Analisi della citometria di massa delle risposte immunitarie sistemiche e locali nel carcinoma epatocellulare

Questo protocollo delinea un metodo completo di analisi della citometria di massa (citometria a tempo di volo [CyTOF]) per valutare le risposte immunitarie sistemiche e locali nel carcinoma epatocellulare (HCC). L'approccio mira a fornire informazioni sul panorama immunitario dell'HCC, offrendo una comprensione più profonda del microambiente tumorale e dei meccanismi immunitari associati.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una delle forme più comuni e letali di cancro al fegato in tutto il mondo. Nonostante i progressi nel trattamento, la prognosi per i pazienti con HCC rimane infausta a causa della complessa interazione di fattori genetici, ambientali e immunologici che ne guidano la progressione. Comprendere il panorama immunitario dell'HCC è fondamentale per lo sviluppo di terapie efficaci, in particolare nel campo dell'immunoterapia, che è molto promettente per migliorare gli esiti dei pazienti. Questo studio utilizza la tecnologia della citometria di massa (citometria a tempo di volo [CyTOF]) per studiare le risposte immunitarie sistemiche e locali nei pazienti con HCC. Analizzando campioni di sangue periferico e tumori, la ricerca mira a identificare popolazioni di cellule immunitarie uniche e i loro stati funzionali associati alla progressione dell'HCC. I risultati forniscono una panoramica completa del panorama immunitario nell'HCC, evidenziando potenziali biomarcatori e bersagli terapeutici. Questo approccio offre preziose informazioni sui meccanismi immunitari alla base dell'HCC e apre la strada allo sviluppo di immunoterapie più efficaci per questa neoplasia.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il tumore primario del fegato più comune e un problema di salute globale significativo a causa della sua elevata incidenza e tassi di mortalità¹. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, l'HCC è il quinto tumore più comune e la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo². È particolarmente diffusa nelle regioni con alti tassi di infezioni croniche da epatite B e C, come l'Asia orientale e^l'Africa subsahariana3. I principali fattori di rischio includono l'epatite virale, la cirrosi e la sindrome metabolica⁴. L'HCC richiede un trattamento a lungo termine, imponendo notevoli oneri fisici e finanziari, sottolineando la necessità di una prevenzione efficace, di una diagnosi precoce e di strategie di trattamento innovative⁵.

Il sistema immunitario svolge un ruolo cruciale nello sviluppo dell'HCC. Il fegato è un organo immunologicamente attivo con un'abbondanza di cellule immunitarie, inclusi macrofagi residenti nel fegato, cellule natural killer (NK) e cellule T, che sono essenziali per il monitoraggio e l'eliminazione delle cellule anormali⁶. Tuttavia, l'HCC può eludere la sorveglianza immunitaria esprimendo molecole immunosoppressive, reclutando cellule immunosoppressive e alterando il microambiente tumorale ^7,8. Questa fuga immunitaria non solo promuove la crescita del tumore e le metastasi, ma influenza anche la risposta all'immunoterapia ^9,10.

Le risposte immunitarie sistemiche e locali nel microambiente tumorale sono fattori chiave che influenzano la progressione del cancro e i risultati terapeutici. Le risposte immunitarie sistemiche coinvolgono cellule immunitarie circolanti in grado di riconoscere e attaccare cellule tumorali distanti, come le cellule T periferiche, le cellule NK e i monociti che possono colpire le cellule tumorali in tutto il corpo. Le risposte immunitarie locali si concentrano sull'attività delle cellule immunitarie all'interno del microambiente tumorale, compresi i linfociti infiltranti il tumore (TIL), i macrofagi associati al tumore (TAM) e le cellule T regolatorie (Treg). Mentre i TIL spesso esercitano effetti citotossici contro le cellule tumorali, i TAM e le Treg in genere contribuiscono a creare un ambiente immunosoppressivo che supporta la crescita tumorale^11,12. Le cellule tumorali e le cellule stromali possono rimodellare il microambiente tumorale per promuovere l'immunosoppressione ed eludere la sorveglianza immunitaria. L'interazione tra le risposte immunitarie sistemiche e locali determina l'efficacia complessiva dell'immunità antitumorale¹¹. La comprensione di questa interazione può aiutare a sviluppare strategie di immunoterapia più efficaci.

