Sitotoksisiteye Erişim ve Biyomateryallere Hücre Yanıtı

Bu metodoloji, akış sitometrisi, RT-PCR, immünositokimya ve diğer hücresel ve moleküler biyoloji teknikleri dahil olmak üzere canlılık testleri ve fenotipik analizler kullanarak, çözünür ekstraktların hazırlanması yoluyla biyomateryal sitotoksisitesini değerlendirmeyi amaçlamaktadır.

Biyomateryaller insan dokularıyla doğrudan veya dolaylı olarak temas eder ve bu da sitotoksisitesini değerlendirmeyi önemli kılar. Bu değerlendirme birkaç yöntemle yapılabilir, ancak kullanılan yaklaşımlar arasında yüksek bir tutarsızlık vardır, bu da tekrarlanabilirliği ve elde edilen sonuçlar arasındaki karşılaştırmayı tehlikeye atar. Bu yazıda, dental biyomateryaller için kullandığımız çözünür ekstraktları kullanarak biyomateryallerin sitotoksisitesini değerlendirmek için bir protokol öneriyoruz. Ekstraktların hazırlanması, pelet üretiminden bir kültür ortamında ekstraksiyonuna kadar detaylandırılmıştır. Biyomateryal sitotoksisite değerlendirmesi, MTT testi kullanılarak metabolik aktiviteye, Sülforhodamin B (SBR) testi kullanılarak hücre canlılığına, akış sitometrisi ile hücre ölüm profiline ve May-Grünwald Giemsa kullanılarak hücre morfolojisine dayanmaktadır. Sitotoksisite değerlendirmesine ek olarak, immünositokimya ve PCR ile değerlendirilen spesifik belirteçlerin ekspresyonuna dayanarak hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, ekstraktlar metodolojisini kullanarak biyomateryallerin sitotoksisitesi ve hücresel etkilerin değerlendirilmesi için tekrarlanabilir ve sağlam bir şekilde kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Biyouyumluluk, bir malzemenin dokuyu entegre etme ve lokal ve sistemik hasarlardan arındırılmış olumlu bir terapötik yanıtı indükleme kapasitesi olarak tanımlanabilir ^1,2,3. Biyouyumluluk değerlendirmesi, tıbbi kullanıma yönelik herhangi bir malzemenin geliştirilmesi için çok önemlidir. Bu nedenle, bu protokol, yeni biyomalzemeler geliştirmeyi amaçlayan veya mevcut biyomalzemeler için yeni uygulamaları inceleyen her araştırmacı için sistematik ve kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır.

İn vitro sitotoksisite testleri, primer hücre kültürleri veya hücre hatları kullanılarak biyouyumluluk değerlendirmesi için ilk aşama olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Sonuçlar, potansiyel klinik uygulamanın ilk göstergesidir. Biyomalzeme gelişimi için hayati önem taşımasının yanı sıra, bu test, EUA ve AB düzenleyicilerinin (FDA ve CE sertifikası) 4,5,6,7,8 ile piyasaya sürülmesi için mevcut düzenlemelere uymak için zorunludur. Ayrıca, biyomedikal araştırmalarda standartlaştırılmış testler, tekrarlanabilirlik ve benzer biyomalzemeler veya cihazlar üzerinde yapılan farklı çalışmalardan elde edilen sonuçların karşılaştırılması açısından önemli bir avantaj sağlamaktadır⁹.

Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO) yönergeleri, malzemeleri doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde test etmek için birden fazla bağımsız ticari, düzenleyici ve akademik laboratuvar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. ISO 10993-5, in vitro sitotoksisite değerlendirmesini ifade eder ve ISO 10993-12, numune alma preparatı^10,11'e rapor verir. Biyomalzeme testi için, malzeme türüne, temas eden dokulara ve tedavi hedefine göre seçilecek üç kategori sağlanmıştır: ekstraktlar, doğrudan temas ve dolaylı temas 8,11,12,13. Ekstraktlar, bir hücre kültürü ortamının biyomateryal ile zenginleştirilmesiyle elde edilir. Doğrudan temas testleri için, biyomateryal doğrudan hücre kültürlerine yerleştirilir ve dolaylı temasta, hücrelerle inkübasyon, agaroz jeli¹¹ gibi bir bariyerle ayrılmış olarak gerçekleştirilir. Uygun kontroller zorunludur ve en az üç bağımsız deney yapılmalıdır 5,8,10,11,14.

Sitotoksik potansiyeli belirlemek için klinik koşulları simüle etmek veya abartmak çok önemlidir. Ekstrakt testi durumunda, malzemenin yüzey alanı;  orta hacimli; ortam ve malzeme pH; malzeme çözünürlüğü, ozmolarite ve difüzyon oranı; ve ajitasyon, sıcaklık ve zaman gibi ekstraksiyon koşulları medyayı etkiler^{Enrichmen 5}.

