肝細胞癌における全身および局所免疫応答のマスサイトメトリー解析

このプロトコルは、肝細胞がん(HCC)における全身免疫応答と局所免疫応答の両方を評価するための包括的なマスサイトメトリー(飛行時間型[CyTOF]によるサイトメトリー)分析法の概要を示しています。このアプローチは、HCCの免疫ランドスケープに関する洞察を提供し、腫瘍微小環境と関連する免疫メカニズムをより深く理解することを目的としています。

肝細胞がん(HCC)は、世界で最も一般的で致命的な肝臓がんの1つです。治療の進歩にもかかわらず、HCC患者の予後は、その進行を促進する遺伝的、環境的、および免疫学的要因の複雑な相互作用のために、依然として不良です。HCCの免疫状況を理解することは、特に患者の転帰を改善することが大きな期待が寄せられている免疫療法の分野で、効果的な治療法を開発するために非常に重要です。この研究では、マスサイトメトリー (Time-of-Flight [CyTOF] によるサイトメトリー) 技術を使用して、HCC 患者の全身免疫応答と局所免疫応答の両方を調査します。末梢血と腫瘍のサンプルを分析することにより、この研究は、HCCの進行に関連するユニークな免疫細胞集団とそれらの機能状態を特定することを目的としています。この知見は、HCCの免疫状況を包括的に概観し、潜在的なバイオマーカーと治療標的を強調しています。このアプローチは、HCCの根底にある免疫メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、この悪性腫瘍に対するより効果的な免疫療法の開発への道を開きます。

肝細胞がん(HCC)は、最も一般的な原発性肝がんであり、その高い発生率と死亡率により、世界的に重大な健康問題となっています¹。世界保健機関(WHO)によると、HCCは世界で5番目に多いがんであり、がん関連死の原因として2番目に多いとされています²。特に、東アジアやサハラ以南のアフリカなど、慢性B型肝炎およびC型肝炎の感染率が高い地域で蔓延しています³。主な危険因子には、ウイルス性肝炎、肝硬変、メタボリックシンドローム^{などがあります4}。HCCは長期にわたる治療を必要とし、身体的および財政的に大きな負担を強い、効果的な予防、早期発見、革新的な治療戦略の必要性を強調しています⁵。

免疫系はHCCの発症に重要な役割を果たします。肝臓は免疫活性な臓器であり、肝臓に常在するマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞などの免疫細胞が豊富に存在し、異常細胞のモニタリングや排除に不可欠です⁶。しかし、HCCは、免疫抑制分子を発現し、免疫抑制細胞を動員し、腫瘍微^小環境を変化させることにより、免疫監視を回避することができる^7,8。この免疫回避は、腫瘍の成長と転移を促進するだけでなく、免疫療法への反応にも影響を与えます^9,10。

腫瘍微小環境における全身性および局所的な免疫応答は、がんの進行と治療結果に影響を与える重要な要因です。全身性免疫応答には、末梢T細胞、NK細胞、全身の腫瘍細胞を標的とすることができる単球など、離れた腫瘍細胞を認識して攻撃できる循環免疫細胞が含まれます。局所免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、腫瘍関連マクロファージ(TAM)、制御性T細胞(Treg)など、腫瘍微小環境内の免疫細胞活性に焦点を当てています。TILはしばしば腫瘍細胞に対して細胞傷害性効果を発揮するが、TAMおよびTregは通常、腫瘍増殖を支える免疫抑制環境に寄与する^11,12。腫瘍細胞と間質細胞は、腫瘍の微小環境を再形成して免疫抑制を促進し、免疫監視を回避することができます。全身免疫応答と局所免疫応答との間の相互作用は、抗腫瘍免疫の全体的な有効性を決定する¹¹。この相互作用を理解することは、より効果的な免疫療法戦略の開発に役立ちます。