La citometria a flusso e l'immunoistochimica tradizionali, sebbene ampiamente utilizzate negli studi immunologici, presentano limitazioni significative quando si tratta di analizzare paesaggi immunitari complessi a causa della loro incapacità di eseguire analisi complete e ad alta dimensione. La citometria a flusso è molto efficace per rilevare marcatori di superficie e funzionali a livello di singola cellula; Tuttavia, la sua capacità di analisi simultanea di più marcatori è limitata, spesso limitata dalla sovrapposizione spettrale e da vincoli pratici sul numero di tag fluorescenti che possono essere utilizzati ^13,14. L'immunoistochimica, d'altra parte, fornisce preziose informazioni sul contesto tissutale di marcatori specifici, ma è altrettanto ostacolata dal numero limitato di marcatori analizzabili e dalle difficoltà intrinseche di ottenere valutazioni robuste, quantitative e ad alta dimensione¹⁵.

Per caratterizzare efficacemente ambienti immunitari complessi, sono essenziali tecniche ad alta dimensionalità come la citometria di massa (CyTOF). La citometria di massa è una tecnologia avanzata che impiega la spettrometria di massa per analizzare più marcatori proteici in singole cellule. Consente l'analisi multiparametrica di singole cellule senza i problemi di sovrapposizione spettrale osservati nella citometria a flusso tradizionale¹⁶. Utilizzando anticorpi marcati con metallo, è in grado di misurare dozzine di marcatori contemporaneamente, offrendo una visione completa e imparziale dei fenotipi e delle funzioni cellulari¹⁷. Ad esempio, Gadalla et al. hanno sviluppato un pannello CyTOF con più di 40 parametri per l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e del tessuto tumorale, dimostrando il suo vantaggio nell'immunofenotipizzazione ad alta dimensione¹⁸. La citometria a flusso tradizionale, con il suo numero limitato di parametri rilevabili, non è stata in grado di identificare queste rare popolazioni cellulari che presentano fenotipi unici. Al contrario, la citometria di massa ha permesso una valutazione completa degli stati funzionali di queste cellule, fornendo una caratterizzazione più dettagliata e robusta. Behbehani et al. hanno utilizzato la citometria di massa per analizzare campioni di midollo osseo da pazienti con sindromi mielodisplastiche (MDS), identificando e caratterizzando con successo rare cellule progenitrici ematopoietiche aberranti¹⁸. La capacità della citometria di massa di rilevare simultaneamente oltre 40 marcatori di superficie e intracellulari ha migliorato significativamente il rilevamento di questi sottogruppi di cellule a bassa frequenza¹⁹. Queste capacità superano i limiti tradizionali e forniscono informazioni più approfondite sui paesaggi immunitari, guidando il progresso nell'immunologia e nello sviluppo terapeutico. La capacità di profilare in modo completo i fenotipi e le funzioni cellulari a livello di singola cellula fa progredire notevolmente la comprensione dei processi immunologici e aiuta nello sviluppo di terapie mirate.

La citometria di massa fornisce informazioni complete sulle popolazioni di cellule immunitarie sistemiche e locali nell'HCC, rilevando simultaneamente più marcatori proteici. Questa tecnologia è in grado di distinguere tra vari tipi di cellule T all'interno del microambiente tumorale, come le cellule T effettrici, le cellule T regolatorie (Treg) e le cellule T esaurite, chiarendo i loro ruoli specifici nella progressione del tumore. Utilizzando la citometria di massa, i ricercatori possono identificare i marcatori immunitari associati alla prognosi dell'HCC²⁰. Ad esempio, sottogruppi di cellule T con un'elevata espressione della proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1) possono fungere da predittori della risposta di un paziente agli inibitori del checkpoint immunitario²¹. Inoltre, facilita la scoperta di nuovi bersagli terapeutici identificando specifiche molecole immunosoppressori, fornendo così una base per strategie di trattamento personalizzate. La capacità della tecnologia di rilevare più marcatori e la sua risoluzione a singola cellula la rendono particolarmente vantaggiosa per scoprire nuovi bersagli terapeutici e progettare immunoterapie combinate. Questo approccio avanzato ha un potenziale significativo per migliorare i risultati del trattamento nei pazienti con HCC, offrendo una comprensione dettagliata del panorama immunitario e consentendo lo sviluppo di interventi terapeutici su misura.

