Massenzytometrische Analyse systemischer und lokaler Immunantworten beim hepatozellulären Karzinom

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Analysemethode der Massenzytometrie (Cytometry by Time-of-Flight [CyTOF]) zur Bewertung sowohl systemischer als auch lokaler Immunantworten beim hepatozellulären Karzinom (HCC). Der Ansatz zielt darauf ab, Einblicke in die Immunlandschaft von HCC zu geben und ein tieferes Verständnis der Tumormikroumgebung und der damit verbundenen Immunmechanismen zu ermöglichen.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Formen von Leberkrebs weltweit. Trotz Fortschritten in der Behandlung bleibt die Prognose für HCC-Patienten aufgrund des komplexen Zusammenspiels von genetischen, umweltbedingten und immunologischen Faktoren, die das Fortschreiten des Fortschreitens vorantreiben, schlecht. Das Verständnis der Immunlandschaft von HCC ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien, insbesondere auf dem Gebiet der Immuntherapie, die vielversprechend für die Verbesserung der Patientenergebnisse ist. In dieser Studie wird die Massenzytometrie (Cytometry by Time-of-Flight [CyTOF]) eingesetzt, um sowohl systemische als auch lokale Immunantworten bei Patienten mit HCC zu untersuchen. Durch die Analyse von peripheren Blut- und Tumorproben zielt die Forschung darauf ab, einzigartige Immunzellpopulationen und ihre funktionellen Zustände zu identifizieren, die mit der HCC-Progression verbunden sind. Die Ergebnisse geben einen umfassenden Überblick über die Immunlandschaft bei HCC und heben potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele hervor. Dieser Ansatz bietet wertvolle Einblicke in die Immunmechanismen, die dem HCC zugrunde liegen, und ebnet den Weg für die Entwicklung wirksamerer Immuntherapien für diese Malignität.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der häufigste primäre Leberkrebs und aufgrund seiner hohen Inzidenz- und Mortalitätsraten ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem¹. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation ist HCC die fünfthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit². Sie tritt besonders häufig in Regionen mit hohen Raten chronischer Hepatitis-B- und -C-Infektionen auf, wie z. B. in Ostasien und Subsahara-Afrika³. Zu den Hauptrisikofaktoren gehören Virushepatitis, Zirrhose und metabolisches Syndrom⁴. HCC erfordert eine langfristige Behandlung, die erhebliche physische und finanzielle Belastungen mit sich bringt, was die Notwendigkeit einer wirksamen Prävention, Früherkennung und innovativen Behandlungsstrategien unterstreicht⁵.

Das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von HCC. Die Leber ist ein immunologisch aktives Organ mit einer Fülle von Immunzellen, darunter leberresidente Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK) und T-Zellen, die für die Überwachung und Beseitigung abnormaler Zellen unerlässlich sind⁶. HCC kann sich jedoch der Immunüberwachung entziehen, indem es immunsuppressive Moleküle exprimiert, immunsuppressive Zellen rekrutiert und die Mikroumgebung des Tumors verändert ^7,8. Diese Immunflucht fördert nicht nur das Tumorwachstum und die Metastasierung, sondern beeinflusst auch das Ansprechen auf die Immuntherapie ^9,10.

Systemische und lokale Immunantworten in der Mikroumgebung des Tumors sind Schlüsselfaktoren, die das Fortschreiten der Krebserkrankung und die therapeutischen Ergebnisse beeinflussen. Bei systemischen Immunantworten handelt es sich um zirkulierende Immunzellen, die entfernte Tumorzellen erkennen und angreifen können, wie z. B. periphere T-Zellen, NK-Zellen und Monozyten, die auf Tumorzellen im ganzen Körper abzielen können. Lokale Immunantworten konzentrieren sich auf die Aktivität von Immunzellen in der Mikroumgebung des Tumors, einschließlich tumorinfiltrierender Lymphozyten (TILs), tumorassoziierter Makrophagen (TAMs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs). Während TILs häufig zytotoxische Wirkungen gegen Tumorzellen ausüben, tragen TAMs und Tregs typischerweise zu einem immunsuppressiven Milieu bei, das das Tumorwachstum unterstützt^11,12. Tumorzellen und Stromazellen können die Mikroumgebung des Tumors umgestalten, um die Immunsuppression zu fördern und sich der Immunüberwachung zu entziehen. Die Wechselwirkung zwischen systemischer und lokaler Immunantwort bestimmt die Gesamtwirksamkeit der Anti-Tumor-Immunität¹¹. Das Verständnis dieser Wechselwirkung kann bei der Entwicklung effektiverer Immuntherapiestrategien helfen.

