Análisis por citometría de masas de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el carcinoma hepatocelular

Este protocolo describe un método de análisis integral de citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para evaluar las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el carcinoma hepatocelular (CHC). El enfoque tiene como objetivo proporcionar información sobre el panorama inmunitario del CHC, ofreciendo una comprensión más profunda del microambiente tumoral y los mecanismos inmunitarios asociados.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las formas más comunes y mortales de cáncer de hígado en todo el mundo. A pesar de los avances en el tratamiento, el pronóstico para los pacientes con CHC sigue siendo precario debido a la compleja interacción de factores genéticos, ambientales e inmunológicos que impulsan su progresión. Comprender el panorama inmunitario del CHC es crucial para desarrollar terapias eficaces, especialmente en el campo de la inmunoterapia, que es muy prometedora para mejorar los resultados de los pacientes. En este estudio se emplea la tecnología de citometría masiva (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para investigar las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en pacientes con CHC. Mediante el análisis de muestras de sangre periférica y tumores, la investigación tiene como objetivo identificar poblaciones únicas de células inmunitarias y sus estados funcionales asociados con la progresión del CHC. Los hallazgos proporcionan una visión completa del panorama inmunitario en el CHC, destacando los posibles biomarcadores y dianas terapéuticas. Este enfoque ofrece información valiosa sobre los mecanismos inmunitarios subyacentes al CHC y allana el camino para el desarrollo de inmunoterapias más eficaces para esta neoplasia maligna.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es el cáncer primario de hígado más común y un importante problema de salud mundial debido a sus altas tasas de incidencia y mortalidad¹. Según la Organización Mundial de la Salud, el CHC es el quinto cáncer más común y la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo². Es particularmente prevalente en regiones con altas tasas de infecciones crónicas por hepatitis B y C, como Asia Oriental y África Subsahariana³. Los principales factores de riesgo incluyen hepatitis viral, cirrosis y síndrome metabólico⁴. El CHC requiere un tratamiento a largo plazo, lo que impone cargas físicas y financieras sustanciales, lo que subraya la necesidad de una prevención eficaz, una detección precoz y estrategias de tratamiento innovadoras⁵.

El sistema inmunitario desempeña un papel crucial en el desarrollo del CHC. El hígado es un órgano inmunológicamente activo con una gran cantidad de células inmunitarias, incluidos los macrófagos residentes en el hígado, las células asesinas naturales (NK) y las células T, que son esenciales para monitorear y eliminar las células anormales⁶. Sin embargo, el CHC puede evadir la vigilancia inmunitaria mediante la expresión de moléculas inmunosupresoras, el reclutamiento de células inmunosupresoras y la alteración del microambiente tumoral ^7,8. Este escape inmune no solo promueve el crecimiento tumoral y la metástasis, sino que también afecta la respuesta a la inmunoterapia ^9,10.

Las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el microambiente tumoral son factores clave que influyen en la progresión del cáncer y los resultados terapéuticos. Las respuestas inmunitarias sistémicas involucran células inmunitarias circulantes que pueden reconocer y atacar a las células tumorales distantes, como las células T periféricas, las células NK y los monocitos que pueden atacar las células tumorales de todo el cuerpo. Las respuestas inmunitarias locales se centran en la actividad de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral, incluidos los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL), los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células T reguladoras (Treg). Mientras que los TIL a menudo ejercen efectos citotóxicos contra las células tumorales, los TAM y las Tregs suelen contribuir a un entorno inmunosupresor que favorece el crecimiento^{tumoral 11,12}. Las células tumorales y las células estromales pueden remodelar el microambiente tumoral para promover la inmunosupresión y evadir la vigilancia inmunitaria. La interacción entre las respuestas inmunitarias sistémicas y locales determina la eficacia global de la inmunidad antitumoral¹¹. Comprender esta interacción puede ayudar a desarrollar estrategias de inmunoterapia más efectivas.