Questo studio mira a utilizzare la citometria di massa per analizzare i profili delle cellule immunitarie sistemiche e locali dei pazienti con HCC. Gli obiettivi sono caratterizzare le popolazioni di cellule immunitarie, correlare queste caratteristiche con gli esiti clinici e le risposte terapeutiche e identificare specifici marcatori immunitari e sottogruppi cellulari associati alla prognosi dell'HCC. Chiarendo i ruoli di varie cellule immunitarie nelle risposte al trattamento, questo studio cerca di fornire una base per strategie di trattamento personalizzate. Si prevede che i risultati ottimizzeranno le immunoterapie esistenti e offriranno preziose informazioni per lo sviluppo di nuovi trattamenti, con l'obiettivo di migliorare la sopravvivenza globale e la qualità della vita dei pazienti con HCC.

Le fasi per la raccolta dei campioni di sangue e HCC, l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), la dissociazione di singole cellule e la colorazione sono descritte nel seguente piano. I reagenti e i materiali sperimentali sono tutti elencati nella Tabella dei Materiali. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l'approvazione del Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato, Scuola di Medicina, Università di Zhejiang, garantendo che la raccolta di campioni tumorali non interferisse con la diagnosi patologica. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti umani.

1. Isolamento delle PBMC

1. Prelevare un campione di sangue dalla vena dei pazienti con HCC e utilizzare una provetta riempita con un anticoagulante per prevenire la coagulazione del sangue. I campioni di sangue sono stati prelevati da 4 pazienti (2 maschi e 2 femmine) di età compresa tra 50 e 60 anni, con un'età media di 55 anni. Per ogni paziente, raccogliere 10-20 ml di sangue periferico per garantire un volume sufficiente per il successivo isolamento delle PBMC, riducendo al minimo il disagio del paziente.
2. Prelevare un volume specifico di sangue (ad es. 6 ml) e aggiungere un volume uguale di liquido di separazione dei linfociti nel sangue periferico (Ficol-paque o Lymphoprep) a una provetta da centrifuga da 15 ml.
   NOTA: Il volume totale idealmente non dovrebbe superare i 12 ml per lasciare spazio per una corretta miscelazione e per evitare traboccamenti; il volume massimo raccomandato per una provetta da centrifuga da 15 mL è di 14 mL.
3. Inclinare la provetta da centrifuga a 45° e aggiungere lentamente il sangue lungo la parete della provetta, posando delicatamente il sangue lentamente sopra il liquido di separazione dei linfociti del sangue periferico per evitare di mescolare i due strati.
   NOTA: Una pipetta può essere utilizzata per aggiungere lentamente sangue lungo la parete del tubo.
4. Posizionare la provetta da centrifuga nella centrifuga e impostare l'accelerazione a 8 e la decelerazione a 3. Centrifugare a 450 x g, 4 °C, per 30 min. Dopo la centrifugazione, si formano 4 strati nella provetta, dall'alto verso il basso: strato di plasma, strato di PBMC (strato di membrana bianca), strato di Ficol-Paque e strato di globuli rossi e granulociti.
5. Utilizzando una pipetta, raccogliere con cura lo strato di PBMC in una nuova provetta da centrifuga sterile. Aggiungere 3 volte il volume di PBS e centrifugare a 500 x g a 4°C per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, si forma un pellet sul fondo del tubo.
6. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta, aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata con siero-fosfato bovino fetale al 2% (FBS-PBS) per risospendere le cellule, quindi aggiungere 3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC). Centrifugare a 500 x g a 4°C per 5 min.
7. Assicurarsi che non ci siano globuli rossi sul fondo della provetta, indicando che i globuli rossi sono stati completamente lisati. Risospendere le cellule in FBS-PBS al 2% e procedere direttamente con gli esperimenti successivi, oppure aggiungere una soluzione di crioconservazione cellulare e conservare a -80°C per 2-3 mesi.
   NOTA: Come linea guida generale, per la risospensione, utilizzare 0,5 mL di FBS-PBS al 2% per 1 x 10⁶ cellule. La conta cellulare viene determinata utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato dopo la colorazione con blu di tripano per distinguere le cellule vive da quelle morte. Questo rapporto aiuta a garantire un recupero e una vitalità cellulari ottimali durante le procedure successive.

2. Isolamento delle cellule del tessuto tumorale

NOTA: Il metodo per l'isolamento delle cellule del tessuto tumorale è stato adattato da Song et ^al.22.