従来のフローサイトメトリーや免疫組織化学は、免疫学研究で広く使用されていますが、複雑な免疫ランドスケープの解析には大きな限界があり、包括的で高次元な解析を行うことができませんでした。フローサイトメトリーは、シングルセルレベルでの表面マーカーと機能マーカーの検出に非常に効果的です。しかし、同時マルチマーカー解析の能力は制限されており、スペクトルのオーバーラップや、使用できる蛍光タグの数に対する現実的な制約によってしばしば制限される^13,14。一方、免疫組織化学は、特定のマーカーの組織状況に関する貴重な洞察を提供しますが、分析可能なマーカーの数が限られていることや、頑健で定量的な高次元評価を達成することの本質的な困難さによって同様に妨げられています¹⁵。

複雑な免疫環境を効果的に特徴付けるには、マスサイトメトリー(Time-of-Flight(CyTOF)によるサイトメトリー)のような高次元の技術が不可欠です。マスサイトメトリーは、質量分析を用いて単一細胞内の複数のタンパク質マーカーを解析する先進技術です。これにより、従来のフローサイトメト^リー16で見られたスペクトルの重複の問題なしに、個々の細胞のマルチパラメトリック解析が可能になります。金属タグ付き抗体を用いることで、数十のマーカーを同時に測定することができ、細胞の表現型や機能を包括的かつ偏りなく観察することができます¹⁷。例えば、Gadallaらは、末梢血単核細胞(PBMC)および腫瘍組織の解析のために40以上のパラメータを有するCyTOFパネルを開発し、高次元の免疫表現型決定におけるその利点を実証した¹⁸。従来のフローサイトメトリーでは、検出可能なパラメータの数が限られていたため、ユニークな表現型を示すこれらの希少な細胞集団を同定することができませんでした。対照的に、マスサイトメトリーでは、これらの細胞の機能状態を包括的に評価することができ、より詳細で堅牢な特性評価が可能になりました。Behbehaniらは、骨髄異形成症候群(MDS)患者の骨髄サンプルを解析するためにマスサイトメトリーを利用し、まれな異常な造血前駆細胞を同定し、特徴付けることに成功しました¹⁸。40を超える表面マーカーおよび細胞内マーカーを同時に検出するマスサイトメトリーの能力は、これらの低頻度の細胞サブセットの検出を有意に強化した¹⁹。これらの能力は、従来の限界を克服し、免疫ランドスケープに関するより深い洞察を提供し、免疫学と治療法開発の進歩を促進します。細胞の表現型と機能をシングルセルレベルで包括的にプロファイリングする能力は、免疫学的プロセスの理解を大きく前進させ、標的療法の開発に役立ちます。

マスサイトメトリーは、複数のタンパク質マーカーを同時に検出することにより、HCCの全身および局所免疫細胞集団に関する包括的な洞察を提供します。この技術により、腫瘍微小環境中のエフェクターT細胞、制御性T細胞(Treg)、消耗T細胞など、さまざまな種類のT細胞を区別し、腫瘍の進行におけるそれらの特異的な役割を解明することができます。マスサイトメトリーを利用することで、研究者はHCCの予後に関連する免疫マーカーを特定できます²⁰。例えば、Programmed Cell Death Protein 1(PD-1)の発現が高いT細胞サブセットは、免疫チェックポイント阻害剤に対する患者の反応の予測因子として役立つことができる²¹。さらに、特定の免疫抑制分子を同定することで新たな治療標的の発見を促進し、個別化治療戦略の基盤を提供します。このテクノロジーは、複数のマーカーを検出する能力と単一細胞の分解能により、新規治療標的の発見や併用免疫療法の設計に特に有利です。この先進的なアプローチは、免疫の状況を詳細に理解し、カスタマイズされた治療介入の開発を可能にすることで、HCC患者の治療転帰を改善する大きな可能性を秘めています。