La citometría de flujo y la inmunohistoquímica tradicionales, aunque se utilizan ampliamente en estudios inmunológicos, presentan limitaciones significativas cuando se trata de analizar paisajes inmunitarios complejos debido a su incapacidad para realizar análisis exhaustivos y de alta dimensión. La citometría de flujo es muy eficaz para detectar marcadores de superficie y funcionales a nivel de una sola célula; Sin embargo, su capacidad para el análisis simultáneo de múltiples marcadores es limitada, a menudo limitada por la superposición espectral y las restricciones prácticas en el número de etiquetas fluorescentes que se pueden utilizar^13,14. La inmunohistoquímica, por otro lado, proporciona información valiosa sobre el contexto tisular de marcadores específicos, pero se ve obstaculizada de manera similar por el número limitado de marcadores analizables y las dificultades inherentes para lograr evaluaciones sólidas, cuantitativas y de alta dimensión¹⁵.

Para caracterizar eficazmente los entornos inmunitarios complejos, son esenciales las técnicas de alta dimensión como la citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]). La citometría de masas es una tecnología avanzada que emplea la espectrometría de masas para analizar múltiples marcadores de proteínas en células individuales. Permite el análisis multiparamétrico de células individuales sin los problemas de superposición espectral que se observan en la citometría de flujo tradicional¹⁶. Mediante el uso de anticuerpos marcados con metal, puede medir docenas de marcadores simultáneamente, ofreciendo una visión completa e imparcial de los fenotipos y funciones celulares¹⁷. Por ejemplo, Gadalla et al. desarrollaron un panel CyTOF con más de 40 parámetros para el análisis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y tejido tumoral, demostrando su ventaja en el inmunofenotipado de alta dimensión¹⁸. La citometría de flujo tradicional, con su número limitado de parámetros detectables, no pudo identificar estas poblaciones celulares raras que exhibían fenotipos únicos. Por el contrario, la citometría de masas permitió una evaluación exhaustiva de los estados funcionales de estas células, proporcionando una caracterización más detallada y robusta. Behbehani et al. utilizaron la citometría masiva para analizar muestras de médula ósea de pacientes con síndromes mielodisplásicos (SMD), identificando y caracterizando con éxito células progenitoras hematopoyéticas aberrantes raras¹⁸. La capacidad de la citometría de masas para detectar simultáneamente más de 40 marcadores de superficie e intracelulares mejoró significativamente la detección de estos subconjuntos de células de baja frecuencia¹⁹. Estas capacidades superan las limitaciones tradicionales y proporcionan una visión más profunda del panorama inmunitario, lo que impulsa el progreso en inmunología y desarrollo terapéutico. La capacidad de perfilar de forma exhaustiva los fenotipos y las funciones celulares a nivel de una sola célula avanza en gran medida en la comprensión de los procesos inmunológicos y ayuda en el desarrollo de terapias dirigidas.

La citometría de masas proporciona información completa sobre las poblaciones de células inmunitarias sistémicas y locales en el CHC mediante la detección simultánea de múltiples marcadores proteicos. Esta tecnología puede distinguir entre varios tipos de células T dentro del microambiente tumoral, como las células T efectoras, las células T reguladoras (Tregs) y las células T agotadas, dilucidando sus funciones específicas en la progresión tumoral. Mediante el uso de la citometría de masas, los investigadores pueden identificar marcadores inmunitarios asociados con el pronóstico del CHC²⁰. Por ejemplo, los subconjuntos de linfocitos T con alta expresión de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) pueden servir como predictores de la respuesta de un paciente a los inhibidores de puntos de control inmunitario²¹. Además, facilita el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas mediante la identificación de moléculas inmunosupresoras específicas, proporcionando así una base para estrategias de tratamiento personalizadas. La capacidad de la tecnología para detectar múltiples marcadores y su resolución de una sola célula la hacen particularmente ventajosa para descubrir nuevas dianas terapéuticas y diseñar inmunoterapias combinadas. Este enfoque avanzado tiene un potencial significativo para mejorar los resultados del tratamiento en pacientes con CHC, ya que ofrece una comprensión detallada del panorama inmunitario y permite el desarrollo de intervenciones terapéuticas personalizadas.