1. Dopo aver resecato l'HCC, guidati da un patologo, utilizzare un bisturi sterile per asportare una parte del tessuto tumorale. Il blocco di tessuto dovrebbe avere una dimensione di circa 1 cm³ . Risciacquare le macchie superficiali con 1x PBS pre-raffreddato. Immergere il tessuto in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente circa 5 mL di terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS. Posizionare la provetta sul ghiaccio e trasportarla nuovamente in laboratorio per un'ulteriore elaborazione.
2. Sciacquare accuratamente le macchie di sangue e rimuovere manualmente il tessuto connettivo adiposo utilizzando una pinza per garantire una pulizia completa dei tessuti con FBS-PBS al 2% preraffreddato. Trasferire il tessuto in un piatto trattato con coltura tissutale contenente una soluzione digestiva. Fissare il tessuto tumorale con una pinza e tagliarlo in pezzi più piccoli di 1 mm³ con un bisturi. Trasferire la soluzione per la digestione dei tessuti in una provetta da centrifuga da 50 mL, aggiungendo altra soluzione per la digestione dei tessuti fino a quando il volume totale non raggiunge circa 15 mL.
3. Mettere la provetta da centrifuga contenente la miscela per la digestione dei tessuti in uno shaker. Inclinarlo o appiattirlo e fissarlo per la digestione a 150 giri/min e 37 °C per 1 ora. Filtrare la soluzione di digestione attraverso un filtro da 70 μm.
   1. Durante questa procedura, utilizzare uno stantuffo della siringa da 1 ml per macinare i frammenti di tessuto. Sciacquare il filtro con una soluzione FBS-1640 al 2%. Prelevare il filtrato e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 mL.
4. Centrifugare il filtrato a 500 x g per 5 minuti a 4 ^°C. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Risospendere con cautela il pellet in circa 10 mL di soluzione di Percoll al 36%. Quindi, centrifugare nuovamente a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
5. Aspirare delicatamente 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi con una pipetta per risospendere la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere il tampone di lisi dei globuli rossi per raggiungere un volume totale di 10 mL. Lasciare riposare il composto a temperatura ambiente per 10 minuti.
   NOTA: Viene utilizzata una nuova provetta da centrifuga per evitare che eventuali impurità sulla parete della provetta rientrino nella sospensione cellulare, riducendo così il rischio di una diminuzione della resa cellulare.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi risospendere le cellule in un volume appropriato del 2% FBS-PBS. Come linea guida generale, utilizzare 0,5 mL di FBS-PBS al 2% per 1 x 10⁶ cellule per la risospensione.
   NOTA: La conta cellulare viene determinata utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato dopo la colorazione con blu di tripano per distinguere le cellule vive da quelle morte. Il volume di risospensione dipende dalla quantità di celle richiesta per gli esperimenti successivi. Questo rapporto aiuta a garantire un recupero e una vitalità cellulari ottimali durante le procedure successive.

3. Colorazione del cisplatino

1. Prelevare 3 x 10⁶ cellule dalle PBMC ottenute nella fase 1.7 e dalle cellule tumorali isolate nella fase 2.6, rispettivamente. Dopo il recupero delle cellule, risospenderle in 1 mL di PBS senza Ca²⁺ e Mg²⁺. Aggiungere il cisplatino a una concentrazione finale di 0,5 μM, mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
   NOTA: La colorazione con cisplatino viene eseguita per distinguere le cellule morte da quelle vive in base all'integrità della membrana. Le cellule morte con membrane compromesse assorbiranno il cisplatino e mostreranno un segnale positivo, mentre le cellule vive rimarranno non colorate²³. Il numero di celle deve essere almeno 1 x 10⁶.
2. Centrifugare le provette a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante, quindi aggiungere 1 mL di tampone per la colorazione cellulare a ciascuna provetta contenente le sospensioni cellulari preparate al punto 3.1 per arrestare la reazione. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e assicurarsi che il pellet cellulare non si distribuisca linearmente lungo la parete della provetta dopo la centrifugazione.

4. Blocco del recettore Fc

1. Preparare in anticipo una miscela di blocchi da 50 μl per ogni campione: combinare 48 μl di tampone di colorazione cellulare, quindi aggiungere 2 μl di soluzione bloccante Fc (tampone di colorazione cellulare: soluzione bloccante Fc = 9:1).
2. Sospendere le celle del passaggio 3.2 nella miscela di cui sopra e lasciarle riposare a temperatura ambiente per 10 minuti.

