肝细胞癌全身和局部免疫反应的质谱流式细胞术分析

该方案概述了一种全面的质谱细胞术（通过飞行时间 [CyTOF] 进行细胞术）分析方法，用于评估肝细胞癌 （HCC） 中的全身和局部免疫反应。该方法旨在深入了解 HCC 的免疫景观，从而更深入地了解肿瘤微环境和相关的免疫机制。

肝细胞癌 （HCC） 是全球最常见和最致命的肝癌形式之一。尽管治疗取得了进展，但由于遗传、环境和免疫因素的复杂相互作用推动了其进展，HCC 患者的预后仍然很差。了解 HCC 的免疫景观对于开发有效的疗法至关重要，尤其是在免疫疗法领域，免疫疗法对改善患者预后有很大的希望。本研究采用质谱流式细胞术 （通过飞行时间 [CyTOF] 进行流式细胞术）技术来研究 HCC 患者的全身和局部免疫反应。通过分析外周血和肿瘤样本，该研究旨在确定独特的免疫细胞群及其与 HCC 进展相关的功能状态。研究结果全面概述了 HCC 的免疫景观，突出了潜在的生物标志物和治疗靶点。这种方法为了解 HCC 背后的免疫机制提供了有价值的见解，并为开发针对这种恶性肿瘤的更有效免疫疗法铺平了道路。

肝细胞癌 （HCC） 是最常见的原发性肝癌，由于其高发病率和死亡率，因此是一个重要的全球健康问题¹。根据世界卫生组织的数据，肝细胞癌是全球第五大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因²。它在慢性乙型和丙型肝炎感染率高的地区尤其普遍，例如东亚和撒哈拉以南非洲³。主要危险因素包括病毒性肝炎、肝硬化和代谢综合征⁴。肝细胞癌需要长期治疗，给患者带来巨大的身体和经济负担，凸显了有效预防、早期发现和创新治疗策略的必要性⁵。

免疫系统在 HCC 的发展中起着至关重要的作用。肝脏是一个免疫活性器官，具有丰富的免疫细胞，包括肝脏驻留巨噬细胞、自然杀伤 （NK） 细胞和 T 细胞，这些细胞对于监测和消除异常细胞至关重要⁶。然而，HCC 可以通过表达免疫抑制分子、募集免疫抑制细胞和改变肿瘤微环境来逃避免疫监视 ^7,8。这种免疫逃逸不仅促进肿瘤生长和转移，还影响对免疫疗法的反应 ^9,10。

肿瘤微环境中的全身和局部免疫反应是影响癌症进展和治疗结果的关键因素。全身免疫反应涉及循环免疫细胞，这些细胞可以识别和攻击远处的肿瘤细胞，例如外周 T 细胞、NK 细胞和单核细胞，它们可以靶向全身的肿瘤细胞。局部免疫反应侧重于肿瘤微环境中的免疫细胞活性，包括肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL）、肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 和调节性 T 细胞 （Treg）。虽然 TIL 通常对肿瘤细胞产生细胞毒作用，但 TAM 和 Treg 通常有助于支持肿瘤生长的免疫抑制环境^11,12。肿瘤细胞和基质细胞可以重塑肿瘤微环境，促进免疫抑制并逃避免疫监视。全身免疫和局部免疫反应之间的相互作用决定了抗肿瘤免疫的整体有效性¹¹。了解这种相互作用有助于制定更有效的免疫治疗策略。

传统的流式细胞术和免疫组织化学虽然广泛用于免疫学研究，但由于无法进行全面的高维分析，因此在分析复杂的免疫景观时表现出明显的局限性。流式细胞术对于检测单细胞水平的表面和功能标志物非常有效;然而，其同时进行多标记物分析的能力受到限制，通常受到光谱重叠和可使用的荧光标记数量的实际限制^13,14 的限制。另一方面，免疫组织化学为特定标志物的组织环境提供了有价值的见解，但它同样受到可分析标志物数量有限以及实现稳健、定量、高维评估的固有困难的阻碍¹⁵。