Metodoloji, hem katı hem de sıvı olmak üzere çeşitli farmasötik formülasyonların sitotoksisitesinin kantitatif ve kalitatif olarak değerlendirilmesine izin verir. Nötr kırmızı alım testi, koloni oluşum testi, MTT testi ve XTT testi 5,10,14 gibi çeşitli testler yapılabilir.

Yayınlanan sitotoksisite değerlendirme çalışmalarının çoğu, sınırlı bilgi sağlayan MTT ve XTT gibi daha basit tahliller kullanmaktadır. Biyouyumluluğun değerlendirilmesi sadece sitotoksisitenin değerlendirilmesini değil, aynı zamanda bu protokolün onayladığı gibi belirli bir test materyali^2'nin biyoaktivitesini de içermelidir. Yaslandırıldığında ve belgelendiğinde ek değerlendirme kriterleri kullanılmalıdır. Bu nedenle, bu protokol, biyomateryal sitotoksisite değerlendirmesi için bir dizi yöntemi detaylandıran kapsamlı bir rehber sağlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca, hücre ölümünün tipi, hücre morfolojisi, spesifik proteinlerin sentezinde hücre fonksiyonu ve spesifik doku üretimi gibi farklı hücresel süreçlerin değerlendirilmesi açıklanmaktadır.

1. Pelet hazırlama

1. PVC plakalarda bilinen boyutlarda dairesel şekilli delikler açarak polivinil klorür (PVC) kalıplarını hazırlayın.
   NOT: PVC pervazlar farklı boyutlarda yapılabilir. PVC kalıpların temas yüzeyini A= h(2πr)+2πr² (r: silindirin yarıçapı; h: silindirin yüksekliği) formülünü kullanarak hesaplayın.
2. Test edilecek biyomateryali üreticinin talimatlarına göre ve deneyin başlangıcına mümkün olduğunca yakın bir şekilde hazırlayın.
   NOT: Macun/macun formülasyonu biyomalzemelerinin hazırlanması için, yeterli miktarda baz macun ve katalizör bir karıştırma spatulası ile manuel olarak karıştırılır. Sıvı ve toz formülasyonlarına dayanan diğer malzemeler için, üreticinin talimatlarını izleyerek veya yeni malzemeler için yeterli olan manuel spatulasyon veya titreşimle mekanik karıştırma yapılmalıdır. Sıvı malzemeler için bu adım gerekli değildir. Adım 2'de protokolü başlatın.
3. Biyomateryali bir spatula ile kalıpların üzerine yerleştirin ve uygun süre için ayarlanmalarına izin verin.
   NOT: Biyomalzemelerin ayar süresi ve ayar koşulları, üreticinin talimatlarına veya yeni malzemeler için yeterli talimatlara uygun olmalıdır.
4. Ayarladıktan sonra, biyomalzemenin peletlerini PVC kalıplarından çıkarın ve bir kaba yerleştirin (6 kuyucuklu bir plaka veya bir Petri kabı kullanılabilir).
5. Peletleri, her iki taraf için 20 dakika boyunca ultraviyole ışık (UV) lambasının altına yerleştirerek sterilize edin.

2. Biyomateryallerin ekstraktlarının elde edilmesi

NOT: Tüm prosedürler sıkı steril koşullar altında yapılmalıdır.

1. Pelet yüzey alanını 1.1'de açıklanan formüle göre hesaplayarak gerekli pelet sayısını belirleyin.
   NOT: Referans değer olarak, 250 mm²/mL^11,15 temas yüzey alanı, ortamın mL'si başına 9 pelet (r 3 mm x y ^1,5 mm) eklenerek elde edilir.
2. Çözünür ekstraktları hazırlayın (biyomalzeme ile zenginleştirilmiş ekstrakt).
   1. Peletleri 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve hücre kültürü ortamının karşılığını ekleyin. Tüpleri 24 saat boyunca inkübatöre 37 ° C'de, sürekli rotasyonda yerleştirin.
      NOT: Hücre kültürleri için uygun hücre kültürü ortamını kullanın.
   2. 24 saat sonra, tüpleri inkübatörden çıkarın. Bu noktada, ekstraktlar 1/1 veya% 100'lük bir konsantrasyona karşılık gelir.
   3. Hücre kültürü ortamına eşit hacimlerde şartlandırılmış ortamın sıralı olarak eklenmesiyle ekstraktın seyreltmesini yapın.
      NOT: Ortama pH ayarı yapılmamalıdır.
      1. %50 ekstrakt elde etmek için 1 mL'lik %100 ekstraktın içine 1 mL kültür ortamı ekleyin. %25'lik bir ekstrakt elde etmek için 1 mL'lik %50'lik ekstraktın 1 mL'sine 1 mL kültür ortamı ekleyin ve bu şekilde devam edin (Şekil 1).
         NOT: Her bileşik için ilgili bulunan konsantrasyonları kullanın.