5. Incubazione di anticorpi proteici di membrana

1. Per ogni campione di cellule ottenuto dalla fase 4.2, preparare la miscela di anticorpi proteici di membrana aggiungendo 1,1 μl di unità di ciascun anticorpo. Quindi, aggiungere il tampone di colorazione cellulare per raggiungere un volume finale di 55 μl. A questo punto, il volume totale è di circa 100 μL.
   NOTA: Il mix include anticorpi mirati alle proteine chiave della membrana, come CD163, CCR3, CD141, CD117 e CD45^24,25. Questi anticorpi sono stati selezionati per la loro specificità nell'identificazione dei marcatori proteici di membrana e sono stati ottenuti da fonti disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli, inclusi i numeri di cloni, i produttori e i numeri di catalogo).
2. Aggiungere 50 μl della miscela di anticorpi preparata a ciascun campione di provetta, portare il volume totale a 100 μl. Agitare delicatamente i campioni e incubarli a temperatura ambiente per 15 minuti.
3. Aggiungere 2 mL di tampone di colorazione cellulare a ciascun campione, centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.
4. Scartare il surnatante e agitare brevemente il liquido rimanente con il pellet della cella per risospendere e disperdere completamente la cella.

6. Colorazione delle proteine del nucleo

1. Una volta che le cellule sono state completamente risospese, aggiungere 500 μl della soluzione miscelata (fissazione: fissazione/permeabilizzazione = 3:1) a ciascun campione dal passaggio 5.4. Mescolare delicatamente i campioni e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Diluire il tampone di permeabilizzazione (10x) con acqua deionizzata. Dopo l'incubazione, centrifugare a 500 g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Aggiungere 1000 μl di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascuna provetta per lavare le cellule. Centrifugare a temperatura ambiente a 1.000 x g per 5 minuti, quindi eliminare il surnatante.
3. Risospendere gli anticorpi in un tampone di permeabilizzazione 1x. Scartare il surnatante e aggiungere 50 μl della miscela di anticorpi a ciascuna provetta di cellule. Pipettare delicatamente le cellule per mescolarle, quindi incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti.
4. Aggiungere 1000 μl di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascuna provetta, centrifugare a temperatura ambiente a 1.000 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
5. Aggiungere 1000 μl di tampone di colorazione cellulare a ciascuna provetta per risospendere nuovamente le cellule, centrifugare a temperatura ambiente a 1.000 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.

7. Fissazione cellulare

1. Preparare una soluzione di formaldeide all'1,6% in PBS, con 1 mL necessario per campione.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione di formaldeide all'1,6% a ciascun campione dal passaggio 6.5, agitare per miscelare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
   NOTA: Sebbene la formaldeide sia comunemente utilizzata per la fissazione cellulare, è possibile utilizzare anche reagenti alternativi come la paraformaldeide al 4% (PFA) o il metanolo. La scelta del fissativo deve essere basata sui requisiti specifici dell'esperimento e sulle caratteristiche cellulari da osservare.
3. Centrifugare a temperatura ambiente a 800 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.

8. Colorazione per intercalazione nucleare

1. Preparare la soluzione di intercalazione cellulare: Diluire Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) con Fix e tampone di permeabilizzazione fino a una concentrazione finale di 125 nM. Preparare 1 mL di soluzione per campione.
2. Aggiungere 1 mL della soluzione di intercalazione cellulare preparata a ciascun campione fissato dal punto 7.3. Mescolare delicatamente e vorticare immediatamente. Questo aiuta a ridurre al minimo la formazione di aggregati cellulari.
3. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora o a 4°C per una notte. Centrifugare a 500 g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.

9. Preparazione della sospensione cellulare

1. Aggiungere 1000 μl di tampone di colorazione cellulare alla provetta dal passaggio 8.3 e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.
2. Aggiungere da 450 μl a 900 μl di acqua deionizzata per risospendere le cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule dopo la colorazione con blu di tripano. Dopo il conteggio, procedere con la raccolta dei dati e l'analisi mediante citometria di massa.