Este estudio tiene como objetivo utilizar la citometría de masas para analizar los perfiles de células inmunitarias sistémicas y locales de pacientes con CHC. Los objetivos son caracterizar las poblaciones de células inmunitarias, correlacionar estas características con los resultados clínicos y las respuestas terapéuticas, e identificar marcadores inmunitarios específicos y subconjuntos celulares asociados con el pronóstico del CHC. Al dilucidar el papel de varias células inmunitarias en las respuestas al tratamiento, este estudio busca proporcionar una base para estrategias de tratamiento personalizadas. Se espera que los hallazgos optimicen las inmunoterapias existentes y ofrezcan información valiosa para el desarrollo de nuevos tratamientos, con el objetivo final de mejorar la supervivencia general y la calidad de vida de los pacientes con CHC.

En el siguiente plan se describen los pasos para la recolección de muestras de sangre y CHC, el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la disociación de células individuales y la tinción. Los reactivos y materiales experimentales se enumeran en la Tabla de Materiales. Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, asegurando que la recolección de muestras tumorales no interfiriera con el diagnóstico patológico. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos humanos.

1. Aislamiento de las PBMC

1. Extraiga una muestra de sangre de la vena de los pacientes con CHC y use un tubo lleno de un anticoagulante para evitar que la sangre se coagule. Se obtuvieron muestras de sangre de 4 pacientes (2 hombres y 2 mujeres) con edades comprendidas entre los 50 y los 60 años, con una edad media de 55 años. Para cada paciente, recoja de 10 a 20 ml de sangre periférica para garantizar un volumen suficiente para el aislamiento posterior de las PBMC y minimizar las molestias del paciente.
2. Extraiga un volumen específico de sangre (por ejemplo, 6 mL) y agregue un volumen igual de líquido de separación de linfocitos de sangre periférica (Ficol-paque o Lymphoprep) a un tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: Lo ideal es que el volumen total no supere los 12 ml para dejar espacio para una mezcla adecuada y evitar el desbordamiento; el volumen máximo recomendado para un tubo de centrífuga de 15 mL es de 14 mL.
3. Incline el tubo de centrífuga a 45 ° y agregue lentamente la sangre a lo largo de la pared del tubo, colocando con cuidado la sangre lentamente sobre el líquido de separación de linfocitos de sangre periférica para evitar mezclar las dos capas.
   NOTA: Se puede usar una pipeta para agregar sangre lentamente a lo largo de la pared del tubo.
4. Coloque el tubo de centrífuga en la centrífuga y ajuste la aceleración a 8 y la desaceleración a 3. Centrifugar a 450 x g, 4 °C, durante 30 min. Después de la centrifugación, se forman 4 capas en el tubo de ensayo, de arriba a abajo: capa de plasma, capa de PBMCs (capa de membrana blanca), capa de Ficol-Paque y capa de glóbulos rojos y granulocitos.
5. Con una pipeta, recoja cuidadosamente la capa de PBMC en un nuevo tubo de centrífuga estéril. Añadir 3 veces el volumen de PBS y centrifugar a 500 x g a 4°C durante 5 min. Después de la centrifugación, se forma un pellet en el fondo del tubo.
6. Deseche el sobrenadante con una pipeta, agregue 1 mL de solución salina tamponada con suero bovino fetal y fosfato al 2% (FBS-PBS) para resuspender las células y luego agregue 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC). Centrifugar a 500 x g a 4°C durante 5 min.
7. Asegúrese de que no haya glóbulos rojos en el fondo del tubo, lo que indica que los glóbulos rojos se han lisado por completo. Vuelva a suspender las células en FBS-PBS al 2% y proceda directamente con los experimentos posteriores, o agregue la solución de criopreservación celular y almacene a -80 ° C durante 2-3 meses.
   NOTA: Como pauta general, para la resuspensión, use 0.5 mL de FBS-PBS al 2% por 1 x 10⁶ celdas. El recuento de células se determina utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripán para distinguir las células vivas de las células muertas. Esta relación ayuda a garantizar una recuperación celular óptima y la viabilidad durante los procedimientos posteriores.

2. Aislamiento de células de tejido tumoral

NOTA: El método para el aislamiento de células de tejido tumoral fue adaptado de Song et ^al.22.