この研究は、質量サイトメトリーを利用して、HCC患者の全身および局所免疫細胞プロファイルを分析することを目的としています。その目的は、免疫細胞集団を特徴付け、これらの特性を臨床転帰や治療反応と相関させ、HCCの予後に関連する特定の免疫マーカーと細胞サブセットを特定することです。本研究では、治療応答における様々な免疫細胞の役割を解明することで、個別化治療戦略の基盤を提供することを目指しています。この知見は、既存の免疫療法を最適化し、新しい治療法を開発するための貴重な洞察を提供し、最終的にはHCC患者の全生存期間と生活の質を向上させることを目指すと期待されています。

血液およびHCCサンプルの収集、末梢血単核細胞(PBMC)の単離、単一細胞解離、および染色のステップを次の計画に概説します。実験試薬と材料はすべて材料表に記載されています。すべての実験は、浙江大学医学部第一関連病院の倫理委員会の承認を得て実施され、腫瘍サンプルの収集が病理学的診断を妨げないことを確認しました。書面によるインフォームドコンセントは、すべての被験者から得られました。

1. PBMCの分離

1. HCC患者の静脈から血液サンプルを採取し、抗凝固剤で満たされたチューブを使用して血液が凝固するのを防ぎます。血液サンプルは、平均年齢55歳の50〜60歳の4人の患者(男性2人、女性2人)から採取されました。各患者について、10〜20 mLの末梢血を採取して、患者の不快感を最小限に抑えながら、その後のPBMCの分離に十分な量を確保します。
2. 特定の量の血液を採取し(例:.、6 mL)、等量の末梢血リンパ球分離液(Ficol-paqueまたはLymphoprep)を15 mLの遠心チューブに加えます。.
   注:総容量は、適切な混合のためのスペースを確保し、オーバーフローを防ぐために、理想的には12 mLを超えないようにする必要があります。15 mL遠心チューブの最大推奨容量は14 mLです。
3. 遠心分離管を45°に傾け、チューブの壁に沿ってゆっくりと血液を追加し、2つの層が混ざらないように末梢血リンパ球分離液の上に血液をゆっくりと置きます。
   注:ピペットを使用して、チューブの壁に沿ってゆっくりと血液を追加できます。
4. 遠心分離機のチューブを遠心分離機に入れ、加速を8に、減速を3に設定します。450 x g、4°Cで30分間遠心分離します。遠心分離後、試験管内に上から下に、血漿層、PBMCs層(白色膜層)、Ficol-Paque層、赤血球と顆粒球層の4つの層が形成されます。
5. ピペットを使用して、PBMCs層を新しい滅菌遠心分離チューブに慎重に集めます。PBSの3倍の容量を加え、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブの底部にペレットが形成されます。
6. ピペットを使用して上清を捨て、2% Fetal Bovine Serum-Phosphate Buffered Saline(FBS-PBS)を1 mL加えて細胞を再懸濁し、次に3 mLの赤血球(RBC)溶解バッファーを加えます。500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
7. チューブの底に赤血球がなく、赤血球が完全に溶解されていることを示します。細胞を2% FBS-PBSに再懸濁し、その後の実験を直接進めるか、細胞凍結保存液を添加して-80°Cで2〜3ヶ月間保存してください。
   注:一般的なガイドラインとして、再懸濁には、1 x 10⁶細胞あたり0.5 mLの2%FBS-PBSを使用してください。細胞数は、トリパンブルー染色後に血球計算盤または自動セルカウンターを使用して決定し、生細胞と死細胞を区別します。この比率は、その後の処置で最適な細胞回収率と生存率を確保するのに役立ちます。