10. Citometria di massa e analisi dei dati

1. Acquisisci i dati della citometria di massa utilizzando un sistema CyTOF e salvali come file FCS (Flow Cytometry Standard). Garantire una corretta calibrazione dello strumento e un controllo di qualità per ridurre il rumore di fondo e gli effetti batch secondo le istruzioni del produttore.
2. Pre-processare la popolazione cellulare CD45⁺ nel file FCS utilizzando il software associato. Rimuovi i detriti in base alle dimensioni delle celle (diffusione diretta, FSC) e alla granularità (dispersione laterale, SSC). Escludi i doppietti mediante il gating sequenziale dei grafici FSC-A/FSC-H o SSC-A/SSC-H. Elimina le cellule morte utilizzando la colorazione di vitalità, come l'esclusione del cisplatino. Gate la popolazione CD45⁺ per concentrarsi sulle cellule immunitarie ed esportare la popolazione gated per ulteriori analisi.
3. Trasforma i dati con un cofattore di 5 e identifica i principali cluster utilizzando il software di clustering. Eseguire il clustering in base all'algoritmo SPADE (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events), che raggruppa le celle con profili di espressione dei marcatori simili in cluster²⁶. Utilizzare l'Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding (HSNE) per la riduzione della dimensionalità e l'identificazione di cluster distinti²⁶.
4. Eseguire il re-clustering dei cluster principali utilizzando il pacchetto cytofkit nel software R per il clustering non supervisionato. Identifica i sotto-cluster con PhenoGraph utilizzando i parametri predefiniti.
5. Applicare l'approssimazione e la proiezione uniforme del collettore (UMAP) per la riduzione della dimensionalità. Eseguire analisi statistiche utilizzando il test di Wilcoxon, considerando un valore P < 0,05 come statisticamente significativo. Visualizza i risultati utilizzando ggplot2.

Per chiarire le caratteristiche immunologiche associate all'HCC, è stata condotta un'analisi completa delle popolazioni di cellule immunitarie. I campioni di tessuto accoppiati di PBMC e HCC sono stati raccolti da 4 pazienti con HCC. La profilazione della citometria di massa è stata eseguita per esaminare le popolazioni di cellule immunitarie a livello proteomico di singola cellula, utilizzando due pannelli di anticorpi sia per PBMC che per campioni di tessuto HCC.

Dopo il controllo di qualità, 45.326 cellule sono state incluse nell'analisi di citometria di massa. L'algoritmo di clustering PhenoGraph, in combinazione con t-SNE, è stato impiegato per generare grafici bidimensionali e suddividere le cellule in fenotipi distinti. I principali sottogruppi di cellule immunitarie sono stati identificati in base a marcatori di lignaggio come CD3 (cellule T), CD4 (cellule T CD4⁺), CD8 (cellule T CD8⁺), CD56 (cellule NK), CD19 (cellule B) e CD14 (monociti)^27,28. I cluster di cellule immunitarie sono stati caratterizzati utilizzando tecnologie di citometria di massa.

Nei campioni di PBMC, come mostrato nella Figura 1A, sono stati identificati un totale di 14 tipi di cellule, tra cui cellule T CD4, cellule T CD8, cellule NK, cellule B, monociti, cellule T CD8 della memoria centrale (CD8Tcm), macrofagi, cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC), basofili, eosinofili, cellule T effettrici CD8 (CD8Teff), cellule dendritiche convenzionali CD141⁺ (CD141⁺ cDC), neutrofili e cellule dendritiche convenzionali CD1c⁺ (CD1c⁺ cDC). Il modello dettagliato di espressione dei marcatori per ciascun tipo di cellula è illustrato nella Figura 1B. Inoltre, la Figura 1C illustra la distribuzione di questi tipi di cellule all'interno di ciascun campione. Nei campioni di PBMC, sono state identificate proporzioni distinte di ciascun tipo di cellula. In particolare, il campione D ha mostrato una percentuale più elevata di cellule T CD4 rispetto agli altri campioni. I campioni A e B hanno mostrato un arricchimento significativo di cellule B. Inoltre, le cellule dendritiche convenzionali CD141⁺ (CD141⁺ cDC) sono state trovate prevalentemente nel campione C. Questi risultati evidenziano la distribuzione unica e l'abbondanza di specifici tipi di cellule in diversi campioni, fornendo informazioni sull'eterogeneità del panorama immunitario nell'HCC.

Allo stesso modo, nei campioni di tessuto, come mostrato nella Figura 2A, sono stati identificati 8 tipi di cellule, tra cui monociti, cellule T, neutrofili, cellule NK, cellule B, pDC, eosinofili e cellule dendritiche mieloidi (mDC). Il modello di espressione del marcatore per ciascun tipo di cellula è fornito nella Figura 2B e la Figura 2C rappresenta visivamente la distribuzione di questi tipi di cellule all'interno dei campioni. I campioni di tessuto hanno mostrato un modello coerente di proporzione del tipo di cellula in tutti i pazienti. Ciò suggerisce una caratteristica immunologica condivisa in termini di abbondanza relativa di questi tipi di cellule nell'HCC. La comprensione di questo modello coerente fornisce preziose informazioni sul panorama immunitario sottostante e sulle sue potenziali implicazioni per la patogenesi dell'HCC.