Die traditionelle Durchflusszytometrie und Immunhistochemie wird zwar häufig in immunologischen Studien eingesetzt, weist jedoch erhebliche Einschränkungen auf, wenn es um die Analyse komplexer Immunlandschaften geht, da sie nicht in der Lage sind, umfassende, hochdimensionale Analysen durchzuführen. Die Durchflusszytometrie ist sehr effektiv für den Nachweis von Oberflächen- und Funktionsmarkern auf Einzelzellebene; Seine Fähigkeit zur gleichzeitigen Multimarkeranalyse ist jedoch eingeschränkt, oft begrenzt durch spektrale Überlappung und praktische Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl der Fluoreszenzmarkierungen, die verwendet werden können^13,14. Die Immunhistochemie hingegen liefert wertvolle Einblicke in den Gewebekontext spezifischer Marker, wird aber in ähnlicher Weise durch die begrenzte Anzahl analysierbarer Marker und die inhärenten Schwierigkeiten behindert, robuste, quantitative und hochdimensionale Bewertungen zu erzielen¹⁵.

Um komplexe Immunumgebungen effektiv zu charakterisieren, sind hochdimensionale Techniken wie die Massenzytometrie (Zytometrie durch Flugzeitmessung [CyTOF]) unerlässlich. Die Massenzytometrie ist eine fortschrittliche Technologie, bei der die Massenspektrometrie eingesetzt wird, um mehrere Proteinmarker in einzelnen Zellen zu analysieren. Es ermöglicht die multiparametrische Analyse einzelner Zellen ohne die spektralen Überlappungsprobleme, die in der traditionellen Durchflusszytometrie auftreten¹⁶. Durch die Verwendung von metallmarkierten Antikörpern kann es Dutzende von Markern gleichzeitig messen und bietet einen umfassenden und unvoreingenommenen Überblick über zelluläre Phänotypen und Funktionen¹⁷. So entwickelten Gadalla et al. ein CyTOF-Panel mit mehr als 40 Parametern für die Analyse von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) und Tumorgewebe, was seinen Vorteil bei der hochdimensionalen Immunphänotypisierung demonstriert¹⁸. Die traditionelle Durchflusszytometrie mit ihrer begrenzten Anzahl nachweisbarer Parameter war nicht in der Lage, diese seltenen Zellpopulationen mit einzigartigen Phänotypen zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ermöglichte die Massenzytometrie eine umfassende Bewertung der Funktionszustände dieser Zellen und ermöglichte so eine detailliertere und robustere Charakterisierung. Behbehani et al. nutzten die Massenzytometrie, um Knochenmarkproben von Patienten mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) zu analysieren und seltene aberrante hämatopoetische Vorläuferzellen erfolgreich zu identifizieren und zu charakterisieren¹⁸. Die Fähigkeit der Massenzytometrie, gleichzeitig über 40 oberflächen- und intrazelluläre Marker zu detektieren, verbesserte den Nachweis dieser niederfrequenten Zelluntergruppen signifikant¹⁹. Diese Fähigkeiten überwinden traditionelle Einschränkungen und bieten tiefere Einblicke in die Immunlandschaft, was den Fortschritt in der Immunologie und therapeutischen Entwicklung vorantreibt. Die Fähigkeit, zelluläre Phänotypen und Funktionen auf Einzelzellebene umfassend zu profilieren, verbessert das Verständnis immunologischer Prozesse erheblich und hilft bei der Entwicklung zielgerichteter Therapien.

Die Massenzytometrie bietet umfassende Einblicke in die systemischen und lokalen Immunzellpopulationen im HCC, indem sie mehrere Proteinmarker gleichzeitig nachweist. Diese Technologie kann zwischen verschiedenen Arten von T-Zellen in der Tumormikroumgebung unterscheiden, wie z. B. Effektor-T-Zellen, regulatorische T-Zellen (Tregs) und erschöpfte T-Zellen, um ihre spezifische Rolle bei der Tumorprogression aufzuklären. Durch den Einsatz von Massenzytometrie können Forscher Immunmarker identifizieren, die mit der HCC-Prognose assoziiert sind²⁰. Zum Beispiel können T-Zell-Untergruppen mit einer hohen PD-1-Expression (Programmed Cell Death Protein 1) als Prädiktoren für die Reaktion eines Patienten auf Immun-Checkpoint-Inhibitoren dienen²¹. Darüber hinaus erleichtert es die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele, indem es spezifische immunsuppressive Moleküle identifiziert und damit eine Grundlage für personalisierte Behandlungsstrategien bietet. Die Fähigkeit der Technologie, mehrere Marker zu erkennen, und ihre Einzelzellauflösung machen sie besonders vorteilhaft für die Aufdeckung neuer therapeutischer Ziele und die Entwicklung von Kombinationsimmuntherapien. Dieser fortschrittliche Ansatz birgt ein erhebliches Potenzial für die Verbesserung der Behandlungsergebnisse bei HCC-Patienten, indem er ein detailliertes Verständnis der Immunlandschaft bietet und die Entwicklung maßgeschneiderter therapeutischer Interventionen ermöglicht.