1. Después de resecar el CHC, guiado por un patólogo, se usa un bisturí estéril para extirpar una parte del tejido tumoral. El bloque de tejido debe tener un tamaño aproximado de 1 cm³ . Enjuague cualquier mancha superficial con 1x PBS preenfriado. Sumerja el tejido en un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga aproximadamente 5 mL de medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS. Coloque el tubo en hielo y transpórtelo de regreso al laboratorio para su posterior procesamiento.
2. Enjuague bien las manchas de sangre y elimine manualmente el tejido conectivo graso con pinzas para garantizar una limpieza completa del tejido con FBS-PBS preenfriado al 2%. Transfiera el tejido a una placa tratada con cultivo de tejidos que contenga una solución de digestión. Asegure el tejido tumoral con pinzas y córtelo en pedazos de menos de 1^mm3 con un bisturí. Transfiera la solución de digestión de tejidos a un tubo centrífugo de 50 ml, agregando más solución de digestión de tejidos hasta que el volumen total sea de aproximadamente 15 ml.
3. Coloque el tubo de centrífuga que contiene la mezcla de digestión de tejidos en un agitador. Inclínalo o aplánalo y asegúralo para la digestión a 150 rpm y 37 °C durante 1 h. Filtrar la solución de digestión a través de un filtro de 70 μm.
   1. Durante este procedimiento, use un émbolo de jeringa de 1 ml para moler los fragmentos de tejido. Enjuague el filtro con una solución FBS-1640 al 2%. Tome el filtrado y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL.
4. Centrifugar el filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 ^°C. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet en aproximadamente 10 ml de solución de Percoll al 36%. A continuación, vuelva a centrifugarlo a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspire suavemente 1 ml de tampón de lisis de RBC con una pipeta para resuspender la suspensión celular. Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL y agregue el tampón de lisis RBC para alcanzar un volumen total de 10 mL. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   NOTA: Se utiliza un nuevo tubo de centrífuga para evitar que las impurezas de la pared del tubo vuelvan a entrar en la suspensión celular, reduciendo así el riesgo de disminución del rendimiento celular.
6. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C, luego resuspender las celdas en un volumen apropiado de 2% FBS-PBS. Como pauta general, use 0.5 mL de FBS-PBS al 2% por 1 x 10⁶ celdas para la resuspensión.
   NOTA: El recuento de células se determina mediante el uso de un hemocitómetro o un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripán para distinguir las células vivas de las células muertas. El volumen de resuspensión depende de la cantidad de celda requerida para experimentos posteriores. Esta relación ayuda a garantizar una recuperación celular óptima y la viabilidad durante los procedimientos posteriores.

3. Tinción de cisplatino

1. Tome 3 x 10⁶ células de las PBMC obtenidas en el paso 1.7 y las células tumorales aisladas en el paso 2.6, respectivamente. Después de la recuperación celular, resuspenderlas en 1 mL de PBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺. Agregue cisplatino hasta una concentración final de 0,5 μM, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 2 minutos.
   NOTA: La tinción con cisplatino se realiza para distinguir las células muertas de las células vivas en función de la integridad de la membrana. Las células muertas con membranas comprometidas absorberán cisplatino y mostrarán una señal positiva, mientras que las células vivas permanecerán sin teñir²³. El número de celdas debe ser al menos 1 x 10⁶.
2. Centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y, a continuación, añadir 1 mL de tampón de tinción celular a cada tubo que contenga las suspensiones celulares preparadas en el paso 3.1 para detener la reacción. Centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y asegurarse de que el pellet de la celda no se distribuya linealmente a lo largo de la pared del tubo después de la centrifugación.