2. 腫瘍組織細胞の単離

注:腫瘍組織細胞の単離方法は、Songら²²から採用されました。

1. HCCを切除した後、病理医の指導のもと、滅菌メスを使用して腫瘍組織の一部を切除します。ティッシュブロックのサイズは約^1cm3 である必要があります。表面の汚れは、あらかじめ冷やした1x PBSで洗い流します。10% FBSを含む約5 mLのRPMI 1640培地を含む15 mLの遠心チューブに組織を浸します。チューブを氷の上に置き、さらなる処理のために実験室に戻します。
2. 血痕を徹底的に洗い流し、鉗子を使用して脂肪結合組織を手動で除去し、予冷した2%FBS-PBSで組織を完全に洗浄します。消化液を入れた組織培養皿に組織を移します。腫瘍組織を鉗子で固定し、メスで^1mm3より小さく切開します。組織消化液を50 mLの遠心チューブに移し、総容量が約15 mLになるまで組織消化液を追加します。
3. 組織消化混合物が入った遠心チューブをシェーカーに入れます。それを傾けるか平らにし、150rpmおよび37°Cで1時間消化するために固定します。70 μmフィルターで分解溶液をろ過します。
   1. この手順では、1 mLのシリンジプランジャーを使用して組織片を粉砕します。フィルターを2%FBS-1640溶液ですすいでください。ろ液を取り出し、15mLの遠心分離チューブに移します。
4. 濾液を500 x g で4^°Cで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨てます。ペレットを約10mLの36%Percoll溶液に慎重に再懸濁します。その後、再度500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
5. 1 mLのRBC溶解バッファーをピペットで穏やかに吸引し、細胞懸濁液を再懸濁します。懸濁液を新しい15 mL遠心チューブに移し、RBC溶解バッファーを添加して総容量10 mLにします。混合物を室温で10分間放置します。
   注:新しい遠心分離チューブを使用して、チューブ壁の不純物が細胞懸濁液に再侵入するのを防ぎ、細胞収量の低下リスクを低減します。
6. 細胞懸濁液を500 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、その後、細胞を適量の2% FBS-PBSに再懸濁します。一般的なガイドラインとして、再懸濁には1 x 10⁶細胞あたり0.5 mLの2% FBS-PBSを使用してください。
   注:細胞数は、トリパンブルー染色後に血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、生細胞と死細胞を区別することによって決定されます。再懸濁量は、その後の実験に必要な細胞量によって異なります。この比率は、その後の処置で最適な細胞回収率と生存率を確保するのに役立ちます。

3. シスプラチン染色

1. ステップ1.7で得られたPBMCおよびステップ2.6で単離された腫瘍細胞から、それぞれ3 x 10⁶ 細胞を採取します。細胞回収後、Ca²⁺およびMg²⁺を含まないPBS1 mLに再懸濁します。シスプラチンを最終濃度0.5 μMまで添加し、よく混合し、室温で2分間インキュベートします。
   注:シスプラチン染色は、膜の完全性に基づいて死細胞と生細胞を区別するために行われます。膜が損なわれた死細胞はシスプラチンを取り込んで陽性のシグナルを示しますが、生細胞は染色されないままです²³。セルの数は少なくとも 1 x 10⁶ である必要があります。
2. チューブを500 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ステップ3.1で調製した細胞懸濁液を含む各チューブに1 mLの細胞染色バッファーを加えて反応を停止します。500 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、遠心分離後に細胞ペレットがチューブの壁に沿って直線的に分布していないことを確認します。

4. Fc受容体の遮断

1. 各サンプルについて50 μLのブロックミックスを事前に調製します:48 μLの細胞染色バッファーを組み合わせ、次に2 μLのFcブロッキング溶液(細胞染色バッファー:Fcブロッキング溶液= 9:1)を加えます。
2. ステップ3.2の細胞を上記の混合物に懸濁し、室温で10分間放置します。