为了有效地表征复杂的免疫环境，质谱流式细胞术（飞行时间流式细胞术 [CyTOF]）等高维技术是必不可少的。质谱流式细胞术是一种先进的技术，它采用质谱法来分析单个细胞中的多种蛋白质标志物。它能够对单个细胞进行多参数分析，而不会出现传统流式细胞术¹⁶ 中出现的光谱重叠问题。通过使用金属标记的抗体，它可以同时测量数十种标记物，从而提供细胞表型和功能的全面、公正的视图¹⁷。例如，Gadalla 等人开发了一个具有 40 多个参数的 CyTOF panel，用于分析外周血单核细胞 （PBMC） 和肿瘤组织，展示了其在高维免疫表型分析方面的优势¹⁸。传统的流式细胞术可检测参数数量有限，无法识别这些表现出独特表型的稀有细胞群。相比之下，质谱流式细胞术能够全面评估这些细胞的功能状态，从而提供更详细和稳健的表征。Behbehani 等人利用质谱流式细胞术分析骨髓增生异常综合征 （MDS） 患者的骨髓样本，成功鉴定和表征罕见的异常造血祖细胞¹⁸。质谱流式细胞术同时检测 40 多种表面和细胞内标志物的能力显著增强了对这些低频细胞亚群的检测¹⁹。这些功能克服了传统限制，提供了对免疫景观的更深入见解，推动了免疫学和治疗开发的进步。在单细胞水平上全面分析细胞表型和功能的能力极大地促进了对免疫过程的理解，并有助于靶向治疗的开发。

质谱流式细胞术通过同时检测多种蛋白质标志物，全面了解 HCC 中的全身和局部免疫细胞群。该技术可以区分肿瘤微环境中各种类型的 T 细胞，例如效应 T 细胞、调节性 T 细胞 （Treg） 和耗竭 T 细胞，阐明它们在肿瘤进展中的特定作用。通过利用质谱流式细胞术，研究人员可以识别与 HCC 预后相关的免疫标志物²⁰。例如，程序性细胞死亡蛋白 1 （PD-1） 表达高的 T 细胞亚群可以作为患者对免疫检查点抑制剂反应的预测因子²¹。此外，它通过识别特定的免疫抑制分子来促进发现新的治疗靶点，从而为个性化治疗策略奠定基础。该技术检测多种标志物的能力及其单细胞分辨率使其特别有利于发现新的治疗靶点和设计联合免疫疗法。这种先进的方法通过提供对免疫景观的详细理解并支持开发量身定制的治疗干预措施，在改善 HCC 患者的治疗结果方面具有巨大潜力。

本研究旨在利用质谱流式细胞术分析 HCC 患者的全身和局部免疫细胞谱。目标是表征免疫细胞群，将这些特征与临床结果和治疗反应相关联，并确定与 HCC 预后相关的特异性免疫标志物和细胞亚群。通过阐明各种免疫细胞在治疗反应中的作用，本研究旨在为个性化治疗策略提供基础。这些发现有望优化现有的免疫疗法，并为开发新的治疗方法提供有价值的见解，最终旨在提高 HCC 患者的整体生存率和生活质量。

以下计划概述了血液和 HCC 样本采集、外周血单核细胞 （PBMC） 分离、单细胞解离和染色的步骤。实验试剂和材料均列在材料表中。所有实验均经浙江大学医学院第一附属医院伦理委员会批准进行，确保肿瘤标本采集不影响病理诊断。获得所有人类受试者的书面知情同意书。