4. Bloqueo del receptor Fc

1. Prepare una mezcla de bloques de 50 μL con antelación para cada muestra: Combine 48 μL de tampón de tinción celular, luego agregue 2 μL de solución de bloqueo de Fc (tampón de tinción celular: solución de bloqueo de Fc = 9:1).
2. Suspenda las celdas del paso 3.2 en la mezcla anterior y déjelas reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

5. Incubación de anticuerpos contra proteínas de membrana

1. Para cada muestra de célula obtenida en el paso 4.2, prepare la mezcla de anticuerpos de proteínas de membrana añadiendo 1,1 μL de unidades de cada anticuerpo. A continuación, añada un tampón de tinción celular para alcanzar un volumen final de 55 μL. En este punto, el volumen total es de aproximadamente 100 μL.
   NOTA: La mezcla incluye anticuerpos dirigidos a proteínas clave de membrana, como CD163, CCR3, CD141, CD117 y CD45^24,25. Estos anticuerpos se seleccionaron por su especificidad en la identificación de marcadores de proteínas de membrana y se obtuvieron de fuentes disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles, incluidos los números de clones, los fabricantes y los números de catálogo).
2. Agregue 50 μL de mezcla de anticuerpos preparada a cada muestra de tubo, lleve el volumen total a 100 μL. Agite suavemente las muestras e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
3. Agregue 2 mL de tampón de tinción celular a cada muestra, centrifugue a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.
4. Deseche el sobrenadante y haga un vórtice breve con el líquido restante con el pellet de la célula para resuspender y dispersar completamente la célula.

6. Tinción de proteínas del núcleo

1. Una vez que las células se hayan resuspendido completamente, añadir 500 μL de la solución mezclada (fijación: fijación/permeabilización = 3:1) a cada muestra del paso 5.4. Mezcle suavemente las muestras e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Diluir el tampón de permeabilización (10x) con agua desionizada. Después de la incubación, centrifugar a 500 g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Añadir 1000 μL de tampón de permeabilización 1x a cada tubo para lavar las células. Centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min, luego desechar el sobrenadante.
3. Resuspender anticuerpos en tampón de permeabilización 1x. Deseche el sobrenadante y agregue 50 μL de la mezcla de anticuerpos a cada tubo de células. Pipetear suavemente las células para mezclar, luego incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min.
4. Añadir 1000 μL de tampón de permeabilización 1x a cada tubo, centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
5. Añadir 1000 μL de tampón de tinción celular a cada tubo para volver a suspender las células, centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.

7. Fijación celular

1. Prepare una solución de formaldehído al 1,6% en PBS, con 1 mL necesario por muestra.
2. Agregue 1 mL de solución de formaldehído al 1.6% a cada muestra del paso 6.5, vórtice para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 10 min.
   NOTA: Si bien el formaldehído se usa comúnmente para la fijación celular, también se pueden usar reactivos alternativos como el paraformaldehído (PFA) al 4% o el metanol. La elección del fijador debe basarse en los requisitos específicos del experimento y en las características celulares que se van a observar.
3. Centrifugar a temperatura ambiente a 800 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.

8. Tinción de intercalación nuclear

1. Prepare la solución de intercalación celular: Diluya Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) con Fix y tampón de permeabilización hasta una concentración final de 125 nM. Prepare 1 mL de la solución por muestra.
2. Añadir 1 mL de la solución de intercalación celular preparada a cada muestra fija del paso 7.3. Mezcle suavemente y en vórtice inmediatamente. Esto ayuda a minimizar la formación de agregados celulares.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 °C durante la noche. Centrifugar a 500 g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.

9. Preparación de la suspensión celular

1. Añadir 1000 μL de tampón de tinción celular al tubo desde el paso 8.3 y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.
2. Añadir 450 μL a 900 μL de agua desionizada para resuspender las células. Cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripano. Después del recuento, proceda con la recopilación y el análisis de datos mediante citometría de masas.