Şekil 1: Çözünür ekstraktların hazırlanması ve seyreltilmesi şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Biyomateryallerin özleri ile hücre inkübasyonu

1. Hücresel bir süspansiyon hazırlayın ve deneyler için gereken hücre sayısına göre çok kuyulu bir plaka gibi yeterli bir hücre kabında plakalayın.
   1. İstenilen hücrelerin% 80 ila% 90 birleşme ile bir şişesi ile başlayın.
   2. Hücre kültürü ortamını atın, fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) ile yıkayın ve hücreleri tripsin-EDTA ile ayırın (75^cm2'lik bir hücre kültürü şişesi için 1 ila 2 mL).
   3. Hücre kültürü ortamını ekleyin (75^cm2'lik bir hücre kültürü şişesi için 2 ila 4 mL), hücre süspansiyonunu bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
   4. Pelet, bilinen bir hücre kültürü ortamı hacminde askıya alın.
      NOT: Bu protokol, yapışkan hücre kültürlerinin kullanımı için tasarlanmıştır; Bununla birlikte, süspansiyon hücre kültürleri ile çalışmak için basit uyarlamalar yapılabilir.
   5. Hemositometredeki hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonunu hesaplayın.
   6. Belirlenen miktarda hücre süspansiyonunu kültür ortamında askıya alın ve çok kuyulu tabaklara aktarın. Tohumlama yoğunluğu için referans değer olarak, 5 – 20 x 10⁵ hücre /^cm2 düşünün.
      NOT: Uygun hücre sayısı, hücre tipine ve hücre özelliklerine, yani hücre iki katına çıkma süresine göre hesaplanmalıdır.
2. Hücre yapışmasına izin vermek için hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin.
3. Bu süreden sonra, çözünür ekstraktları kültür plakalarına uygulayın.
   1. Hücre kültürü ortamını aspire edin.
   2. Biyomalzemelerin ekstraktlarını, daha önce açıklandığı gibi, konsantrasyon sırasına göre her bir kuyucuğa ekleyin. Kontrol kuyucuklarına taze hücre kültürü ortamı ekleyin.
   3. Plakaları 24 saat veya daha uzun süre inkübe edin.
      NOT: Her tahlilde, kültür ortamında muhafaza edilen, işlenmemiş hücrelere karşılık gelen negatif kontroller yapılmalıdır. Kuluçka süreleri çalışma hedeflerine göre seçilebilir.

4. Metabolik aktivitenin değerlendirilmesi

1. Biyomateryallerin özleri ile hücre inkübasyonundan sonra, ortamı plakalardan aspire edin ve her bir PBS kuyusunu yıkayın.
2. Her bir kuyucuğa, PBS, pH 7.4'te hazırlanan yeterli miktarda 0.5 mg / mL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazol bromür (MTT) yerleştirin.
3. Plakaları 4 saat boyunca veya karanlıkta 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
4. Elde edilen formazan kristallerini çözündürmek için, her bir oyuğa izopropanolde yeterli miktarda 0.04 M hidroklorik asit çözeltisi ekleyin ve plakaları 30 dakika karıştırın.
   NOT: MTT ve izopropanol miktarını kuyucukların boyutuna göre ayarlayın.
5. Gerekirse, kristal görülmeyene kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek her bir kuyucuğun içeriğini karıştırın ve homojenize edin.
6. Spektrofotometrede 620 nm referans filtresi ile 570 nm dalga boyundaki absorbansı ölçün.
7. Metabolik aktiviteyi hesaplamak için, tedavi edilen hücrelerin emilimini kontrol kültürlerinin emilimine bölün. Yüzde değerlerini elde etmek için 100 ile çarpın.

5. Hücre ölümü değerlendirmesi

NOT: Bu değerlendirmeyi yapmak için koşul başına en az 10⁶ hücre kullanılmalıdır.

1. Değerlendirilen koşullara göre uygun şekilde tanımlanmış santrifüj tüpleri kullanın.
2. Biyomateryallerin özleri ile hücre inkübasyonundan sonra, kültür ortamını ilgili tüpe toplayın.
3. Hücreleri ayırın ve hücre süspansiyonunu ilgili tüplere ekleyin.
4. Hücre süspansiyonlarını 5 dakika boyunca 120 x g'de santrifüjleme ile konsantre edin.
5. Peletleri PBS ile yıkayın. PBS'yi 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüjleme ile çıkarın.
6. 1 mL PBS ekleyin ve hücre peletlerini tanımlanmış sitometri tüplerine aktarın.
7. PBS'yi 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüjleme ile çıkarın.
8. 100 μL bağlayıcı tampon (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl ve 0,25 mM CaCl₂)16 ile inkübe edin ve hücre zarı geri kazanımı için hücrelerin yaklaşık ¹⁵ dakika dinlenmesine izin verin.
9. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Annexin-V etiketli 2,5 μL floresan ve 1 μL propidyum iyodür ekleyin.
10. İnkübasyondan sonra, 400 μL PBS ekleyin ve sitometre üzerinde analiz edin. Bilgilerin analizi ve nicelleştirilmesi için uygun yazılımı kullanın.
11. Sonuçları canlı hücrelerin yüzdesi, apoptoz, geç apoptoz/nekroz ve nekroz olarak sunar.