1. PBMC 的分离

1. 从 HCC 患者的静脉中抽取血样，并使用装满抗凝剂的管子来防止血液凝结。血液样本来自 4 例年龄为 50-60 岁的患者 （2 例男性和 2 例女性），平均年龄为 55 岁。对于每位患者，采集 10-20 mL 外周血，以确保有足够的体积用于后续的 PBMC 分离，同时最大限度地减少患者的不适。
2. 抽取特定体积的血液（例如 6 mL），并向 15 mL 离心管中加入等体积的外周血淋巴细胞分离液（Ficol-paque 或 Lymphoprep）。
   注：理想情况下，总体积不应超过 12 mL，以便为适当混合留出空间并防止溢出;15 mL 离心管的最大推荐体积为 14 mL。
3. 将离心管倾斜 45°，沿管壁缓慢加入血液，小心地将血液缓慢放在外周血淋巴细胞分离液的顶部，避免两层混合。
   注意：可以使用移液管沿管壁缓慢添加血液。
4. 将离心管放入离心机中，将加速度设置为 8，将减速设置为 3。在 450 x g ，4 °C 下离心 30 分钟。离心后，在试管中从上到下形成 4 层：血浆层、PBMC 层（白膜层）、Ficol-Paque 层以及红细胞和粒细胞层。
5. 使用移液器，小心地将 PBMC 层收集到新的无菌离心管中。加入 3 倍体积的 PBS，并在 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟。离心后，在管底部形成沉淀。
6. 使用移液管弃去上清液，加入 1 mL 2% 胎牛血清-磷酸盐缓冲盐水 （FBS-PBS） 重悬细胞，然后加入 3 mL 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液。在 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟。
7. 确保管底没有红细胞，表明红细胞已被完全裂解。将细胞重悬于 2% FBS-PBS 中并直接进行后续实验，或添加细胞冻存溶液并在 -80°C 下储存 2-3 个月。
   注：作为一般准则，对于重悬，每 1 x 10⁶ 个细胞使用 0.5 mL 2% FBS-PBS。台盼蓝染色后，使用血细胞计数器或自动细胞计数器测定细胞计数，以区分活细胞和死细胞。该比率有助于确保在后续程序中实现最佳细胞回收率和活力。

2. 分离肿瘤组织细胞

注意：分离肿瘤组织细胞的方法改编自 Song 等人²²。

1. 切除 HCC 后，在病理学家的指导下，使用无菌手术刀切除一部分肿瘤组织。组织块的大小应约为 1 cm³ 。用预冷的 1x PBS 冲洗掉任何表面污渍。将组织浸入含有约 5 mL 含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基的 15 mL 离心管中。将试管放在冰上，然后将其运回实验室进行进一步处理。
2. 彻底冲洗掉血渍，并使用镊子手动去除脂肪结缔组织，以确保使用预冷的 2% FBS-PBS 彻底清洁组织。将组织转移到含有消化液的组织培养皿中。用镊子固定肿瘤组织，并用手术刀将其切成小于 1 mm³ 的块。将组织消化液转移至 50 mL 离心管中，加入更多组织消化液，直至总体积约为 15 mL。
3. 将含有组织消化混合物的离心管放入摇床中。倾斜或压平它并固定它以在 150 rpm 和 37 °C 下消化 1 小时。通过 70 μm 过滤器过滤消化液。
   1. 在此过程中，使用 1 mL 注射器柱塞研磨组织碎片。用 2% FBS-1640 溶液冲洗过滤器。取滤液并将其转移到 15 mL 离心管中。
4. 将滤液在 4 ^°C 下以 500 x g 离心 5 分钟。离心后，弃去上清液。小心地将沉淀重悬于约 10 mL 的 36% Percoll 溶液中。然后，在 4 °C 下再次以 500 x g 离心 5 分钟。
5. 用移液管轻轻吸出 1 mL RBC 裂解缓冲液，以重悬细胞悬液。将悬浮液转移至新的 15 mL 离心管中，并加入 RBC 裂解缓冲液，使总体积达到 10 mL。让混合物在室温下静置 10 分钟。
   注：使用新的离心管来防止管壁上的任何杂质重新进入细胞悬液，从而降低细胞产量降低的风险。
6. 将细胞悬液在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于适当体积的 2% FBS-PBS 中。作为一般准则，每 1 x 10⁶ 个细胞使用 0.5 mL 2% FBS-PBS 进行重悬。
   注：在台盼蓝染色后，通过使用血细胞计数器或自动细胞计数器来确定细胞计数，以区分活细胞和死细胞。重悬体积取决于后续实验所需的细胞数量。该比率有助于确保在后续程序中实现最佳细胞回收率和活力。