5. 膜タンパク質抗体のインキュベーション

1. ステップ4.2で得られた各細胞サンプルについて、各抗体を1.1 μLユニット加えて膜タンパク質抗体ミックスを調製します。次に、細胞染色バッファーを添加して、最終容量55 μLにします。この時点で、総容量は約100μLです。
   注:この混合物には、CD163、CCR3、CD141、CD117、およびCD45などの主要な膜タンパク質を標的とする抗体が含まれています^24,25。これらの抗体は、膜タンパク質マーカーの同定における特異性を考慮して選択され、市販の供給源から入手しました(クローン番号、メーカー、カタログ番号などの詳細については、材料の表を参照)。
2. 調製した抗体ミックスを各チューブサンプルに50 μL加え、総容量を100 μLにし、サンプルを静かに渦巻かせ、室温で15分間インキュベートします。
3. 各サンプルに2 mLの細胞染色バッファーを加え、500 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。この手順を2回繰り返します。
4. 上清を捨て、残りの液体を細胞ペレットで短時間ボルテックスして細胞を再懸濁し、完全に分散させます。

6. 核タンパク質染色

1. 細胞が完全に再懸濁されたら、ステップ5.4の各サンプルに500μLの混合溶液(固定:固定/透過化= 3:1)を加えます。サンプルを穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。
2. 透過化バッファー(10倍)を脱イオン水で希釈します。インキュベーション後、室温で500 gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。1000 μLの1x透過化バッファーを各チューブに加えて、細胞を洗浄します。室温で1,000 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
3. 抗体を1x透過化バッファーに再懸濁します。上清を捨て、各細胞チューブに50 μLの抗体混合物を加えます。細胞を静かにピペットで動かして混合し、室温で30〜45分間インキュベートします。
4. 1x 透過化バッファー 1000 μL を各チューブに加え、室温で 1,000 x g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。
5. 各チューブに1000 μLの細胞染色バッファーを加えて細胞を再懸濁し、室温で1,000 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。

7. 細胞固定

1. PBS中の1.6%ホルムアルデヒド溶液を調製し、サンプルあたり1 mLが必要です。
2. ステップ6.5の各サンプルに1.6%ホルムアルデヒド溶液1 mLを加え、ボルテックスして十分に混合し、室温で10分間インキュベートします。
   注:ホルムアルデヒドは一般的に細胞固定に使用されますが、4%パラホルムアルデヒド(PFA)やメタノールなどの代替試薬も使用できます。固定剤の選択は、実験の特定の要件と観察される細胞の特徴に基づいて行う必要があります。
3. 室温で800 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。

8. 核インターカレーション染色

1. 細胞インターカレーション溶液の調製:Cell-IDインターカレーター-イリジウム(Ir)をFixおよび透過化バッファーで希釈し、最終濃度125 nMにします。サンプルごとに1 mLの溶液を調製します。
2. 調製した細胞インターカレーション溶液1 mLをステップ7.3の各固定サンプルに加えます。穏やかに混ぜて、すぐに渦巻きにします。これにより、細胞凝集体の形成を最小限に抑えることができます。
3. 室温で1時間または4°Cで一晩インキュベートします。500 gで室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。

9. 細胞懸濁液の調製

1. ステップ8.3から1000 μLの細胞染色バッファーをチューブに加え、800 x g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。この手順を2回繰り返します。
2. 450 μLから900 μLの脱イオン水を加えて、細胞を再懸濁します。トリパンブルー染色後、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。カウント後、マスサイトメトリーを用いたデータ収集と解析を進めます。