6. Morfoloji değerlendirmesi

1. Çok kuyulu plakanın içine sığacak uygun boyutta sterilize edilmiş cam kapak fişlerini seçin.
2. Her slaytı steril cımbız kullanarak bir kuyucuğa yerleştirin.
3. Hücresel bir süspansiyonu kuyucuklara yeterli konsantrasyonda dağıtın ve% 95 hava ve% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de bir inkübatörde gece bekletin_.
4. Hücre kültürlerini daha önce tarif edildiği gibi ekstraktlara maruz bırakın.
5. Medyayı aspire edin ve PBS ile yıkayın.
6. Kapak fişlerinin oda sıcaklığında kurumasını bekleyin ve daha sonra kapak fişlerini örtmek için yeterli miktarda May-Grünwald çözeltisi ekleyin; 3 dakika boyunca inkübe edin.
7. Boyayı çıkarın ve 1 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın.
8. Suyu çıkarın ve kapakları örtmek için yeterli miktarda Giemsa çözeltisi ekleyin; 15 dakika boyunca inkübe edin.
9. Kapakları akan suda yıkayın.
10. Kapak fişlerini bir slayta aktarın.
11. Mikroskop altına bakın. Fotoğrafları seçilen büyütme ile çekin.

7. Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile hücre fonksiyon değerlendirmesi

NOT: Bu değerlendirmeyi gerçekleştirmek için koşul başına en az 2x10⁶ hücre kullanılmalıdır. Örnek olarak, alkalen fosfataz, odontoblastların aktivite değerlendirmesi için ilgi çekici bir gen olarak sunulmuştur. İlgilenilen diğer genler Tablo 1'de görülebilir.

1. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi plakalayın.
   NOT: Kaplanan hücrelerin konsantrasyonunun, incelenen biyomateryallerin hücre tipine ve sitotoksisitesine göre ayarlanması gerekebilir.
2. Yukarıda tarif edildiği gibi çözünür ekstraktlarla inkübe edin.
3. Daha önce açıklandığı gibi bir süspansiyon elde etmek için hücreleri ayırın.
4. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın; Bu santrifüj için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de.
5. Peletleri 1 mL RNA saflaştırma çözeltisinde (örneğin, NZYol), yoğun karıştırmada ve ardışık pipetlemede askıya alarak hücreleri lize edin.
6. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
7. 200 μL kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye boyunca elle çalkalayın.
8. Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
9. Santrifüj, 12.000 x g'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj lizatları. Bu santrifüjleme sırasında, numunede iki faz ortaya çıkar ve RNA'yı sulu (üst) fazda bırakır.
10. Sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın ve RNA'yı çökeltmek için 500 μL soğuk izopropanol ekleyin.
11. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
12. Süpernatantı çıkarın ve peleti 7.500 x g'de santrifüjleme yoluyla 1 mL% 75 etanol ile 4 ° C'de 5 dakika yıkayın.
13. Pelet etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında kurutun.
14. RNase içermeyen suda askıya alın.
15. 260 nm ve 280 nm dalga boylarında absorpsiyon spektrofotometrisini kullanarak numunelerin saflık derecesini ölçün ve belirleyin. RNA saflığını belirleyin ve 2.0 civarında saflık oranına (A260/280) sahip numuneler kullanın.
16. Örnekleri -80 ° C'de saklayın
17. RT-PCR'yi üreticinin protokolü^17'ye uyarak gerçekleştirmeye devam edin.
    NOT: Etüt hedefine göre, değerlendirilecek belirli belirteçleri seçin.

8. Protein tanımlama yoluyla hücre fonksiyon değerlendirmesi

NOT: Çalışma hedefine göre, değerlendirilecek spesifik proteinleri seçin. Örnek olarak, dentin sialoprotein (DSP), odontoblastların aktivite değerlendirmesi için ilgi çekici bir protein olarak sunulmuştur. İlgilenilen diğer proteinler Tablo 1'de görülebilir.