3. 顺铂染色

1. 分别从步骤 1.7 中获得的 PBMC 和步骤 2.6 中分离的肿瘤细胞中取出 3 x 10⁶ 个细胞。细胞回收后，将它们重悬于 1 mL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 中。加入终浓度为 0.5 μM 的顺铂，充分混合，并在室温下孵育 2 分钟。
   注：进行顺铂染色是为了根据膜完整性区分死细胞和活细胞。胎膜受损的死细胞会吸收顺铂并显示阳性信号，而活细胞仍未染色²³。单元格数必须至少为 1 x 10⁶。
2. 在室温下以 500 x g 离心试管 5 分钟，弃去上清液，然后向含有步骤 3.1 中制备的细胞悬液的每个试管中加入 1 mL 细胞染色缓冲液以终止反应。在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并确保离心后细胞沉淀不会沿管壁线性分布。

4. Fc 受体阻断

1. 为每个样品提前准备 50 μL 封闭液：混合 48 μL 细胞染色缓冲液，然后加入 2 μL Fc 封闭液（细胞染色缓冲液：Fc 封闭液=9：1）。
2. 将步骤 3.2 中的细胞悬浮在上述混合物中，让它们在室温下静置 10 分钟。

5. 膜蛋白抗体的孵育

1. 对于从步骤 4.2 中获得的每个细胞样品，通过添加 1.1 μL 单位的每种抗体来制备膜蛋白抗体混合物。然后，添加细胞染色缓冲液以达到 55 μL 的最终体积。此时，总体积约为 100 μL。
   注：该混合物包括靶向关键膜蛋白的抗体，如 CD163、CCR3、CD141、CD117 和 CD45^24,25。选择这些抗体是因为它们在鉴定膜蛋白标志物方面的特异性，并且是从市售来源获得的（有关详细信息，请参见材料表，包括克隆号、制造商和目录号）。
2. 向每个试管样品中加入 50 μL 制备好的抗体混合物，使总体积达到 100 μL。轻轻旋转样品并在室温下孵育 15 分钟。
3. 向每个样品中加入 2 mL 细胞染色缓冲液，在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。重复此步骤 2 次。
4. 弃去上清液，用细胞沉淀短暂涡旋剩余液体，以重悬并彻底分散细胞。

6. 细胞核蛋白染色

1. 细胞完全重悬后，向步骤 5.4 中的每个样品中加入 500 μL 混合溶液（固定：固定/透化 = 3：1）。轻轻混合样品并在室温下孵育 30 分钟。
2. 用去离子水稀释透化缓冲液 （10x）。孵育后，在室温下以 500 g 离心 5 分钟，弃去上清液。向每个试管中加入 1000 μL 的 1x 透化缓冲液以洗涤细胞。在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
3. 将抗体重悬于 1x 透化缓冲液中。弃去上清液，向每管细胞中加入 50 μL 抗体混合物。轻轻移液细胞混合，然后在室温下孵育 30-45 分钟。
4. 向每个试管中加入 1000 μL 1x 透化缓冲液，在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
5. 向每个试管中加入 1000 μL 细胞染色缓冲液以再次重悬细胞，在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。