10. Citometría de masas y análisis de datos

1. Adquiera datos de citometría de masas utilizando un sistema CyTOF y guárdelos como archivos de citometría de flujo estándar (FCS). Garantice la calibración adecuada del instrumento y el control de calidad para reducir el ruido de fondo y los efectos de lote según las instrucciones del fabricante.
2. Preprocese la población de células CD45⁺ en el archivo FCS utilizando el software asociado. Elimine los residuos en función del tamaño de la celda (dispersión directa, FSC) y la granularidad (dispersión lateral, SSC). Excluya los dobletes por compuerta secuencial de las parcelas FSC-A/FSC-H o SSC-A/SSC-H. Elimine las células muertas mediante la tinción de viabilidad, como la exclusión de cisplatino. Controlar la población CD45⁺ para centrarse en las células inmunitarias y exportar la población controlada para su posterior análisis.
3. Transforme los datos con un cofactor de 5 e identifique los principales clústeres utilizando el software de agrupación. Realice la agrupación en clústeres basada en el algoritmo SPADE, análisis de progresión de eventos normalizados por densidad (SPADE), que agrupa las celdas con perfiles de expresión de marcadores similares en grupos²⁶. Utilice la incrustación de vecinos estocásticos jerárquicos (HSNE) para la reducción de la dimensionalidad y la identificación de grupos distintos²⁶.
4. Realice la reagrupación de los clústeres principales utilizando el paquete cytofkit en el software R para la agrupación en clústeres no supervisada. Identifique los subclústeres con PhenoGraph utilizando los parámetros predeterminados.
5. Aplique la aproximación y proyección uniforme de la variedad (UMAP) para la reducción de la dimensionalidad. Realizar análisis estadísticos mediante la prueba de Wilcoxon, considerando como estadísticamente significativo un valor de P < 0,05. Visualiza los resultados usando ggplot2.

Para dilucidar las características inmunológicas asociadas con el CHC, se realizó un análisis exhaustivo de las poblaciones de células inmunitarias. Se recolectaron muestras pareadas de PBMC y tejido de CHC de 4 pacientes con CHC. Se realizó un perfil de citometría masiva para examinar las poblaciones de células inmunitarias a nivel proteómico de una sola célula, utilizando dos paneles de anticuerpos para muestras de tejido de PBMC y CHC.

Después del control de calidad, se incluyeron 45.326 células en el análisis de citometría de masas. Se empleó el algoritmo de agrupamiento PhenoGraph, junto con t-SNE, para generar gráficos bidimensionales y dividir las células en distintos fenotipos. Los principales subconjuntos de células inmunitarias se identificaron a partir de marcadores de linaje como CD3 (células T), CD4 (células T CD4⁺), CD8 (células T CD8⁺), CD56 (células NK), CD19 (células B) y CD14 (monocitos)^27,28. Los grupos de células inmunitarias se caracterizaron mediante tecnologías de citometría de masas.

En las muestras de PBMC, como se muestra en la Figura 1A, se identificaron un total de 14 tipos de células, incluidas las células T CD4, las células T CD8, las células NK, las células B, los monocitos, las células T CD8 de memoria central (CD8Tcm), los macrófagos, las células dendríticas plasmocitoides (pDC), los basófilos, los eosinófilos, los linfocitos T CD8 efectores (CD8Teff), las células dendríticas convencionales CD141⁺ (CD141⁺ cDC), los neutrófilos y las células dendríticas convencionales CD1c⁺ (CD1c⁺ cDCs). En la Figura 1B se muestra el patrón de expresión de marcador detallado para cada tipo de célula. Además, la Figura 1C ilustra la distribución de estos tipos de células dentro de cada muestra. En las muestras de PBMC, se identificaron distintas proporciones de cada tipo de célula. En particular, la muestra D mostró una mayor proporción de células T CD4 en comparación con las otras muestras. Las muestras A y B mostraron un enriquecimiento significativo de células B. Además, las células dendríticas convencionales CD141⁺ (CD141⁺ cDCs) se encontraron predominantemente en la muestra C. Estos hallazgos ponen de manifiesto la distribución y abundancia únicas de tipos específicos de células en diferentes muestras, lo que proporciona información sobre la heterogeneidad del panorama inmunitario en el CHC.

De manera similar, en muestras de tejido, como se muestra en la Figura 2A, se identificaron 8 tipos de células, incluidos monocitos, células T, neutrófilos, células NK, células B, pDC, eosinófilos y células dendríticas mieloides (mDC). El patrón de expresión de marcadores para cada tipo de célula se proporciona en la Figura 2B y la Figura 2C representa visualmente la distribución de estos tipos de células dentro de las muestras. Las muestras de tejido mostraron un patrón consistente de proporción de tipo de célula en todos los pacientes. Esto sugiere una característica inmunológica compartida en términos de la abundancia relativa de estos tipos de células en el CHC. La comprensión de este patrón coherente proporciona información valiosa sobre el panorama inmunitario subyacente y sus posibles implicaciones para la patogénesis del CHC.