1. Kültür hücreleri örtü kayması içinde ve daha önce tarif edildiği gibi ekstraktlara maruz kalır.
2. Hücre kültürlerini PBS ile yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit ile sabitleyin.
4. PBS ile iki kez yıkayın.
5. PBS'de 15 dakika boyunca% 0.5 Triton ile geçirgenleştirin.
6. Peroksidazın PBS'de% 0.3 hidrojen peroksit ile 5 dakika boyunca bloke edilmesi.
7. PBS ile iki kez yıkayın.
8. % 0.5 sığır serum albümini (BSA) ile iki kez yıkayın.
9. Hücre kültürlerini 45 dakika boyunca% 2 BSA ile bloke edin.
10. PBS'de %0,5 BSA ile yıkayın.
11. Kültürleri, seçilen proteine göre birincil antikor ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Bu protokol birincil antikor DSP (M20) Antikoru (1:100) ve ikincil antikor Poliklonal Tavşan Anti-keçi immünoglobulinleri/HRP'yi (1:100) kullanır.
12. PBS'de% 0.5 BSA ile beş kez yıkayın.
13. Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca ikincil antikor ile inkübe edin.
    NOT: PBS'de %0.5 BSA kullanarak antikor seyreltmelerini yapın.
14. Her yıkamada 1 dakika boyunca PBS'de% 0.5 BSA ile beş kez yıkayın.
15. Kültürleri 25 dakika boyunca 20 μL kromojen / mL substrat konsantrasyonunda bir substrat ve kromojen karışımı ile inkübe edin.
16. PBS'de% 0.5 BSA ile iki kez yıkayın.
17. 15 dakika boyunca Hematoksilin ile karşı boya yapın.
18. Fazla boyayı çıkarmak için 0.037 mol / L amonyak ve damıtılmış su dizisi ile 5 dakika boyunca yıkayın.
19. Kapak fişlerini slaytlara monte edin. Montaj ortamı olarak gliserol kullanın.
20. Gece boyunca kurumaya bırakın.
21. Mikroskop altına bakın. Fotoğrafları seçilen büyütme ile çekin.

9. Alizarin Red S testi ile mineralizasyon değerlendirmesi

1. 40 mM¹⁸ konsantrasyonda bir Alizarin Red S çözeltisi hazırlayın. Homojenizasyon için çözeltiyi karanlıkta 12 saat karıştırın.
   NOT: 100 mL Alizarin Red S çözeltisi hazırlamak için, 1.44 g alizarin tozunu (Moleküler ağırlık: 360 g / mol) ışıktan korunan ultra saf suda çözündürün. Bu çözelti için pH değeri kritiktir ve 4.1 ile 4.3 arasında olmalıdır.
2. Yukarıda tarif edildiği gibi, hücre kültürünü çözünür ekstraktlarla inkübe edin.
3. Hücre kültürlerini PBS ile üç kez yıkayın.
4. Oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile 15 dakika boyunca sabitleyin.
5. PBS ile üç kez yıkayın.
6. Alizarin Kırmızı Boyama solüsyonu ile karanlıkta 37 ° C'de 20 dakika boyunca lekeleyin.
7. Boyamadan sonra, fazla boyayı çıkarmak için plakaları PBS ile yıkayın.
8. Mikroskop altına bakın. Fotoğrafları seçilen büyütme ile çekin.
9. Her bir kuyucuğa% 10 (w / v) asetik asit ve% 20 (w / v) metanol içeren bir ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika karıştırmaya bırakın.
10. Bir spektrofotometre¹⁹ üzerinde 490 nm dalga boyunda absorbansı ölçün.

Buradaki temsili sonuçlar, diş biyomateryallerinin çalışmasına atıfta bulunmaktadır. Ekstrakt metodolojisi, dental materyallere maruz kaldıktan sonra, metabolik aktivite (Şekil 2), hücre canlılığı, hücre ölüm profili ve hücre morfolojisi (Şekil 3) ve spesifik proteinlerin ekspresyonu (Şekil 4) üzerindeki etkilerle ilgili olarak bir sitotoksisite profili ve hücre fonksiyonu elde etmeyi sağlar.

MTT testi, malzemelerin sitotoksisitesine basit bir şekilde hızlı bir genel bakış elde etmek için kullanılır. İki veya daha fazla malzeme arasında karşılaştırma yapılabilir (Şekil 2); Düşük (% 6.25) ve orta konsantrasyonlarda (% 50) olsa bile, metabolik aktivitenin ciddi şekilde azalması, daha yüksek toksisiteye işaret eder (Şekil 2a). Aynı zamanda, daha az sitotoksik materyal sadece daha hafif veya hiç azalma göstermez (Şekil 2b). Farklı zaman noktaları arasındaki karşılaştırmalar, daha acil sitotoksik etkilerin veya daha sonraki aşamaların belirlenmesini sağlar.