7. 细胞固定

1. 在 PBS 中制备 1.6% 甲醛溶液，每个样品需要 1 mL。
2. 向步骤 6.5 中的每个样品中加入 1 mL 1.6% 甲醛溶液，涡旋充分混合，并在室温下孵育 10 分钟。
   注：虽然甲醛通常用于细胞固定，但也可以使用 4% 多聚甲醛 （PFA） 或甲醇等替代试剂。固定剂的选择应基于实验的具体要求和要观察的细胞特征。
3. 在室温下以 800 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。

8. 核插层染色

1. 制备细胞插层溶液：用固定和透化缓冲液稀释 Cell-ID 嵌入剂-铱 （Ir） 至终浓度为 125 nM。每个样品准备 1 mL 溶液。
2. 向步骤 7.3 中的每个固定样品中加入 1 mL 制备的细胞插层溶液。轻轻混合并立即涡旋。这有助于最大限度地减少细胞聚集体的形成。
3. 在室温下孵育 1 小时或在 4°C 下孵育过夜。在室温下以 500 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

9. 细胞悬液的制备

1. 从步骤 8.3 中向试管中加入 1000 μL 细胞染色缓冲液，并以 800 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液。重复此步骤 2 次。
2. 添加 450 μL 至 900 μL 去离子水以重悬细胞。台盼蓝染色后，使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数。计数后，使用质谱流式细胞术进行数据收集和分析。

10. 质谱流式细胞术和数据分析

1. 使用 CyTOF 系统采集质谱流式细胞术数据，并将其保存为流式细胞术标准 （FCS） 文件。确保按照制造商的说明进行适当的仪器校准和质量控制，以减少背景噪音和批次效应。
2. 使用相关软件对 FCS 文件中的 CD45 ⁺ 细胞群进行预处理。根据细胞大小（前向散射，FSC）和粒度（侧向散射，SSC）去除碎片。通过 FSC-A/FSC-H 或 SSC-A/SSC-H 图的顺序选通来排除双峰。使用活力染色去除死细胞，例如顺铂排除。对 CD45 ⁺ 群体进行门控，以专注于免疫细胞，并导出门控群体进行进一步分析。
3. 使用协因子 5 转换数据，并使用聚类软件识别主集群。根据密度归一化事件的生成树进程分析 （SPADE） 算法执行聚类，该算法将具有相似标记表达谱的细胞分组到聚类²⁶ 中。使用分层随机邻域嵌入 （HSNE） 进行降维和识别不同的集群²⁶.
4. 使用 R 软件中的 cytofkit 包执行主要簇的重新聚类，以实现无监督聚类。使用默认参数通过 PhenoGraph 识别子集群。
5. 应用 Uniform Manifold Approximation and Projection （UMAP） 进行降维。使用 Wilcoxon 检验执行统计分析，将 P 值< 0.05 视为统计显著性。使用 ggplot2 可视化结果。

为了阐明与 HCC 相关的免疫学特征，对免疫细胞群进行了综合分析。从 4 例 HCC 患者中收集配对的 PBMC 和 HCC 组织样本。对 PBMC 和 HCC 组织样本使用两个抗体组合，进行质谱流式细胞分析以在单细胞蛋白质组学水平检查免疫细胞群。

质量控制后，将 45,326 个细胞纳入质谱流式细胞术分析。PhenoGraph 聚类算法与 t-SNE 相结合，用于生成二维图形并将细胞划分为不同的表型。根据谱系标志物确定主要免疫细胞亚群，例如 CD3（T 细胞）、CD4（CD4⁺ T 细胞）、CD8（CD8⁺ T 细胞）、CD56（NK 细胞）、CD19（B 细胞）和 CD14（单核细胞）^27,28。使用质谱流式细胞术技术对免疫细胞簇进行表征。