10. マスサイトメトリーとデータ解析

1. CyTOFシステムを使用して質量サイトメトリーデータを取得し、フローサイトメトリースタンダード(FCS)ファイルとして保存します。適切な機器の校正と品質管理を確保し、製造元の指示に従ってバックグラウンドノイズとバッチ効果を低減します。
2. 関連するソフトウェアを使用して、FCSファイル内のCD45⁺ 細胞集団を前処理します。セルサイズ(前方散乱光、FSC)と粒度(側方散乱光、SSC)に基づいて破片を除去します。FSC-A/FSC-H または SSC-A/SSC-H プロットのシーケンシャルゲーティングにより、ダブレットを除外します。シスプラチン排除などの生存率染色を使用して死細胞を排除します。CD45⁺ の集団をゲートして免疫細胞に焦点を当て、ゲートされた集団をさらなる分析のためにエクスポートします。
3. 補因子 5 でデータを変換し、クラスタリング ソフトウェアを使用してメイン クラスターを特定します。SPADE(Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events)アルゴリズムに基づいてクラスタリングを行い、類似したマーカー発現プロファイルを持つ細胞をクラスタ²⁶にグループ化する。階層的確率的近傍埋め込み(HSNE)を使用して、次元の削減と個別のクラスター^{の識別を行います26}。
4. 教師なしクラスタリングのために、R ソフトウェアの cytofkit パッケージを使用して、主要なクラスターの再クラスタリングを実行します。デフォルトのパラメータを使用して、PhenoGraphでサブクラスタを特定します。
5. 次元削減のために Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) を適用します。ウィルコクソン検定を使用して、0.05 の P 値を統計的に有意<と見なして統計分析を実行します。ggplot2 を使用して結果を可視化します。

HCCに関連する免疫学的特徴を解明するために、免疫細胞集団の包括的な分析が行われました。PBMCとHCC組織サンプルのペアをHCC患者4人から採取した。PBMCとHCC組織サンプルの両方について2つの抗体パネルを使用して、免疫細胞集団をシングルセルプロテオミクスレベルで調べるために、マスサイトメトリープロファイリングを行いました。

品質管理後、45,326個の細胞をマスサイトメトリー解析に含めました。PhenoGraphクラスタリングアルゴリズムは、t-SNEと組み合わせて、2次元グラフを生成し、細胞を異なる表現型に分割するために採用されました。主要な免疫細胞サブセットは、CD3(T細胞)、CD4(CD4⁺ T細胞)、CD8(CD8⁺ T細胞)、CD56(NK細胞)、CD19(B細胞)、CD14(単球)などの系統マーカーに基づいて同定された^27,28。免疫細胞クラスターは、マスサイトメトリー技術を用いて特徴付けました。

PBMCサンプルでは、 図1Aに示すように、CD4 T細胞、CD8 T細胞、NK細胞、B細胞、単球、セントラルメモリーCD8 T細胞(CD8Tcm)、マクロファージ、形質細胞様樹状細胞(pDC)、好塩基球、好酸球、エフェクターCD8 T細胞(CD8Teff)、CD141⁺ 従来型樹状細胞(CD141⁺ cDC)、好中球、CD1c⁺ 従来型樹状細胞(CD1c⁺ cDCs)です。各細胞タイプの詳細なマーカー発現パターンを 図1Bに示します。さらに、 図1C は、各サンプル内のこれらの細胞タイプの分布を示しています。PBMCサンプルでは、各細胞タイプの異なる比率が同定されました。特に、サンプルDは他のサンプルと比較してCD4 T細胞の割合が高いことを示しました。サンプルAおよびBは、B細胞の有意な濃縮を示しました。さらに、CD141⁺ 従来の樹状細胞(CD141⁺ cDC)は、主にサンプルCで発見されました。これらの知見は、異なるサンプルにおける特定の細胞タイプのユニークな分布と存在量を強調し、HCCにおける免疫ランドスケープの不均一性に関する洞察を提供します。

同様に、組織サンプルでは、 図2Aに示すように、単球、T細胞、好中球、NK細胞、B細胞、pDC、好酸球、および骨髄性樹状細胞(mDC)を含む8種類の細胞が同定されました。各細胞タイプのマーカー発現パターンを 図2B および 図2C に示し、サンプル内のこれらの細胞タイプの分布を視覚的に表しています。組織サンプルは、すべての患者にわたって細胞型の割合の一貫したパターンを示しました。これは、HCCにおけるこれらの細胞タイプの相対的な存在量に関して、共通の免疫学的特性を示唆しています。この一貫したパターンを理解することで、根底にある免疫の状況と、HCCの病因に対する潜在的な影響について貴重な洞察を得ることができます。