L'atlante delle cellule immunitarie costruito attraverso questa analisi offre preziose informazioni sul panorama immunitario dell'HCC, facendo luce sugli adattamenti cellulari e sistemici associati alla malattia.

Figura 1: Profilazione multi-omica dell'ecosistema PBMC. (A) I 14 cluster cellulari identificati da campioni di PBMC e illustrati su un grafico t-SNE. (B) Marcatori proteici per i cluster cellulari mostrati in (A). (C) Schema di distribuzione dei sottogruppi su 4 campioni sulla base dei dati della citometria di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Profilazione multi-omica dell'ecosistema tissutale HCC. (A) Gli 8 cluster cellulari identificati da campioni di tessuto HCC e illustrati su un grafico t-SNE. (B) Marcatori proteici per i cluster cellulari mostrati in (A). (C) Schema di distribuzione dei sottogruppi su 4 campioni sulla base dei dati della citometria di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio sfrutta la tecnologia della citometria di massa per fornire un'analisi approfondita delle risposte immunitarie sistemiche e locali nell'HCC. L'applicazione della citometria di massa in questo contesto consente la rilevazione simultanea di più marcatori a livello di singola cellula, offrendo una caratterizzazione immunofenotipica dettagliata che è fondamentale per comprendere il complesso panorama immunitario dell'HCC. La citometria di massa ha rivoluzionato gli studi immunologici facilitando l'analisi di singole cellule ad alta dimensionalità. Questa tecnica impiega tag di isotopi di metalli rari coniugati ad anticorpi, consentendo la misurazione simultanea di oltre 40 parametri in un'unica corsa. La capacità è particolarmente vantaggiosa nello studio dell'HCC, dove il microambiente tumorale (TME) è caratterizzato da un alto grado di eterogeneità cellulare e da intricate interazioni immunitarie^18,29.

Un vantaggio significativo della citometria di massa rispetto alla citometria a flusso tradizionale è la sua maggiore capacità di multiplexing. Mentre la citometria a flusso convenzionale è limitata dalle sovrapposizioni spettrali quando si utilizzano marcatori fluorescenti, la citometria di massa impiega isotopi metallici, che non soffrono di questo problema. Ciò consente il rilevamento simultaneo di un numero maggiore di marcatori senza la necessità di complessi algoritmi di compensazione³⁰. Questa capacità è essenziale nella ricerca sull'HCC, dove la profilazione di varie popolazioni di cellule immunitarie e dei loro stati è fondamentale per comprendere le interazioni tumore-sistema immunitario. La citometria di massa fornisce dati ad alta dimensione con risoluzione di una singola cellula, consentendo un'analisi completa delle cellule immunitarie all'interno della TME³¹. Questo livello di dettaglio è fondamentale per identificare le popolazioni di cellule rare e comprendere i loro ruoli nella progressione del tumore e nell'evasione immunitaria. Ad esempio, la citometria di massa può differenziare tra sottogruppi di cellule T, macrofagi e altre cellule immunitarie, fornendo informazioni sui loro stati funzionali e sulle interazioni all'interno del tumore¹⁸.

Una sequenza di passaggi critici nel protocollo garantisce l'affidabilità e la riproducibilità dei dati ottenuti. Durante la stratificazione del sangue sul liquido di separazione, un'aggiunta attenta e lenta è essenziale per mantenere l'integrità degli strati ed evitare la miscelazione, che è fondamentale per il successo dell'isolamento delle PBMC³². Allo stesso modo, la digestione enzimatica dei tessuti tumorali richiede un'attenta tempistica per bilanciare la dissociazione e la vitalità cellulare³³. Una corretta manipolazione durante queste fasi garantisce un elevato recupero e purezza delle PBMC e delle cellule tumorali, essenziale per la colorazione a valle e l'analisi della citometria di massa. Inoltre, il processo di colorazione del cisplatino svolge un ruolo fondamentale nel distinguere accuratamente le cellule vive da quelle morte; Un tempismo o una concentrazione impropri possono portare a risultati falsi positivi o falsi negativi, compromettendo la qualità dei dati³⁴. Inoltre, il blocco del recettore Fc riduce al minimo il legame con gli anticorpi non specifici, garantendo un'identificazione precisa dei marcatori della superficie cellulare, mentre le fasi di fissazione e permeabilizzazione devono essere attentamente controllate per preservare l'integrità cellulare e gli antigeni intracellulari fondamentali per risultati accurati della citometria di massa³⁵.