Ziel dieser Studie ist es, die Massenzytometrie zu nutzen, um die systemischen und lokalen Immunzellprofile von Patienten mit HCC zu analysieren. Ziel ist es, die Immunzellpopulationen zu charakterisieren, diese Merkmale mit klinischen Ergebnissen und therapeutischen Reaktionen zu korrelieren und spezifische Immunmarker und Zelluntergruppen zu identifizieren, die mit der HCC-Prognose assoziiert sind. Durch die Aufklärung der Rolle verschiedener Immunzellen beim Ansprechen auf die Behandlung soll diese Studie eine Grundlage für personalisierte Behandlungsstrategien schaffen. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse bestehende Immuntherapien optimieren und wertvolle Erkenntnisse für die Entwicklung neuer Therapien liefern, die letztendlich darauf abzielen, das Gesamtüberleben und die Lebensqualität von HCC-Patienten zu verbessern.

Die Schritte für die Entnahme von Blut- und HCC-Proben, die Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die Dissoziation einzelner Zellen und die Färbung sind im folgenden Plan beschrieben. Die experimentellen Reagenzien und Materialien sind alle in der Materialtabelle aufgeführt. Alle Experimente wurden mit Genehmigung der Ethikkommission des ersten angeschlossenen Krankenhauses, School of Medicine, Zhejiang University, durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Entnahme von Tumorproben die pathologische Diagnose nicht beeinträchtigt. Von allen Probanden wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

1. Isolierung von PBMCs

1. Entnehmen Sie eine Blutprobe aus der Vene von HCC-Patienten und verwenden Sie ein mit einem Antikoagulans gefülltes Röhrchen, um die Blutgerinnung zu verhindern. Blutproben wurden von 4 Patienten (2 Männer und 2 Frauen) im Alter von 50-60 Jahren mit einem Durchschnittsalter von 55 Jahren entnommen. Entnehmen Sie für jeden Patienten 10-20 ml peripheres Blut, um ein ausreichendes Volumen für die anschließende Isolierung von PBMCs zu gewährleisten und gleichzeitig die Beschwerden des Patienten zu minimieren.
2. Entnehmen Sie ein bestimmtes Blutvolumen (z. B. 6 ml) und geben Sie ein gleiches Volumen an Lymphozytentrennflüssigkeit des peripheren Blutes (Ficol-paque oder Lymphoprep) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen sollte idealerweise 12 mL nicht überschreiten, um Platz für ein ordnungsgemäßes Mischen zu schaffen und ein Überlaufen zu verhindern. Das maximal empfohlene Volumen für ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen beträgt 14 ml.
3. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen um 45° und fügen Sie das Blut langsam entlang der Wand des Röhrchens hinzu, wobei Sie das Blut vorsichtig langsam auf die Lymphozytentrennflüssigkeit des peripheren Blutes legen, um eine Vermischung der beiden Schichten zu vermeiden.
   HINWEIS: Eine Pipette kann verwendet werden, um langsam Blut entlang der Wand des Röhrchens hinzuzufügen.
4. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen in die Zentrifuge und stellen Sie die Beschleunigung auf 8 und die Verzögerung auf 3 ein. Zentrifugieren bei 450 x g, 4 °C, für 30 min. Nach der Zentrifugation werden im Reagenzglas 4 Schichten von oben nach unten gebildet: Plasmaschicht, PBMCs-Schicht (weiße Membranschicht), Ficol-Paque-Schicht sowie Schicht der roten Blutkörperchen und Granulozyten.
5. Sammeln Sie die PBMCs-Schicht vorsichtig mit einer Pipette in einem neuen sterilen Zentrifugenröhrchen. Das 3-fache Volumen PBS zugeben und bei 500 x g bei 4°C 5 min zentrifugieren. Nach der Zentrifugation bildet sich am Boden des Rohrs ein Pellet.
6. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, fügen Sie 1 ml 2 % fötale Rinderserumphosphat-gepufferte Kochsalzlösung (FBS-PBS) hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und fügen Sie dann 3 ml Lysepuffer der roten Blutkörperchen (RBC) hinzu. Zentrifugieren Sie bei 500 x g bei 4°C für 5 min.
7. Stellen Sie sicher, dass sich keine roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens befinden, was darauf hinweist, dass die roten Blutkörperchen vollständig lysiert wurden. Resuspendieren Sie die Zellen in 2% FBS-PBS und fahren Sie direkt mit den nachfolgenden Experimenten fort, oder fügen Sie eine Kryokonservierungslösung hinzu und lagern Sie sie 2-3 Monate lang bei -80 °C.
   HINWEIS: Als allgemeine Richtlinie verwenden Sie für die Resuspension 0,5 ml 2 % FBS-PBS pro 1 x 10⁶ Zellen. Die Zellzahl wird mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler nach der Trypanblau-Färbung bestimmt, um lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. Dieses Verhältnis trägt dazu bei, eine optimale Zellrückgewinnung und Lebensfähigkeit bei nachfolgenden Eingriffen zu gewährleisten.

