no arquivo FCS usando o software associado. Remova os detritos com base no tamanho da célula (dispersão direta, FSC) e granularidade (dispersão lateral, SSC). Exclua duplicatas por gating sequencial de gráficos FSC-A/FSC-H ou SSC-A/SSC-H. Elimine as células mortas usando coloração de viabilidade, como a exclusão da cisplatina. Gate a população CD45 ⁺ para se concentrar em células imunológicas e exportar a população fechada para análise posterior.
3. Transforme os dados com um cofator de 5 e identifique os principais clusters usando o software de clustering. Execute o agrupamento com base no algoritmo Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events (SPADE), que agrupa células com perfis de expressão de marcadores semelhantes em clusters²⁶. Use a incorporação hierárquica de vizinhos estocásticos (HSNE) para redução de dimensionalidade e identificação de clusters distintos²⁶.
4. Execute o reagrupamento dos principais clusters usando o pacote cytofkit no software R para clustering não supervisionado. Identifique subclusters com o PhenoGraph usando parâmetros padrão.
5. Aplique Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) para redução da dimensionalidade. Realizar análise estatística por meio do teste de Wilcoxon, considerando um valor de P < 0,05 como estatisticamente significativo. Visualize os resultados usando ggplot2.

Para elucidar as características imunológicas associadas ao CHC, foi realizada uma análise abrangente das populações de células imunes. PBMCs pareados e amostras de tecido de CHC foram coletadas de 4 pacientes com CHC. O perfil de citometria de massa foi realizado para examinar as populações de células imunes no nível proteômico de célula única, usando dois painéis de anticorpos para amostras de tecido PBMCs e HCC.

Após o controle de qualidade, 45.326 células foram incluídas na análise de citometria de massa. O algoritmo de agrupamento PhenoGraph, em conjunto com o t-SNE, foi empregado para gerar gráficos bidimensionais e particionar as células em fenótipos distintos. Os principais subconjuntos de células imunes foram identificados com base em marcadores de linhagem, como CD3 (células T), CD4 (células T CD4⁺), CD8 (células T CD8⁺), CD56 (células NK), CD19 (células B) e CD14 (monócitos)^27,28. Os aglomerados de células imunes foram caracterizados usando tecnologias de citometria de massa.

Nas amostras de PBMC, conforme mostrado na Figura 1A, um total de 14 tipos de células foram identificados, incluindo células T CD4, células T CD8, células NK, células B, monócitos, células T CD8 de memória central (CD8Tcm), macrófagos, células dendríticas plasmocitoides (pDCs), basófilos, eosinófilos, células T CD8 efetoras (CD8Teff), células dendríticas convencionais CD141⁺ (CD141⁺ cDCs), neutrófilos e células dendríticas convencionais CD1c⁺ (CD1c⁺ cDCs). O padrão de expressão de marcador detalhado para cada tipo de célula é representado na Figura 1B. Além disso, a Figura 1C ilustra a distribuição desses tipos de células dentro de cada amostra. Nas amostras de PBMC, proporções distintas de cada tipo de célula foram identificadas. Notavelmente, a amostra D mostrou uma proporção maior de células T CD4 em comparação com as outras amostras. As amostras A e B mostraram um enriquecimento significativo de células B. Além disso, as células dendríticas convencionais CD141⁺ (CD141⁺ cDCs) foram predominantemente encontradas na amostra C. Essas descobertas destacam a distribuição única e a abundância de tipos específicos de células em diferentes amostras, fornecendo informações sobre a heterogeneidade da paisagem imunológica no CHC.

Da mesma forma, em amostras de tecido, conforme mostrado na Figura 2A, 8 tipos de células foram identificados, incluindo monócitos, células T, neutrófilos, células NK, células B, pDCs, eosinófilos e células dendríticas mieloides (mDCs). O padrão de expressão do marcador para cada tipo de célula é fornecido na Figura 2B e a Figura 2C representa visualmente a distribuição desses tipos de células nas amostras. As amostras de tecido mostraram um padrão consistente de proporção de tipo de célula em todos os pacientes. Isso sugere uma característica imunológica compartilhada em termos da abundância relativa desses tipos de células no CHC. Compreender esse padrão consistente fornece informações valiosas sobre o cenário imunológico subjacente e suas possíveis implicações para a patogênese do CHC.