在 PBMC 样品中，如图 1A 所示，共鉴定出 14 种细胞类型，包括 CD4 T 细胞、CD8 T 细胞、NK 细胞、B 细胞、单核细胞、中枢记忆 CD8 T 细胞 （CD8Tcm）、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞 （pDC）、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、效应 CD8 T 细胞 （CD8Teff）、CD141⁺ 常规树突状细胞 （CD141⁺ cDC）、中性粒细胞和 CD1c⁺ 常规树突状细胞 （CD1c⁺ cDC）。 图 1B 描述了每种细胞类型的详细标记表达模式。此外， 图 1C 说明了这些细胞类型在每个样品中的分布。在 PBMC 样品中，鉴定出每种细胞类型的不同比例。值得注意的是，与其他样品相比，样品 D 显示 CD4 T 细胞的比例更高。样品 A 和 B 显示 B 细胞的显著富集。此外，CD141 ⁺ 常规树突状细胞 （CD141 ⁺ cDC） 主要存在于样品 C 中。这些发现突出了不同样本中特定细胞类型的独特分布和丰度，为了解 HCC 免疫景观的异质性提供了见解。

同样，在组织样本中，如图 2A 所示，鉴定了 8 种细胞类型，包括单核细胞、T 细胞、中性粒细胞、NK 细胞、B 细胞、pDC、嗜酸性粒细胞和髓样树突状细胞 （mDC）。 图 2B 提供了每种细胞类型的标记表达模式， 图 2C 直观地表示这些细胞类型在样品中的分布。组织样本显示所有患者的细胞类型比例模式一致。这表明 HCC 中这些细胞类型的相对丰度具有共同的免疫学特征。了解这种一致的模式为了解潜在的免疫景观及其对 HCC 发病机制的潜在影响提供了有价值的见解。

通过该分析构建的免疫细胞图谱为了解 HCC 的免疫景观提供了有价值的见解，阐明了与该疾病相关的细胞和全身适应。

图 1：PBMC 生态系统的多组学分析。 （A） 从 PBMC 样品中鉴定出的 14 个细胞簇，并在 t-SNE 图上图示。（B） （A） 中所示的细胞簇的蛋白质标志物。（C） 基于质谱流式细胞术数据的 4 个样品中亚群的分布模式。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：HCC 组织生态系统的多组学分析。 （A） 从 HCC 组织样本中鉴定出的 8 个细胞簇，并在 t-SNE 图上说明。（B） （A） 中所示的细胞簇的蛋白质标志物。（C） 基于质谱流式细胞术数据的 4 个样品中亚群的分布模式。 请单击此处查看此图的较大版本。

本研究利用质谱流式细胞术技术对 HCC 中的全身和局部免疫反应进行了深入分析。在这种情况下，质谱流式细胞术的应用能够在单细胞水平上同时检测多个标志物，从而提供详细的免疫表型表征，这对于理解 HCC 的复杂免疫景观至关重要。质谱流式细胞术通过促进高维单细胞分析，彻底改变了免疫学研究。该技术采用与抗体偶联的稀有金属同位素标签，可在一次运行中同时测量 40 多个参数。这种能力在研究 HCC 时特别有利，其中肿瘤微环境 （TME） 的特点是高度的细胞异质性和复杂的免疫相互作用^18,29。

与传统流式细胞术相比，质谱流式细胞术的一个显著优势是其增强的多重检测能力。虽然传统流式细胞术在使用荧光标记物时受到光谱重叠的限制，但质谱流式细胞术使用金属同位素，而金属同位素则不会受到这个问题的影响。这使得能够同时检测更多的标记物，而无需复杂的补偿算法³⁰.这种能力在 HCC 研究中至关重要，其中分析各种免疫细胞群及其状态对于了解肿瘤-免疫相互作用至关重要。质谱流式细胞术以单细胞分辨率提供高维数据，可对 TME³¹ 中的免疫细胞进行全面分析。这种详细程度对于鉴定稀有细胞群和了解它们在肿瘤进展和免疫逃逸中的作用至关重要。例如，质谱流式细胞术可以区分 T 细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞的亚群，从而深入了解它们在肿瘤内的功能状态和相互作用¹⁸。