2. Isolierung von Tumorgewebszellen

HINWEIS: Die Methode zur Isolierung von Tumorgewebezellen wurde von Song et ^al.22 übernommen.

1. Nach der Resektion des HCC unter Anleitung eines Pathologen wird mit einem sterilen Skalpell ein Teil des Tumorgewebes herausgeschnitten. Der Gewebeblock sollte ca. 1 cm³ groß sein. Spülen Sie alle Oberflächenflecken mit vorgekühltem 1x PBS ab. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das etwa 5 ml RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS enthält. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und transportieren Sie es zur weiteren Verarbeitung zurück ins Labor.
2. Spülen Sie Blutflecken gründlich ab und entfernen Sie das fettige Bindegewebe manuell mit einer Pinzette, um eine vollständige Gewebereinigung mit vorgekühltem 2% FBS-PBS zu gewährleisten. Übertragen Sie das Gewebe in eine mit Gewebekulturen behandelte Schale, die eine Verdauungslösung enthält. Befestigen Sie das Tumorgewebe mit einer Pinzette und schneiden Sie es mit einem Skalpell in Stücke, die kleiner als 1 mm³ sind. Übertragen Sie die Gewebeaufschlusslösung in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie mehr Gewebeaufschlusslösung hinzu, bis das Gesamtvolumen etwa 15 ml beträgt.
3. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen mit der Gewebeaufschlussmischung in einen Schüttler. Kippen oder glätten Sie es und sichern Sie es für den Aufschluss bei 150 U/min und 37 °C für 1 h. Die Aufschlusslösung wird durch einen 70 μm Filter filtriert.
   1. Verwenden Sie während dieses Verfahrens einen 1-ml-Spritzenkolben, um die Gewebefragmente zu zerkleinern. Spülen Sie den Filter mit einer 2%igen FBS-1640-Lösung. Nehmen Sie das Filtrat und geben Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
4. Das Filtrat bei 500 x g für 5 min bei 4 ^°C zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in ca. 10 ml 36%iger Percoll-Lösung. Dann wird es erneut bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
5. Aspirieren Sie vorsichtig 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer mit einer Pipette, um die Zellsuspension wieder zu suspendieren. Übertragen Sie die Suspension in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie den Erythrozyten-Lysepuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 10 mL zu erreichen. Lassen Sie die Mischung 10 min bei Raumtemperatur ziehen.
   HINWEIS: Ein neues Zentrifugenröhrchen wird verwendet, um zu verhindern, dass Verunreinigungen an der Röhrchenwand wieder in die Zellsuspension gelangen, wodurch das Risiko einer verminderten Zellausbeute verringert wird.
6. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 4 °C bei 500 x g zentrifugiert, dann werden die Zellen in einem geeigneten Volumen von 2 % FBS-PBS resuspendiert. Als allgemeine Richtlinie sollten 0,5 ml 2 % FBS-PBS pro 1 x 10⁶ Zellen zur Resuspension verwendet werden.
   HINWEIS: Die Zellzahl wird mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler nach der Trypanblau-Färbung bestimmt, um lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. Das Resuspensionsvolumen hängt von der benötigten Zellmenge für nachfolgende Experimente ab. Dieses Verhältnis trägt dazu bei, eine optimale Zellrückgewinnung und Lebensfähigkeit bei nachfolgenden Eingriffen zu gewährleisten.

3. Cisplatin-Färbung

1. Es werden 3 x 10⁶ Zellen aus den in Schritt 1.7 gewonnenen PBMC bzw. aus den in Schritt 2.6 isolierten Tumorzellen entnommen. Nach der Zellregeneration resuspendieren Sie sie in 1 ml PBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺. Cisplatin bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μM zugeben, gut mischen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Die Cisplatin-Färbung wird durchgeführt, um tote Zellen von lebenden Zellen anhand der Membranintegrität zu unterscheiden. Tote Zellen mit kompromittierten Membranen nehmen Cisplatin auf und zeigen ein positives Signal, während lebende Zellen ungefärbt bleiben²³. Die Anzahl der Zellen muss mindestens 1 x 10⁶ betragen.
2. Die Röhrchen werden bei 500 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand verworfen und dann 1 ml Zellfärbepuffer in jedes Röhrchen gegeben, das die in Schritt 3.1 hergestellten Zellsuspensionen enthält, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Überstand und stellen Sie sicher, dass das Zellpellet nach der Zentrifugation nicht linear entlang der Wand des Röhrchens verteilt ist.

4. Blockierung von Fc-Rezeptoren

1. Bereiten Sie im Voraus für jede Probe eine 50-μl-Blockmischung vor: Kombinieren Sie 48 μl Zellfärbepuffer und fügen Sie dann 2 μl Fc-Blockierungslösung hinzu (Zellfärbepuffer: Fc-Blockierungslösung = 9:1).
2. Suspendieren Sie die Zellen aus Schritt 3.2 in der obigen Mischung und lassen Sie sie 10 min bei Raumtemperatur ruhen.