Hücre canlılığı üzerindeki etkiler, dokuların zararlı bir etkiden sonra iyileşme kapasitesini tehlikeye atabilecek canlı hücre indirgemesi hakkında önemli bilgiler sağlar. Canlı hücrelerin yüzdesinin belirlenmesi, materyal sitotoksisitesinin karşılaştırılmasına izin verir; daha fazla sitotoksik materyal aynı konsantrasyon için daha yüksek hücre ölümüne neden olur (Şekil 3a ve 3b). %30'a kadar olan azalmalar kritiktir ve düşük biyouyumluluk riski taşıyan malzemeleri tanımlar (Şekil 3a). Bu bilgi hücre ölüm profili ile tamamlanır (Şekil 3a ve 3b). Temsili sonuçlarda, daha fazla sitotoksik materyal hücre canlılığında vurgulanmış bir azalma ve geç apoptoz ve nekroz hücre ölümü profili ile karakterize edilirken (Şekil 3a), daha az sitotoksik olanlar daha az hücre ölümü ve daha apoptotik ve geç apoptotik profil sunar (Şekil 3b).

Hücresel morfoloji değerlendirmesinden elde edilen bilgiler (Şekil 3c) hücre canlılığı değerlendirmesini tamamlamaktadır. Hücrenin tipik morfolojisindeki değişiklikler apoptotik veya nekrotik bir profili gösterebilir¹⁶. Ayrıca, bu protokolden, malzeme parçacıklarının gözlemlenmesi gibi ek bilgiler elde edilebilir (kırmızı oklar, Şekil 3C).

Ekstrakt maruziyetinden etkilenen, hücre fonksiyonu için temel olan spesifik belirteçler, immünohistokimya, PCR, akım sitometrisi, lekelenme veya kolorimetrik testler gibi çeşitli tekniklerle değerlendirilebilir (Tablo 1). Ekstraktlara maruz kaldıktan sonra DSP ekspresyonunun temsili sonuçları Şekil 4a'da gösterilmiştir ve bazı malzemelerin (trikalsiyum silikatlar çimentolar) protein ekspresyonunu arttırmak için hücreleri uyardığı görülebilir. Buna karşılık, diğerleri (kalsiyum hidroksit çimentoları), canlılık kaybından bağımsız olarak protein ekspresyonunda önemli bir azalmayı teşvik eder. Her iki durumda da, ekstraktların konsantrasyonu protein ekspresyonunu doğrudan etkiler.

Odontoblast fenotipinin MDPC-23 hücre hattında, mineralizasyon birikintilerinin oluşumu karakteristiktir. Mineralize tortuların tanımlanması ve nicelleştirilmesi için protokol, bu tip uzmanlaşmış hücrelerin spesifik işlevinin değerlendirilmesine izin verir. Sunulan olguda, daha az sitotoksik olmasının yanı sıra, trikalsiyum silikat çimentosunun, mineralize birikintilerde bir artış gözlendiğinde, hücre fonksiyonunu uyardığı gözlenmiştir (Şekil 4b). Aksine, daha sitotoksik kalsiyum hidroksit çimentosu, hücre bozulması ve ölümü nedeniyle mineral birikiminin azalmasına neden olmuştur (Şekil 4b). Nitel bir değerlendirmeye ek olarak, nicel bir belirleme yapılabilir (Şekil 4c).

Şekil 2: Metabolik aktivite. 24, 72 ve 120 saat boyunca kalsiyum hidroksit çimento [a)] ve trikalsiyum silikat çimento [b)] çözünür ekstraktlarla muamele edilmiş MDPC-23 hücrelerinin metabolik aktivitesi. Sonuçlar,% 100'lük bir değerle kontrol hücresi kültürlerine normalleştirilir. Önemli farklılıklar * ile temsil edilir, burada * p<0.05, ** p<0.01 ve *** p<0.001 anlamına gelir. Bu Şeklin bir kısmı, yayıncının izniyle önceki bir yayından değiştirilmiştir²⁰. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hücre canlılığı, ölüm profili ve hücre morfolojisi. MDPC-23 hücrelerinde hücre canlılığı, hücre ölüm profili ve hücre morfolojisi, 120 saatlik maruziyetten sonra% 6.25 ve% 50 konsantrasyonda kalsiyum hidroksit ve trikalsiyum silikat biyomateryalleri ile tedaviye tabi tutulmuştur. a) ve b) Sonuçlar, apoptoz, geç apoptoz veya nekroz ve nekrozda canlı hücrelerin yüzdesi olarak çizilir. Kontrole göre veya koşullar arasındaki önemli farklılıklar * ile gösterilir; burada * p <0.05, ** p <0.01 ve *** p <0.001 anlamına gelir. c) May-Grünwald Giemsa ile %50 konsantrasyonda biyomateryal konsantrasyonunda çözünür ekstraktlarla muamele edildikten sonra boyanan hücreler. Kontrol grubu, DMEM'deki kültürdeki hücreleri% 10 FBS ile temsil eder. Sol sütundaki görüntüler 100x, sağdaki sütundaki görüntüler ise 500x büyütme ile elde edilmiştir. Şekil çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu Şeklin bir kısmı, yayıncının izniyle önceki bir yayından değiştirilmiştir²⁰. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: DSP ekspresyonu ve mineralize nodül oluşumu. a) 96 saatlik inkübasyondan sonra% 50 ve% 6.25 konsantrasyonlarında kalsiyum hidroksit ve trikalsiyum silikat ile işleme tabi tutulduğunda DSP ekspresyonunun tespiti için immünositokimya ile etiketlenmiş MDPC-23 hücreleri. b) 120 saatlik inkübasyondan sonra% 50 ve% 6.25 konsantrasyonlarında kalsiyum hidroksit ve trikalsiyum silikat biyomateryalleri ile muamele edildiğinde Alizarin Red S boyası ile boyanmış kültürlenmiş MDPC-23 hücrelerinden görüntüler. Tüm fotoğraflar 100x büyütme ile elde edildi. Her iki Şekil çubuğu da 150μm'yi temsil eder. c) 120 saatlik maruziyetten sonra kalsiyum hidroksit ve trikalsiyum silikat ile muamele edilmiş MDPC-23 hücrelerinden kalsiyum birikintilerinin oluşumu. Sonuçlar, numunelerin absorbanslarının oranı ve kontroldür. Önemli farklılıklar * ile temsil edilir, burada * p<0.05, ** p<0.01 ve *** p<0.001 anlamına gelir. Bu Şeklin bir kısmı, yayıncının izniyle önceki bir yayından değiştirilmiştir²⁰. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Odontoblastik farklılaşma/fonksiyon belirteçleri listesi^47-79. Bu tablo, odontoblastik belirteçlerin ve algılama yöntemlerinin bir listesini sağlar; Bu belirteçlerin bazıları diğer dokular tarafından da eksprese edilir.