协议中的一系列关键步骤确保了所获数据的可靠性和可重复性。在分离液上形成血液分层过程中，小心和缓慢的添加对于保持层的完整性和避免混合至关重要，这对于成功分离 PBMC³² 至关重要。同样，肿瘤组织的酶消化需要仔细的时间安排，以平衡解离和细胞活力³³。在这些阶段的正确处理可确保 PBMC 和肿瘤细胞的高回收率和纯度，这对于下游染色和质谱流式细胞术分析至关重要。此外，顺铂染色过程在准确区分活细胞和死细胞方面起着关键作用;时间或浓度不当会导致假阳性或假阴性结果，从而影响数据质量³⁴。此外，Fc 受体阻断可最大限度地减少非特异性抗体结合，确保精确识别细胞表面标志物，同时必须仔细控制固定和透化步骤，以保持细胞完整性和细胞内抗原，这对准确的质量流式细胞术结果至关重要³⁵。

质谱流式细胞术的高维分析能力使其成为 HCC 中生物标志物发现的宝贵工具。通过在单细胞水平上分析免疫景观，研究人员可以识别与疾病进展、治疗反应和总体预后相关的潜在生物标志物³⁶。在本研究中，在 PBMC 和组织样本中观察到的不同免疫细胞分布为患者分层提供了关键信息。例如，效应 CD8 T 细胞水平较高的患者可能对增强细胞毒性 T 细胞活性的疗法反应更好，而免疫抑制细胞（如 Tregs）水平升高的患者可能受益于联合疗法以有效调节免疫环境。这种分层方法可能会导致 HCC 的更个性化和有效的治疗策略。

质谱流式细胞术提供了对 TME 内免疫细胞群及其功能状态的详细见解，有助于确定免疫疗法的潜在靶点³⁷。这些生物标志物可以被验证并用于开发靶向治疗和个性化治疗策略³⁰。免疫抑制细胞群的鉴定，如 Treg 和髓源性抑制细胞 （MDSC），可以为旨在调节这些细胞以增强抗肿瘤免疫力的疗法的开发提供信息³⁸。质谱流式细胞术可实现全面的免疫分析，这对于了解 TME³⁹ 内部的复杂相互作用至关重要。这包括表征免疫细胞的空间分布、它们的表型和功能状态，以及它们与肿瘤细胞的相互作用⁴⁰。这种详细的分析可以揭示对免疫逃避和耐药机制的新见解，指导针对多种途径的联合疗法的开发。

质谱流式细胞术技术在分析 HCC 的全身和局部免疫反应方面具有显著优势。其增强的多重检测能力、高维数和单细胞分辨率提供了对 HCC⁴¹ 免疫景观的详细见解。通过利用这些详细的免疫表型数据，研究人员可以更深入地了解 HCC 中免疫逃避的机制，并开发更有效的免疫治疗策略来改善患者的预后。

尽管质谱流式细胞术技术具有优势及其在分析 HCC 免疫景观方面的应用，但它也有局限性。多步骤分离和染色过程会导致细胞损失，特别是对于脆弱的免疫细胞群。固定可能会改变表位识别，从而可能影响标记物检测的准确性。此外，质谱流式细胞术数据分析对批次效应很敏感，这可能会引入伪影。最后，对大量活细胞的需求限制了该方案对小肿瘤样本的适用性⁴²。未来需要进行优化来解决这些限制并提高方法的稳健性。在未来的研究中，将质谱流式细胞术数据与其他高维技术相结合，将进一步促进对 HCC 免疫反应的理解，并指导创新疗法的开发。

作者声明他们没有利益冲突。

这项工作得到了中国国家重点研发计划（授予 JS 2019YFA0803000）、浙江省科学优秀青年基金（授予 JS R22H1610037）、中国国家自然科学基金（授予 JS）的支持（授予 JS 82173078）、浙江省自然科学基金（授予 JS 2022C03037）。