5. Inkubation von Membranprotein-Antikörpern

1. Für jede Zellprobe, die aus Schritt 4.2 gewonnen wird, wird die Membranprotein-Antikörpermischung durch Zugabe von 1,1 μl-Einheiten jedes Antikörpers hergestellt. Fügen Sie dann Zellfärbepuffer hinzu, um ein Endvolumen von 55 μl zu erreichen. Zu diesem Zeitpunkt beträgt das Gesamtvolumen etwa 100 μL.
   HINWEIS: Die Mischung enthält Antikörper, die auf wichtige Membranproteine wie CD163, CCR3, CD141, CD117 und CD45^{abzielen 24,25}. Diese Antikörper wurden aufgrund ihrer Spezifität bei der Identifizierung von Membranproteinmarkern ausgewählt und aus kommerziell erhältlichen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle für Details, einschließlich Klonnummern, Hersteller und Katalognummern).
2. Geben Sie 50 μl der vorbereiteten Antikörpermischung in jede Röhrchenprobe und bringen Sie das Gesamtvolumen auf 100 μl. Schwenken Sie die Proben vorsichtig und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Geben Sie 2 ml Zellfärbepuffer zu jeder Probe, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 x g und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
4. Entsorgen Sie den Überstand und wirbeln Sie die restliche Flüssigkeit kurz mit dem Zellpellet vor, um die Zelle wieder zu resuspendieren und gründlich zu dispergieren.

6. Färbung von Zellkernproteinen

1. Sobald die Zellen vollständig resuspendiert sind, geben Sie 500 μl der gemischten Lösung (Fixierung: Fixierung/Permeabilisierung = 3:1) zu jeder Probe aus Schritt 5.4. Mischen Sie die Proben vorsichtig und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
2. Verdünnen Sie den Permeabilisierungspuffer (10x) mit entionisiertem Wasser. Nach der Inkubation bei 500 g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Geben Sie 1000 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jedes Röhrchen, um die Zellen zu waschen. Bei Raumtemperatur bei 1.000 x g 5 min zentrifugieren, dann den Überstand verwerfen.
3. Resuspendieren Sie Antikörper in 1x Permeabilisierungspuffer. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 50 μl des Antikörpergemisches in jedes Zellröhrchen. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie dann 30-45 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Geben Sie 1000 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jedes Röhrchen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.000 x g und entsorgen Sie den Überstand.
5. Geben Sie 1000 μl Zellfärbepuffer in jedes Röhrchen, um die Zellen wieder zu resuspendieren, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.000 x g und verwerfen Sie den Überstand.

7. Fixierung der Zellen

1. Bereiten Sie eine 1,6%ige Formaldehydlösung in PBS vor, wobei 1 ml pro Probe benötigt wird.
2. 1 ml 1,6%ige Formaldehydlösung zu jeder Probe aus Schritt 6.5 geben, gründlich durchrühren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Während Formaldehyd häufig für die Zellfixierung verwendet wird, können auch alternative Reagenzien wie 4% Paraformaldehyd (PFA) oder Methanol verwendet werden. Die Wahl des Fixiermittels sollte auf den spezifischen Anforderungen des Versuchs und den zu beobachtenden zellulären Merkmalen basieren.
3. Bei Raumtemperatur bei 800 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

8. Färben der nuklearen Interkalation

1. Bereiten Sie die Zellinterkalationslösung vor: Verdünnen Sie Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) mit Fix und Permeabilisierungspuffer auf eine Endkonzentration von 125 nM. Bereiten Sie 1 ml der Lösung pro Probe vor.
2. 1 ml der vorbereiteten Zellinterkalationslösung wird zu jeder fixierten Probe aus Schritt 7.3 gegeben. Vorsichtig mischen und sofort vortexen. Dies trägt dazu bei, die Bildung von Zellaggregaten zu minimieren.
3. 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren. Bei 500 g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

9. Herstellung der Zellsuspension

1. 1000 μl Zellfärbepuffer in das Röhrchen aus Schritt 8.3 geben und bei 800 x g für 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
2. Fügen Sie 450 μl bis 900 μl deionisiertes Wasser hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler nach der Trypanblau-Färbung. Fahren Sie nach der Zählung mit der Datenerfassung und -analyse mittels Massenzytometrie fort.