Bu protokol, dokularla temas eden biyomateryallerin in vitro sitotoksisitesinin değerlendirilmesini ifade eden ISO 10993-5 dikkate alınarak, biyouyumluluğu değerlendirmek ve tekrarlanabilirlik çalışmalarına katkıda bulunmak amacıyla tasarlanmıştır²¹. Bu, bilimde giderek artan bir endişe kaynağıdır ve birçok yazar, in vitro çalışmalarının deneysel tasarımında bu önerileri zaten izlemektedir 15,22,23,24,25,26,27,28.

Önerilen metodoloji, hücre biyolojisinin en alakalı yönlerini taramak için seçildi. Bu nedenle, bu protokol, ortak tahliller ve fenotipten fonksiyona kadar çeşitli hücre parametreleri de dahil olmak üzere tamamlayıcı bir değerlendirme kullanarak sitotoksisiteyi değerlendirmek için eksiksiz bir yaklaşım sağladığında, önerilerin ötesine geçer. Bu tamamlayıcı değerlendirme, biyomateryal etkisini gerçekten değerlendirmek için önemlidir, çünkü canlılık gen ve protein ekspresyonu, hücre döngüsü veya sekretom seviyesindeki değişiklikleri tercüme edemeyebilir.

Ekstraktlar, özellikle yapışkan hücre hatlarında avantajlıdır, çünkü malzemelerin kültür plakasının^{yüzeyine yerleştirildiği} bazı doğrudan temas yaklaşımlarının aksine, substrata hücre bağlanması ve optimal kültür koşulları ile hiçbir girişim yoktur ^22,28.

Dahası, ekstraktlar, hücrelerin farklı konsantrasyonlara maruz kalmasına izin verir²⁹, dokulardaki maddelerin difüzyonunu taklit eder, bu da özellikle aşırı sulanan dokularla temas halinde uygulandıklarında, in vivo olarak geçirdikleri klirensi simüle eder. Doğrudan temas testleri farklı konsantrasyonları doğru bir şekilde değerlendiremeyebilir ve dolaylı temas testleri, difüzyon yapmama, membranlardan eksik difüzyon veya agar ile reaksiyon ile ilgili potansiyel zorluklar göstermiştir.

Kantitatif bir değerlendirme sağlayan testler tercih edilir, hücre canlılığının% 30'dan fazla azalması sitotoksik^11,30 olarak kabul edilir. Yeni biyomalzemelerin geliştirilmesinde, böyle bir azalma meydana gelirse, yeniden formüle etme veya terk etme ihtiyacını belirler. Cesaret verici sonuçlar elde edilirse, in vivo değerlendirme^29,31 öngörerek daha ileri çalışmalar yapılmalıdır.

İn vitro testler klinik koşulları simüle etmeli veya abartmalıdır. Bu nedenle, ekstrakt hazırlama için uygun yüzey hacmi oranlarının belirlenmesi kritik öneme sahiptir. 1.25–6^cm2/mL yüzey-hacim oranları önerildi. Köpükler gibi yüzey düzensizlikleri olan malzemeler söz konusu olduğunda, 0,1–0,2 g/mL veya 6^cm2/mL başlangıç noktasıdır 15,20,2. Bu protokolde ve diğer çalışmalarda kullanılan temsili sonuçlarda mL ortam başına 250^mm2 oranı ^{kullanılmıştır 15,20}.