O atlas de células imunes construído por meio dessa análise oferece informações valiosas sobre o cenário imunológico do CHC, lançando luz sobre as adaptações celulares e sistêmicas associadas à doença.

Figura 1: Perfil multi-ômico do ecossistema PBMCs. (A) Os 14 aglomerados de células identificados a partir de amostras de PBMCs e ilustrados em um gráfico t-SNE. (B) Marcadores de proteína para os aglomerados de células mostrados em (A). (C) Padrão de distribuição dos subconjuntos em 4 amostras com base em dados de citometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Perfil multi-ômico do ecossistema de tecido HCC. (A) Os 8 aglomerados de células identificados a partir de amostras de tecido HCC e ilustrados em um gráfico t-SNE. (B) Marcadores de proteína para os aglomerados de células mostrados em (A). (C) Padrão de distribuição dos subconjuntos em 4 amostras com base em dados de citometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este estudo aproveita a tecnologia de citometria de massa para fornecer uma análise aprofundada das respostas imunes sistêmicas e locais no CHC. A aplicação da citometria de massa neste contexto permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores em nível de célula única, oferecendo uma caracterização imunofenotípica detalhada que é crucial para a compreensão do complexo cenário imunológico do CHC. A citometria de massa revolucionou os estudos imunológicos, facilitando a análise de célula única de alta dimensão. Esta técnica emprega marcas raras de isótopos metálicos conjugados a anticorpos, permitindo a medição simultânea de mais de 40 parâmetros em uma única execução. A capacidade é particularmente vantajosa no estudo do CHC, onde o microambiente tumoral (TME) é caracterizado por um alto grau de heterogeneidade celular e intrincadas interações imunes^18,29.

Uma vantagem significativa da citometria de massa sobre a citometria de fluxo tradicional é sua capacidade aprimorada de multiplexação. Enquanto a citometria de fluxo convencional é limitada por sobreposições espectrais ao usar marcadores fluorescentes, a citometria de massa emprega isótopos metálicos, que não sofrem com esse problema. Isso permite a detecção simultânea de um número maior de marcadores sem a necessidade de algoritmos complexos de compensação³⁰. Essa capacidade é essencial na pesquisa do CHC, onde o perfil de várias populações de células imunes e seus estados é fundamental para entender as interações tumor-imunes. A citometria de massa fornece dados de alta dimensão com resolução de célula única, permitindo uma análise abrangente das células imunes dentro do TME³¹. Esse nível de detalhe é crucial para identificar populações de células raras e entender seus papéis na progressão do tumor e na evasão imunológica. Por exemplo, a citometria de massa pode diferenciar entre subconjuntos de células T, macrófagos e outras células imunes, fornecendo informações sobre seus estados funcionais e interações dentro do tumor¹⁸.

Uma sequência de etapas críticas no protocolo garante a confiabilidade e reprodutibilidade dos dados obtidos. Durante a estratificação do sangue sobre o líquido de separação, a adição cuidadosa e lenta é essencial para manter a integridade das camadas e evitar a mistura, o que é crucial para o isolamento bem-sucedido das PBMCs³². Da mesma forma, a digestão enzimática dos tecidos tumorais requer um tempo cuidadoso para equilibrar a dissociação e a viabilidade celular³³. O manuseio adequado durante esses estágios garante alta recuperação e pureza de PBMCs e células tumorais, o que é essencial para a coloração a jusante e análise de citometria de massa. Além disso, o processo de coloração da cisplatina desempenha um papel fundamental na distinção precisa das células vivas das mortas; O tempo ou concentração inadequados podem levar a resultados falso-positivos ou falso-negativos, impactando a qualidade dos dados³⁴. Além disso, o bloqueio do receptor Fc minimiza a ligação inespecífica de anticorpos, garantindo a identificação precisa dos marcadores de superfície celular, enquanto as etapas de fixação e permeabilização devem ser cuidadosamente controladas para preservar a integridade celular e os antígenos intracelulares críticos para resultados precisos de citometria de massa³⁵.