El atlas de células inmunitarias construido a través de este análisis ofrece información valiosa sobre el panorama inmunitario del CHC, arrojando luz sobre las adaptaciones celulares y sistémicas asociadas con la enfermedad.

Figura 1: Perfil multiómico del ecosistema de PBMC. (A) Los 14 grupos de células identificados a partir de muestras de PBMCs e ilustrados en un gráfico t-SNE. (B) Marcadores de proteínas para los grupos de células mostrados en (A). (C) Patrón de distribución de los subconjuntos en 4 muestras basado en datos de citometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Perfil multiómico del ecosistema de tejido HCC. (A) Los 8 grupos de células identificados a partir de muestras de tejido HCC e ilustrados en un gráfico t-SNE. (B) Marcadores de proteínas para los grupos de células mostrados en (A). (C) Patrón de distribución de los subconjuntos en 4 muestras basado en datos de citometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este estudio aprovecha la tecnología de citometría masiva para proporcionar un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el CHC. La aplicación de la citometría de masas en este contexto permite la detección simultánea de múltiples marcadores a nivel de una sola célula, lo que ofrece una caracterización inmunofenotípica detallada que es crucial para comprender el complejo panorama inmunitario del CHC. La citometría de masas ha revolucionado los estudios inmunológicos al facilitar el análisis de células individuales de alta dimensión. Esta técnica emplea etiquetas de isótopos de metales raros conjugadas con anticuerpos, lo que permite la medición simultánea de más de 40 parámetros en una sola ejecución. La capacidad es particularmente ventajosa en el estudio del CHC, donde el microambiente tumoral (TME) se caracteriza por un alto grado de heterogeneidad celular e intrincadas interacciones inmunes^18,29.

Una ventaja significativa de la citometría de masas sobre la citometría de flujo tradicional es su capacidad de multiplexación mejorada. Mientras que la citometría de flujo convencional está limitada por superposiciones espectrales cuando se utilizan marcadores fluorescentes, la citometría de masas emplea isótopos metálicos, que no sufren este problema. Esto permite la detección simultánea de un mayor número de marcadores sin necesidad de complejos algoritmos de compensación³⁰. Esta capacidad es esencial en la investigación del CHC, donde el perfil de varias poblaciones de células inmunitarias y sus estados es fundamental para comprender las interacciones entre el tumor y el sistema inmunitario. La citometría de masas proporciona datos de alta dimensión con una resolución de una sola célula, lo que permite un análisis exhaustivo de las células inmunitarias dentro del TME³¹. Este nivel de detalle es crucial para identificar poblaciones de células raras y comprender sus funciones en la progresión tumoral y la evasión inmunitaria. Por ejemplo, la citometría de masas puede diferenciar entre subconjuntos de células T, macrófagos y otras células inmunitarias, proporcionando información sobre sus estados funcionales e interacciones dentro del tumor¹⁸.

Una secuencia de pasos críticos en el protocolo garantiza la fiabilidad y reproducibilidad de los datos obtenidos. Durante la estratificación de la sangre sobre el líquido de separación, la adición cuidadosa y lenta es esencial para mantener la integridad de las capas y evitar la mezcla, lo cual es crucial para el aislamiento exitoso de las PBMC³². De manera similar, la digestión enzimática de los tejidos tumorales requiere un tiempo cuidadoso para equilibrar la disociación y la viabilidad celular³³. El manejo adecuado durante estas etapas garantiza una alta recuperación y pureza de las PBMC y las células tumorales, lo cual es esencial para la tinción posterior y el análisis de citometría de masas. Además, el proceso de tinción con cisplatino desempeña un papel fundamental en la distinción precisa de las células vivas de las muertas; Una sincronización o concentración inadecuadas puede dar lugar a resultados falsos positivos o falsos negativos, lo que repercute en la calidad de los datos³⁴. Además, el bloqueo del receptor Fc minimiza la unión inespecífica de anticuerpos, lo que garantiza una identificación precisa de los marcadores de la superficie celular, mientras que los pasos de fijación y permeabilización deben controlarse cuidadosamente para preservar la integridad celular y los antígenos intracelulares críticos para obtener resultados precisos de citometría de masas³⁵.