この解析を通じて構築された免疫細胞アトラスは、HCCの免疫状況に関する貴重な洞察を提供し、この疾患に関連する細胞および全身の適応に光を当てます。

図1:PBMCエコシステムのマルチオミクスプロファイリング。 (A)PBMCサンプルから同定され、t-SNEプロットに示されている14の細胞クラスター。(B) (A)に示す細胞クラスターのタンパク質マーカー。(C)マスサイトメトリーデータに基づく4つのサンプルにわたるサブセットの分布パターン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:HCC組織生態系のマルチオミクスプロファイリング(A)HCC組織サンプルから同定され、t-SNEプロットに示された8つの細胞クラスター。(B) (A)に示す細胞クラスターのタンパク質マーカー。(C)マスサイトメトリーデータに基づく4つのサンプルにわたるサブセットの分布パターン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この研究では、マスサイトメトリー技術を活用して、HCCの全身免疫応答と局所免疫応答の両方を詳細に分析します。この文脈でのマスサイトメトリーの適用により、単一細胞レベルでの複数のマーカーの同時検出が可能になり、HCCの複雑な免疫状況を理解するために重要な詳細な免疫表現型の特性評価が可能になります。マスサイトメトリーは、高次元のシングルセル解析を容易にすることで、免疫学的研究に革命をもたらしました。この手法では、抗体に結合したレアメタル同位体タグを採用しているため、1回のランで40以上のパラメータを同時に測定することができます。この能力は、腫瘍微小環境(TME)が高度の細胞不均一性と複雑な免疫相互作用を特徴とするHCCの研究において特に有利である^18,29。

従来のフローサイトメトリーに対するマスサイトメトリーの大きな利点の1つは、マルチプレックス化機能の向上です。従来のフローサイトメトリーでは、蛍光マーカーを使用する際にスペクトルのオーバーラップによって制限されていましたが、マスサイトメトリーでは金属同位体を採用しているため、この問題に悩まされません。これにより、複雑な補償アルゴリズム³⁰を必要とせずに、より多くのマーカーを同時に検出することができる。この機能は、さまざまな免疫細胞集団とその状態をプロファイリングすることが腫瘍と免疫の相互作用を理解するために重要であるHCC研究に不可欠です。マスサイトメトリーは、高次元データをシングルセルの分解能で提供し、TME³¹内の免疫細胞の包括的な解析を可能にします。この詳細レベルは、希少な細胞集団を同定し、腫瘍の進行と免疫回避におけるそれらの役割を理解するために重要です。例えば、マスサイトメトリーは、T細胞、マクロファージ、およびその他の免疫細胞のサブセットを区別することができ、腫瘍内のそれらの機能状態および相互作用に関する洞察を提供することができる¹⁸。

プロトコールの一連の重要なステップにより、取得したデータの信頼性と再現性が保証されます。分離液上に血液を重ねる際には、PBMCの単離を成功させるために重要な、層の完全性を維持し、混合を避けるために、慎重かつゆっくりとした添加が不可欠です³²。同様に、腫瘍組織の酵素的消化には、解離と細胞生存率のバランスをとるための慎重なタイミングが必要である³³。これらの段階での適切な取り扱いにより、PBMCと腫瘍細胞の高い回収率と純度が確保され、これは下流の染色やマスサイトメトリー分析に不可欠です。さらに、シスプラチン染色プロセスは、生細胞と死細胞を正確に区別する上で極めて重要な役割を果たします。不適切なタイミングや集中は、偽陽性または偽陰性の結果につながり、データ品質に影響を与える可能性がある³⁴。さらに、Fc受容体ブロッキングは非特異的抗体の結合を最小限に抑え、細胞表面マーカーの正確な同定を確実にする一方で、正確なマスサイトメトリーの結果を得るために重要な細胞の完全性と細胞内抗原を維持するために、固定および透過化ステップを慎重に制御する必要があります³⁵。