Os recursos de análise de alta dimensão da citometria de massa a tornam uma ferramenta inestimável para a descoberta de biomarcadores em CHC. Ao traçar o perfil do cenário imunológico em um nível de célula única, os pesquisadores podem identificar potenciais biomarcadores associados à progressão da doença, resposta terapêutica e prognóstico geral³⁶. As distintas distribuições de células imunes observadas em PBMC e amostras de tecido neste estudo fornecem informações críticas para a estratificação do paciente. Por exemplo, pacientes com níveis mais altos de células T CD8 efetoras podem responder melhor a terapias que aumentam a atividade das células T citotóxicas, enquanto aqueles com níveis elevados de células imunossupressoras, como Tregs, podem se beneficiar de terapias combinadas para modular efetivamente o ambiente imunológico. Essa abordagem estratificada pode levar a estratégias de tratamento mais personalizadas e eficazes para o CHC.

A citometria de massa fornece informações detalhadas sobre as populações de células imunes e seus estados funcionais dentro do TME, contribuindo para a identificação de alvos potenciais para imunoterapia³⁷. Esses biomarcadores podem ser validados e usados para desenvolver terapias direcionadas e estratégias de tratamento personalizadas³⁰. A identificação de populações de células imunossupressoras, como Tregs e células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs), pode informar o desenvolvimento de terapias destinadas a modular essas células para aumentar a imunidade antitumoral³⁸. A citometria de massa permite um perfil imunológico abrangente, o que é essencial para a compreensão das complexas interações dentro do TME³⁹. Isso inclui caracterizar a distribuição espacial das células imunes, seus estados fenotípicos e funcionais e suas interações com as células tumorais⁴⁰. Esse perfil detalhado pode revelar novos insights sobre os mecanismos de evasão e resistência imunológica, orientando o desenvolvimento de terapias combinadas que visam várias vias.

A tecnologia de citometria de massa oferece vantagens significativas na análise das respostas imunes sistêmicas e locais no CHC. Seus recursos aprimorados de multiplexação, alta dimensionalidade e resolução de célula única fornecem informações detalhadas sobre o cenário imunológico do HCC⁴¹. Ao aproveitar esses dados imunofenotípicos detalhados, os pesquisadores podem obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos de evasão imunológica no CHC e desenvolver estratégias imunoterapêuticas mais eficazes para melhorar os resultados dos pacientes.

Apesar das vantagens da tecnologia de citometria de massa e sua aplicação no perfil do cenário imunológico do CHC, ela também apresenta limitações. O processo de isolamento e coloração em várias etapas pode levar à perda de células, principalmente para populações de células imunológicas frágeis. A fixação pode alterar o reconhecimento de epítopos, afetando potencialmente a precisão da detecção de marcadores. Além disso, a análise de dados de citometria de massa é sensível a efeitos de lote, o que pode introduzir artefatos. Finalmente, a necessidade de um número substancial de células viáveis limita a aplicabilidade do protocolo a pequenas amostras tumorais⁴². Otimizações futuras são necessárias para lidar com essas limitações e aumentar a robustez da metodologia. A integração de dados de citometria de massa com outras técnicas de alta dimensão em estudos futuros avançará ainda mais na compreensão das respostas imunes no CHC e orientará o desenvolvimento de terapias inovadoras.

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (concessão 2019YFA0803000 para JS), a Excellent Youth Foundation da Zhejiang Scientific (concessão R22H1610037 para JS), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão 82173078 para JS), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (concessão 2022C03037 para JS).