Le capacità di analisi ad alta dimensione della citometria di massa la rendono uno strumento inestimabile per la scoperta di biomarcatori nell'HCC. Profilando il panorama immunitario a livello di singola cellula, i ricercatori possono identificare potenziali biomarcatori associati alla progressione della malattia, alla risposta terapeutica e alla prognosi generale³⁶. Le distinte distribuzioni delle cellule immunitarie osservate tra PBMC e campioni di tessuto in questo studio forniscono informazioni critiche per la stratificazione dei pazienti. Ad esempio, i pazienti con livelli più elevati di cellule T effettrici CD8 possono rispondere meglio alle terapie che migliorano l'attività delle cellule T citotossiche, mentre quelli con livelli elevati di cellule immunosoppressori, come le Treg, possono beneficiare di terapie combinate per modulare efficacemente l'ambiente immunitario. Questo approccio stratificato potrebbe portare a strategie di trattamento più personalizzate ed efficaci per l'HCC.

La citometria di massa fornisce informazioni dettagliate sulle popolazioni di cellule immunitarie e sui loro stati funzionali all'interno del TME, contribuendo all'identificazione di potenziali bersagli per l'immunoterapia³⁷. Questi biomarcatori possono essere convalidati e utilizzati per sviluppare terapie mirate e strategie di trattamento personalizzate³⁰. L'identificazione di popolazioni cellulari immunosoppressori, come le Treg e le cellule soppressori di derivazione mieloide (MDSC) può informare lo sviluppo di terapie volte a modulare queste cellule per migliorare l'immunità antitumorale³⁸. La citometria di massa consente un profilo immunitario completo, essenziale per comprendere le complesse interazioni all'interno del TME³⁹. Ciò include la caratterizzazione della distribuzione spaziale delle cellule immunitarie, dei loro stati fenotipici e funzionali e delle loro interazioni con le cellule tumorali⁴⁰. Tale profilazione dettagliata può rivelare nuove intuizioni sui meccanismi di evasione e resistenza immunitaria, guidando lo sviluppo di terapie combinate che mirano a più percorsi.

La tecnologia della citometria di massa offre vantaggi significativi nell'analisi delle risposte immunitarie sistemiche e locali nell'HCC. Le sue capacità di multiplexing migliorate, l'elevata dimensionalità e la risoluzione di una singola cellula forniscono informazioni dettagliate sul panorama immunitario dell'HCC⁴¹. Sfruttando questi dati immunofenotipici dettagliati, i ricercatori possono ottenere una comprensione più profonda dei meccanismi di evasione immunitaria nell'HCC e sviluppare strategie immunoterapeutiche più efficaci per migliorare i risultati dei pazienti.

Nonostante i vantaggi della tecnologia della citometria di massa e la sua applicazione nella profilazione del panorama immunitario dell'HCC, presenta anche dei limiti. Il processo di isolamento e colorazione in più fasi può portare alla perdita cellulare, in particolare per le popolazioni di cellule immunitarie fragili. La fissazione può alterare il riconoscimento degli epitopi, influenzando potenzialmente l'accuratezza del rilevamento dei marcatori. Inoltre, l'analisi dei dati della citometria di massa è sensibile agli effetti batch, che potrebbero introdurre artefatti. Infine, la necessità di un numero sostanziale di cellule vitali limita l'applicabilità del protocollo a piccoli campioni tumorali⁴². Sono necessarie ottimizzazioni future per affrontare queste limitazioni e migliorare la robustezza della metodologia. L'integrazione dei dati della citometria di massa con altre tecniche ad alta dimensionalità negli studi futuri farà progredire ulteriormente la comprensione delle risposte immunitarie nell'HCC e guiderà lo sviluppo di terapie innovative.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (sovvenzione 2019YFA0803000 a J.S.), dall'Excellent Youth Foundation of Zhejiang Scientific (sovvenzione R22H1610037 a J.S.), dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzione 82173078 a J.S.), dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (sovvenzione 2022C03037 a J.S.).