Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Bu protokol klonal hücre hattı seçimi ve onların cognate GPCRs sentezlenmiş eklembacaklı nöropeptidlerin yapı-aktivite ilişkileri analiz etmek için bir kalsiyum biyoparlaklık tahlil için yönergeler sağlar. Bu testte, sentetik analog tasarım ve peptid / kurşun ilaç keşfi için reseptör deorphanization ve yapı-aktivite ilişkileri çalışmaları için kullanılabilir.

Arthropod hormon reseptörleri birçok temel fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen roman pestisitler için potansiyel hedefler. Bunların büyük çoğunluğu G-protein reseptörler (GPCRs) süperailesinin aittir. Biz kene ve sivrisinek eklembacaklı kinin reseptörleri karakterize odaklanmıştır. Eklembacaklılar kininler myotropic, idrar söktürücü ve nörotransmiter fonksiyon ile çok fonksiyonlu nöropeptitlerin. Burada, iki heterolog kinin böcek kininler yapı-aktivite ilişkileri sistematik analizi için bir yöntem reseptör ifade sistemleri açıklanmıştır. Biz, idrar söktürücü, myotropic ve / veya kene ve sivrisinek sindirim süreçleri bozmaya potansiyeline sahip biostable kinin analogları gelişimi ile ilgili önemli bilgiler sağlar.

Güney sığır kene, Boophilus Microplus (Canestrini) ve sivrisinek Aedes aegypti (Linnaeus), kinin reseptörleri stably memeli hücre hattı CHO-K1 ifade edildi. Bu reseptörlerin fonksiyonel analizleri, hücre içi biyoparlaklık peptid başvurusu üzerine bu rekombinant hücrelerin sitoplazmik kalsiyum seviyelerini belirlemek için önlemler kalsiyum biyoparlaklık plaka assay kullanılarak tamamlandı. Bu yöntem aequorin protein, Işıklı denizanası izole bir photoprotein yararlanır. Biz geçici stably kinin reseptörleri ifade hücre hatları plazmid aequorin (mtAEQ/pcDNA1) transfekte. Bu hücreler daha sonra hücre içi aequorin ile kompleksleri kofaktör coelenterazine ile tedavi edildi. Bu bağ, kalsiyum varlığında kalsiyum konsantrasyonu göstergesidir lüminesans seviyeleri yayan kırar. Kinin reseptör hücre içi kalsiyum salınımı yoluyla sinyalleri olarak, sinyal yoğunluğu peptid potens ile ilgili.

Bu protokol, daha önce açıklanan birkaç değişiklik ile protokolleri bir sentezidir. GPCRs kararlı ifade, fonksiyonel plaka testlerinin (Staubly ve ark, 2002 ve Ahırlar ve ark, 1997 ile bir memeli hücre hattı için adım adım talimatlar .) Bu metodoloji kullanarak, sivrisinek ve kene kinin reseptörleri ifade istikrarlı hücre hatları kurmayı başardık, üç sivrisinek kininler potens karşılaştırmak, ligand-reseptör etkileşimi için kritik amino asit pozisyonları belirlemek ve bir peptit üretilen yarı-tarama gerçekleştirmek kütüphanesi. Böcek kininler endojen peptidazlar hızlı enzimatik bozulmaya karşı duyarlı olduğundan, ciddi haşere kontrolü ya da endokrinolojik çalışmalar için bir araç olarak kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle, biz de kendi gücü ve biostability geliştirmek için amino izobütirik asit (Aib) içeren kinin analogları test. Bu peptidaz dayanıklı analog biostable böcek kinin analogları gelişiminde önemli bir kurşun temsil eder ve nöropeptid tabanlı eklembacaklıların kontrol stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