Las capacidades de análisis de alta dimensión de la citometría de masas la convierten en una herramienta invaluable para el descubrimiento de biomarcadores en el CHC. Al perfilar el panorama inmunitario a nivel de una sola célula, los investigadores pueden identificar posibles biomarcadores asociados con la progresión de la enfermedad, la respuesta terapéutica y el pronóstico general³⁶. Las distintas distribuciones de células inmunitarias observadas en PBMC y muestras de tejido en este estudio proporcionan información crítica para la estratificación de los pacientes. Por ejemplo, los pacientes con niveles más altos de células T CD8 efectoras pueden responder mejor a las terapias que mejoran la actividad de las células T citotóxicas, mientras que aquellos con niveles elevados de células inmunosupresoras, como las Tregs, pueden beneficiarse de las terapias combinadas para modular eficazmente el entorno inmunitario. Este enfoque estratificado podría conducir a estrategias de tratamiento más personalizadas y eficaces para el CHC.

La citometría de masas proporciona información detallada sobre las poblaciones de células inmunitarias y sus estados funcionales dentro del TME, lo que se suma a la identificación de posibles objetivos para la inmunoterapia³⁷. Estos biomarcadores pueden ser validados y utilizados para desarrollar terapias dirigidas y estrategias de tratamiento personalizadas³⁰. La identificación de poblaciones de células inmunosupresoras, como las Tregs y las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), puede informar el desarrollo de terapias destinadas a modular estas células para mejorar la inmunidad antitumoral³⁸. La citometría de masas permite un perfil inmunitario completo, que es esencial para comprender las complejas interacciones dentro del TME³⁹. Esto incluye la caracterización de la distribución espacial de las células inmunitarias, sus estados fenotípicos y funcionales, y sus interacciones con las células tumorales⁴⁰. Este perfil detallado puede revelar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de evasión inmunitaria y resistencia, lo que guía el desarrollo de terapias combinadas que se dirigen a múltiples vías.

La tecnología de citometría de masas ofrece ventajas significativas en el análisis de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el CHC. Sus capacidades de multiplexación mejoradas, su alta dimensionalidad y su resolución de una sola célula proporcionan información detallada sobre el panorama inmunitario de HCC⁴¹. Al aprovechar estos datos inmunofenotípicos detallados, los investigadores pueden obtener una comprensión más profunda de los mecanismos de evasión inmunitaria en el CHC y desarrollar estrategias inmunoterapéuticas más eficaces para mejorar los resultados de los pacientes.

A pesar de las ventajas de la tecnología de citometría de masas y su aplicación en el perfil del panorama inmunitario del CHC, también tiene limitaciones. El proceso de aislamiento y tinción de varios pasos puede provocar la pérdida de células, especialmente en el caso de las poblaciones de células inmunitarias frágiles. La fijación puede alterar el reconocimiento de epítopos, lo que puede afectar a la precisión de la detección de marcadores. Además, el análisis de datos de citometría de masas es sensible a los efectos de lotes, que podrían introducir artefactos. Por último, la necesidad de un número sustancial de células viables limita la aplicabilidad del protocolo a muestras tumorales pequeñas⁴². Se necesitan optimizaciones futuras para abordar estas limitaciones y mejorar la solidez de la metodología. La integración de los datos de citometría de masas con otras técnicas de alta dimensión en estudios futuros permitirá avanzar aún más en la comprensión de las respuestas inmunitarias en el CHC y guiar el desarrollo de terapias innovadoras.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (subvención 2019YFA0803000 a J.S.), la Fundación Juvenil Excelente de Zhejiang Scientific (subvención R22H1610037 a J.S.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención 82173078 a J.S.), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención 2022C03037 a J.S.).