10. Massenzytometrie und Datenanalyse

1. Erfassen Sie Massenzytometriedaten mit einem CyTOF-System und speichern Sie sie als FCS-Dateien (Flow Cytometry Standard). Stellen Sie eine ordnungsgemäße Kalibrierung und Qualitätskontrolle des Geräts sicher, um Hintergrundgeräusche und Chargeneffekte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reduzieren.
2. Verarbeiten Sie die CD45⁺ -Zellpopulation in der FCS-Datei mit der zugehörigen Software vor. Entfernen Sie Schmutz basierend auf der Zellgröße (Vorwärtsstreuung, FSC) und der Körnung (Seitenstreuung, SSC). Schließen Sie Dubletten durch sequenzielles Gating von FSC-A/FSC-H- oder SSC-A/SSC-H-Diagrammen aus. Beseitigen Sie abgestorbene Zellen durch Viabilitätsfärbung, wie z. B. Cisplatin-Ausschluss. Gatet die CD45⁺ -Population, um sich auf Immunzellen zu konzentrieren, und exportiert die Gated Population zur weiteren Analyse.
3. Transformieren Sie die Daten mit einem Cofaktor von 5 und identifizieren Sie die wichtigsten Cluster mithilfe von Clustering-Software. Führen Sie eine Cluster-Bildung auf der Grundlage des SPADE-Algorithmus (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events) durch, der Zellen mit ähnlichen Markerexpressionsprofilen in Clustern²⁶ gruppiert. Verwenden Sie die hierarchische stochastische Nachbareinbettung (HSNE) zur Reduzierung der Dimensionalität und zur Identifizierung unterschiedlicher Cluster²⁶.
4. Führen Sie ein Re-Clustering der Hauptcluster mit dem cytofkit-Paket in der R-Software für unüberwachtes Clustering durch. Identifizieren Sie Sub-Cluster mit PhenoGraph unter Verwendung von Standardparametern.
5. Wenden Sie Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) zur Reduzierung der Dimensionalität an. Führen Sie eine statistische Analyse mit dem Wilcoxon-Test durch, wobei ein p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird. Visualisieren Sie die Ergebnisse mit ggplot2.

Um die immunologischen Eigenschaften von HCC aufzuklären, wurde eine umfassende Analyse von Immunzellpopulationen durchgeführt. Gepaarte PBMC- und HCC-Gewebeproben wurden von 4 Patienten mit HCC entnommen. Zur Untersuchung von Immunzellpopulationen auf Einzelzellproteomebene wurde eine Massenzytometrie-Profilierung durchgeführt, wobei zwei Antikörper-Panels sowohl für PBMCs als auch für HCC-Gewebeproben verwendet wurden.

Nach der Qualitätskontrolle wurden 45.326 Zellen in die massenzytometrische Analyse eingeschlossen. Der PhenoGraph-Clustering-Algorithmus wurde in Verbindung mit t-SNE verwendet, um zweidimensionale Diagramme zu generieren und die Zellen in verschiedene Phänotypen zu unterteilen. Die wichtigsten Untergruppen der Immunzellen wurden anhand von Linienmarkern wie CD3 (T-Zellen), CD4 (CD4⁺ T-Zellen), CD8 (CD8⁺ T-Zellen), CD56 (NK-Zellen), CD19 (B-Zellen) und CD14 (Monozyten) ^{identifiziert27,28}. Immunzellcluster wurden mit Hilfe von Massenzytometrie-Technologien charakterisiert.

In PBMC-Proben, wie in Abbildung 1A gezeigt, wurden insgesamt 14 Zelltypen identifiziert, darunter CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen, Monozyten, CD8-T-Zellen des zentralen Speichers (CD8Tcm), Makrophagen, plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs), Basophile, Eosinophile, Effektor-CD8-T-Zellen (CD8Teff), CD141⁺ konventionelle dendritische Zellen (CD141⁺ cDCs), Neutrophile und CD1c⁺ konventionelle dendritische Zellen (CD1c⁺ cDCs). Das detaillierte Markerausdrucksmuster für jeden Zelltyp ist in Abbildung 1B dargestellt. Darüber hinaus zeigt Abbildung 1C die Verteilung dieser Zelltypen innerhalb jeder Probe. In den PBMC-Proben wurden unterschiedliche Anteile jedes Zelltyps identifiziert. Bemerkenswert ist, dass Probe D im Vergleich zu den anderen Proben einen höheren Anteil an CD4-T-Zellen aufwies. Die Proben A und B zeigten eine signifikante Anreicherung von B-Zellen. Zusätzlich wurden in Probe C überwiegend CD141⁺ konventionelle dendritische Zellen (CD141⁺ cDCs) gefunden. Diese Ergebnisse unterstreichen die einzigartige Verteilung und Häufigkeit spezifischer Zelltypen in verschiedenen Proben und geben Einblicke in die Heterogenität der Immunlandschaft bei HCC.

In ähnlicher Weise wurden in Gewebeproben, wie in Abbildung 2A gezeigt, 8 Zelltypen identifiziert, darunter Monozyten, T-Zellen, Neutrophile, NK-Zellen, B-Zellen, pDCs, Eosinophile und myeloische dendritische Zellen (mDCs). Das Markerexpressionsmuster für jeden Zelltyp ist in Abbildung 2B dargestellt, und Abbildung 2C stellt die Verteilung dieser Zelltypen innerhalb der Stichproben visuell dar. Die Gewebeproben zeigten ein konsistentes Muster des Zelltypverhältnisses bei allen Patienten. Dies deutet auf eine gemeinsame immunologische Eigenschaft in Bezug auf die relative Häufigkeit dieser Zelltypen im HCC hin. Das Verständnis dieses konsistenten Musters bietet wertvolle Einblicke in die zugrunde liegende Immunlandschaft und ihre potenziellen Auswirkungen auf die Pathogenese von HCC.