Kliniklerde bu şekilde kullanılmasa bile numunelerin özelliklerini değiştirmeyen yöntemlerle sterilize edilmesi gerekmektedir. UV ışınlaması genellikle iyi bir seçimdir. Bu, hücre kültürlerinin mikrobiyal kontaminasyonunu önlemek için büyük önem taşımaktadır 11,24,32.

Ekstraksiyon ortamı,^11,33 biyomateryal kimyasal özelliklerine göre seçilen serumlu veya serumsuz hücre kültürü ortamı^, fizyolojik salin çözeltisi, dimetilsülfoksit veya arıtılmış suyu içerir. Hücre kültürü çalışmalarını hedefleyen hücre kültürü ortamının kullanımı, daha ileri işlem adımlarından kaçındığı için tercih edilmektedir. Ekstraksiyon koşulları deneysel modele göre ayarlanmalıdır. Bu protokolde gösterilen temsili sonuçlarda, FBS ile desteklenen DMEM kültür ortamı, 37 ± 1 ° C'de 24 ± 2 saat boyunca kullanılmıştır.

Bazı biyomateryaller ekstraksiyon ortamında kalıntılar bırakabilir ve bu da hücre kültürlerini olumsuz yönde etkileyebilir. Filtreleme ve santrifüjlemelerden kaçınılması gerekirken, bir olasılık, parçacıkların kullanmadan önce çökelmesine izin vermektir. Diğer bir sorun, ekstraksiyondan sonra değişikliğe uğrayabilecek pH'dır. Daha fazla ayarlamanın yapılması tavsiye edilmediğinden11, ekstraktların pH'ı ölçülmeli, kaydedilmeli ve gerekirse pH etkisini izole etmek için ek kontroller deneysel tasarıma dahil edilmelidir.

Bu protokol yapışkan hücre kültürleri için tarif edilmiş olsa da, süspansiyon kültürlerini kullanmak için basit modifikasyonlar yapılabilir. Benzer şekilde, katı biyomalzemelerin kullanılmasının yanı sıra, prosedürü, esas olarak ekstraksiyon adımlarını, sıvıları, jelleri veya köpükleri incelemek için uyarlamak mümkündür^34,35,36,37.

Uygun yoğunlukta hücre kültürlerinin hazırlanması, özellikle yüksek duplikasyon oranına sahip hücre kültürlerinde kritik öneme sahiptir³¹. Kullanılan hücrelerin önerilen tohumlama yoğunluğu aralığına göre, uzun süreli inkübasyonlar planlanıyorsa, aşırı birleşme ile ilişkili sorunlardan kaçınmak için ilk tohumlama yoğunluğunun azaltılması yapılmalıdır. Ek olarak, yüksek sitotoksik malzemeler daha yüksek başlangıç tohumlama yoğunlukları gerektirebilir.

Ekstrakt metodolojisinin avantajlarının yanı sıra, hücre aderansının değerlendirilmesinin ilgili olduğu malzemeler için en iyi seçim değildir. Bu durumda doğrudan temas çalışmaları 38,39,40,41 yapılmalıdır. Bu kapsamlı bir yaklaşım olmasına rağmen, in vivo koşulları tamamen yansıtmayan in vitro bir değerlendirme olduğunu akılda tutmak önemlidir⁴².

Bir biyomateryal sadece dokuya zarar vermekle kalmamalı, aynı zamanda bazı anti-enflamatuar ve immünomodülan süreçleri uyarmalıdır ^43,44,45,46. Böylece, bu protokol, hücre canlılığı ve hücre ölüm profili de dahil olmak üzere hücresel mekanizmaların yanı sıra diğer protein sentezi mekanizmalarının değerlendirilmesiyle daha da ileri gider. Yapılan değerlendirme, sitotoksisitenin yanı sıra canlı dokulardaki biyomateryal biyoaktivitesinin sonucuna varılmasını sağlamalıdır.

Sadece diş hekimliği için değil, ortopedi, cerrahi, oftalmoloji, kardiyoloji vb. için de tıbbi uygulamalar için yeni malzemelerin patlaması ile ilk taramalar sistematik olarak yapılmalıdır. Bu protokol, yeni biyomateryalleri geliştirmeyi ve karakterize etmeyi amaçlayan araştırmacılar için önemli bir araç olabilir.

Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Destek için aşağıdakilere teşekkür ederiz: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB, UIDB/04539/2020 ve UIDP/04539/2020 (CIBB) Stratejik Projesi aracılığıyla FCT (Bilim ve Teknoloji Vakfı) aracılığıyla Ulusal Fonlar tarafından finanse edilmektedir. Michigan Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi'nden Jacques Nör'e MDPC-23 hücre hattını sağladığı için teşekkür ederiz.