マスサイトメトリーの高次元解析能力は、HCCにおけるバイオマーカー発見のための非常に貴重なツールとなっています。免疫ランドスケープをシングルセルレベルでプロファイリングすることにより、研究者は疾患の進行、治療反応、および全体的な予後に関連する可能性のあるバイオマーカーを特定できる³⁶。この研究では、PBMCと組織サンプル全体で観察された明確な免疫細胞分布は、患者の層別化に重要な情報を提供します。例えば、エフェクターCD8 T細胞のレベルが高い患者は、細胞傷害性T細胞の活性を高める治療法によりよく反応する可能性があり、一方、Tregなどの免疫抑制細胞のレベルが高い患者は、免疫環境を効果的に調節するための併用療法の恩恵を受ける可能性があります。この層別化アプローチは、HCCのより個別化された効果的な治療戦略につながる可能性があります。

マスサイトメトリーは、TME内の免疫細胞集団とその機能状態に関する詳細な洞察を提供し、免疫療法の潜在的な標的の特定を追加します³⁷。これらのバイオマーカーは、バリデーションを行い、標的療法や個別化治療戦略の開発に使用することができます³⁰。Tregや骨髄由来抑制細胞(MDSC)などの免疫抑制細胞集団の同定は、これらの細胞を調節して抗腫瘍免疫を強化することを目的とした治療法の開発に情報を提供できる³⁸。マスサイトメトリーは、TME³⁹内の複雑な相互作用を理解するために不可欠な包括的な免疫プロファイリングを可能にします。これには、免疫細胞の空間分布、それらの表現型および機能状態、および腫瘍細胞との相互作用を特徴づけることが含まれる⁴⁰。このような詳細なプロファイリングにより、免疫回避と免疫耐性のメカニズムに関する新たな知見が明らかになり、複数の経路を標的とする併用療法の開発を導くことができます。

マスサイトメトリー技術は、HCCの全身および局所免疫応答の解析において大きな利点を提供します。その強化されたマルチプレックス機能、高次元性、および単一細胞分解能により、HCC⁴¹の免疫状況に関する詳細な洞察が得られます。この詳細な免疫表現型データを活用することで、研究者はHCCにおける免疫回避のメカニズムをより深く理解し、患者の転帰を改善するためのより効果的な免疫療法戦略を開発することができます。

マスサイトメトリー技術の利点と、HCCの免疫ランドスケープのプロファイリングへの応用にもかかわらず、限界もあります。多段階の単離および染色プロセスは、特に脆弱な免疫細胞集団にとって、細胞の喪失につながる可能性があります。固定はエピトープ認識を変化させ、マーカー検出精度に影響を与える可能性があります。さらに、マスサイトメトリーのデータ解析はバッチ効果に敏感であり、アーティファクトを引き起こす可能性があります。最後に、相当数の生存細胞の必要性は、プロトコルの適用性を小さな腫瘍サンプル⁴²に制限する。これらの制限に対処し、方法論の堅牢性を高めるためには、将来の最適化が必要です。マスサイトメトリーのデータを他の高次元の技術と将来の研究に統合することで、HCCにおける免疫応答の理解がさらに進み、革新的な治療法の開発が導かれるでしょう。

著者は、利益相反がないことを宣言します。

本研究は、National Key Research and Development Program of China(J.S.へのgrant 2019YFA0803000)、The Excellent Youth Foundation of Zhejiang Scientific(J.S.へのgrant R22H1610037)、National Natural Science Foundation of China(J.S.へのgrant 82173078)、The Natural Science Foundation of Zhejiang Province(J.S.へのgrant 2022C03037)の支援を受けて行われました。