Der durch diese Analyse erstellte Immunzellatlas bietet wertvolle Einblicke in die Immunlandschaft von HCC und gibt Aufschluss über die zellulären und systemischen Anpassungen, die mit der Krankheit verbunden sind.

Abbildung 1: Multi-Omics-Profilerstellung des PBMCs-Ökosystems. (A) Die 14 Zellcluster, die aus PBMC-Proben identifiziert und in einem t-SNE-Diagramm dargestellt wurden. (B) Proteinmarker für die in (A) gezeigten Zellcluster. (C) Verteilungsmuster der Teilmengen über 4 Proben basierend auf Massenzytometriedaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Multi-Omics-Profiling des HCC-Gewebeökosystems. (A) Die 8 Zellcluster, die aus HCC-Gewebeproben identifiziert und in einem t-SNE-Diagramm dargestellt wurden. (B) Proteinmarker für die in (A) gezeigten Zellcluster. (C) Verteilungsmuster der Teilmengen über 4 Proben basierend auf Massenzytometriedaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese Studie nutzt die Massenzytometrie-Technologie, um eine eingehende Analyse sowohl der systemischen als auch der lokalen Immunantworten bei HCC zu ermöglichen. Die Anwendung der Massenzytometrie in diesem Zusammenhang ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker auf Einzelzellebene und bietet eine detaillierte immunphänotypische Charakterisierung, die für das Verständnis der komplexen Immunlandschaft von HCC entscheidend ist. Die Massenzytometrie hat immunologische Studien revolutioniert, indem sie die hochdimensionale Einzelzellanalyse ermöglicht. Bei dieser Technik werden Isotopenmarkierungen aus seltenen Metallen verwendet, die an Antikörper konjugiert sind, und ermöglicht so die gleichzeitige Messung von über 40 Parametern in einem einzigen Lauf. Diese Fähigkeit ist besonders vorteilhaft bei der Untersuchung von HCC, wo die Tumormikroumgebung (TME) durch ein hohes Maß an zellulärer Heterogenität und komplizierte Immuninteraktionen gekennzeichnet ist^18,29.

Ein wesentlicher Vorteil der Massenzytometrie gegenüber der herkömmlichen Durchflusszytometrie ist ihre verbesserte Multiplexfähigkeit. Während die konventionelle Durchflusszytometrie bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkern durch spektrale Überlappungen eingeschränkt ist, werden bei der Massenzytometrie Metallisotope verwendet, die nicht unter diesem Problem leiden. Dies ermöglicht die gleichzeitige Detektion einer größeren Anzahl von Markern, ohne dass komplexe Kompensationsalgorithmen^{erforderlich sind 30}. Diese Fähigkeit ist in der HCC-Forschung von entscheidender Bedeutung, da die Profilierung verschiedener Immunzellpopulationen und ihrer Zustände für das Verständnis von Tumor-Immun-Interaktionen von entscheidender Bedeutung ist. Die Massenzytometrie liefert hochdimensionale Daten mit Einzelzellauflösung und ermöglicht so eine umfassende Analyse von Immunzellen innerhalb des TME³¹. Dieser Detaillierungsgrad ist entscheidend für die Identifizierung seltener Zellpopulationen und das Verständnis ihrer Rolle bei der Tumorprogression und Immunevasion. So kann die Massenzytometrie beispielsweise zwischen Untergruppen von T-Zellen, Makrophagen und anderen Immunzellen unterscheiden und so Einblicke in deren Funktionszustände und Wechselwirkungen innerhalb des Tumors geben¹⁸.

Eine Abfolge kritischer Schritte im Protokoll gewährleistet die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der erhaltenen Daten. Während der Blutschichtung über die Trennflüssigkeit ist eine sorgfältige und langsame Zugabe unerlässlich, um die Integrität der Schichten zu erhalten und eine Vermischung zu vermeiden, was für die erfolgreiche Isolierung von PBMCs³² entscheidend ist. In ähnlicher Weise erfordert die enzymatische Verdauung von Tumorgeweben ein sorgfältiges Timing, um Dissoziation und Zellviabilität auszugleichen³³. Die richtige Handhabung in diesen Phasen gewährleistet eine hohe Rückgewinnung und Reinheit von PBMCs und Tumorzellen, was für die nachgelagerte Färbung und Massenzytometrie-Analyse unerlässlich ist. Darüber hinaus spielt der Cisplatin-Färbeprozess eine entscheidende Rolle bei der genauen Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen; Ein falsches Timing oder eine falsche Konzentration können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen, die sich auf die Datenqualität auswirken³⁴. Darüber hinaus minimiert die Fc-Rezeptor-Blockierung die unspezifische Antikörperbindung und gewährleistet eine präzise Identifizierung von Zelloberflächenmarkern, während die Fixierungs- und Permeabilisierungsschritte sorgfältig kontrolliert werden müssen, um die zelluläre Integrität und die intrazellulären Antigene zu erhalten, die für genaue Ergebnisse der Massenzytometrie entscheidend sind³⁵.

Die hochdimensionalen Analysemöglichkeiten der Massenzytometrie machen sie zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Entdeckung von Biomarkern bei HCC. Durch die Profilierung der Immunlandschaft auf Einzelzellebene können Forscher potenzielle Biomarker identifizieren, die mit dem Krankheitsverlauf, dem therapeutischen Ansprechen und der Gesamtprognose verbunden sind³⁶. Die unterschiedlichen Immunzellverteilungen, die in dieser Studie über PBMC- und Gewebeproben hinweg beobachtet wurden, liefern wichtige Informationen für die Patientenstratifizierung. Zum Beispiel können Patienten mit einem höheren Spiegel an Effektor-CD8-T-Zellen besser auf Therapien ansprechen, die die zytotoxische T-Zellaktivität erhöhen, während Patienten mit erhöhten Spiegeln von immunsuppressiven Zellen, wie z. B. Tregs, von Kombinationstherapien profitieren können, um die Immunumgebung effektiv zu modulieren. Dieser stratifizierte Ansatz könnte zu personalisierten und effektiveren Behandlungsstrategien für HCC führen.

Die Massenzytometrie liefert detaillierte Einblicke in die Immunzellpopulationen und ihre funktionellen Zustände innerhalb der TME und trägt zur Identifizierung potenzieller Ziele für die Immuntherapie bei³⁷. Diese Biomarker können validiert und zur Entwicklung gezielter Therapien und personalisierter Behandlungsstrategien verwendet werden³⁰. Die Identifizierung immunsuppressiver Zellpopulationen wie Tregs und myeloischer Suppressorzellen (MDSCs) kann die Entwicklung von Therapien unterstützen, die darauf abzielen, diese Zellen zu modulieren, um die Anti-Tumor-Immunität zu verbessern³⁸. Die Massenzytometrie ermöglicht ein umfassendes Immunprofiling, das für das Verständnis der komplexen Wechselwirkungen innerhalb des TME³⁹ unerlässlich ist. Dazu gehört die Charakterisierung der räumlichen Verteilung von Immunzellen, ihrer phänotypischen und funktionellen Zustände und ihrer Wechselwirkungen mit Tumorzellen⁴⁰. Ein solches detailliertes Profiling kann neue Einblicke in die Mechanismen der Immunevasion und -resistenz liefern und die Entwicklung von Kombinationstherapien leiten, die auf mehrere Signalwege abzielen.

Die Massenzytometrie-Technologie bietet erhebliche Vorteile bei der Analyse systemischer und lokaler Immunantworten bei HCC. Die verbesserten Multiplexing-Fähigkeiten, die hohe Dimensionalität und die Einzelzellauflösung bieten detaillierte Einblicke in die Immunlandschaft von HCC⁴¹. Durch die Nutzung dieser detaillierten immunphänotypischen Daten können Forscher ein tieferes Verständnis der Mechanismen der Immunevasion bei HCC erlangen und effektivere immuntherapeutische Strategien entwickeln, um die Patientenergebnisse zu verbessern.

Trotz der Vorteile der Massenzytometrie-Technologie und ihrer Anwendung bei der Profilierung der Immunlandschaft von HCC hat sie auch Grenzen. Der mehrstufige Isolierungs- und Färbeprozess kann zu Zellverlust führen, insbesondere bei fragilen Immunzellpopulationen. Die Fixierung kann die Epitoperkennung verändern, was möglicherweise die Genauigkeit der Markererkennung beeinträchtigen kann. Darüber hinaus reagiert die Datenanalyse der Massenzytometrie empfindlich auf Batch-Effekte, die Artefakte einführen können. Schließlich schränkt der Bedarf an einer beträchtlichen Anzahl lebensfähiger Zellen die Anwendbarkeit des Protokolls auf kleine Tumorproben^{ein 42}. Zukünftige Optimierungen sind erforderlich, um diese Einschränkungen zu beheben und die Robustheit der Methodik zu verbessern. Die Integration von Massenzytometriedaten mit anderen hochdimensionalen Techniken in zukünftigen Studien wird das Verständnis der Immunantworten bei HCC weiter vorantreiben und die Entwicklung innovativer Therapien leiten.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China (Stipendium 2019YFA0803000 an J.S.), die Excellent Youth Foundation von Zhejiang Scientific (Stipendium R22H1610037 an J.S.), die National Natural Science Foundation of China (Stipendium 82173078 an J.S.), die Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (Stipendium 2022C03037 an J.S.).