1. Kararlı hücre hatları kurulması

1. Ilgi GPCR Clone ve memeli bir sistemi en iyi şekilde ribozomal bağlanma (Kozak, 1986) için başlangıç ​​kodon etrafında 5 'Kozak konsensüs dizisi (GCCA / GCCATGG) içeren bir ifade vektör takın. Burada, sivrisinek kinin reseptör (. Pietrantonio ve ark, 2005. Holmes ve ark, 2003), kene kinin reseptörüne plazmid pcDNA3.1/Bm-KR ve plazmid pcDNA3.1/Aedae-KR kullanın. Bakteri ve memeli hücrelerinin seçimi için neomisin (G418) direnç seçimi için vektör ampisilin direnç kodlar - pcDNA3.1 ().
2. CHO-K1 boş hücreleri (plazmid olmadan) (ATCC, Manassas, VA, USA) veya 37 T-25 balonuna diğer istenen hücre hattı (BD Falcon) ° C,% 5 _CO 2 nemlendirilmiş inkübatör (Holmes ve ark büyütün , 2003). Aksi belirtilmediği sürece Tüm bu koşullar altında daha fazla inkubasyon yapılmalıdır. Büyüme ortamında boş hücreleri (% 10 fetal sığır serumu ile F12K orta) koruyun 1X Antibiyotik antimikotik (Invitrogen, CA).
3. Hücreleri bölmek için, 37 ° C'ye kadar tüm çözümler ısınmak T-25 balonuna eski orta çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın ve sonra PBS kaldırmak. Hücreleri trypsinize için, 2 dakika için 2 ml PBS-tripsin-EDTA (34 ml PBS, 2 ml% 7.5 sodyum bikarbonat, 4 ml 10X tripsin-EDTA) ekleyin. 3 ml besiyeri ekleyin ve hücrelerin karışımı, orta ve aşağı yukarı aspirat. Konik bir tüp ~ 200-300 g (1.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüj içine hücreleri ile orta aktarın. Süpernatant atın ve 5 ml orta hücreleri yeniden askıya. Taze orta ile 01:05 ya da 01:10 'lik bir konsantrasyon yeniden süspanse hücreleri seyreltilir ve yeni bir T-25 cam şişe içinde 5 ml transferi.
4. Antibiyotik olmadan, hücreler (2-3 gün etrafında) sağlıklı büyüyen tohum CHO-K1 hücreler, T-25 doku kültürü şişeleri ve büyüme orta gecede büyümek sonra yaklaşık% 30 konfluent (yaklaşık 18 saat) kadar. Confluency derecesi ters floresan mikroskobu altında gözlemleyerek hücreleri tespit edilebilir.
5. Her bir örnek için aşağıdaki karışımlar hazırlayın:
   1. 100 ul Opti-MEM I Serum Orta (Invitrogen) İndirimli: 1-2 mg DNA (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR kullanımı 4μl örnek) birleştirin.
   2. DNA Lipofectin bir 1:1 oranında, 6 ul Lipofectin Reaktif (InvitrogenTM) 100 ul F12K serum ortamın içine karıştırın. 30-45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
   Yavaşça bir damla bilge moda (toplam hacmi = 200 mcL) 1.5.1 1.5.2 ile gelen çözümleri karıştırın. 10-15 dakika oda sıcaklığında bekletin.
6. Hücreler eski büyüme ortamı çıkarın ve 5 ml F12K serum serbest orta hücreleri yıkayın ve ardından F12K serum serbest orta kaldırmak. 15 ml'lik bir tüp içinde, 1.8 ml taze F12K ortamın içine yavaşça bir damla bilge moda transfeksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra, PBS ile 1.5 adım hücreler yıkanır ve hücrelerin bu yeni transfeksiyon çözüm eklemek. 18 saat inkübe edin.
7. F12K orta artı% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik olmadan gece inkübe orta değiştirin. Başka bir 18 saat için antibiyotik olmadan F12K orta artı% 10 fetal sığır serumu (bölme hücreler için lütfen adım 1.3 'e bakınız) ile iki adet T-25 şişeler içine hücreleri bölün.
8. Seçici besiyeri (F12K orta artı 800μg/ml GENETICIN% 10 fetal sığır serumu, Invitrogen) ile orta değiştirin. 3-4 hafta için seçici besiyeri kullanarak hücrelerin Kültür. Zamanla bu hücreler için stably kendi genomik DNA plazmid dahil seçecektir. Bakım, orta (F12K orta artı 400μg/ml GENETICIN% 10 fetal sığır serumu) kullanarak hücreleri koruyarak devam edin. Hücre hatları, beklenmedik bir kirlenme durumunda kayıpları önlemek için donma medya 1:1 oranında (% 20 DMSO ile seçici orta) ile periyodik olarak dondurun.
9. Klonal hücre hatları seçme: İlk adım olarak, trypsinize ve bakım ortamı ile 1.8 adım adım 1.3 olarak hücreleri santrifüj. 5 ml bakım ortamında yeniden askıya alma hücreleri, hücrenin 0.5 ml askıya almak ve 10x seyreltme yapmak için 4.5 ml taze bakım orta eklemek. Tek hücre seçmek için her bir kuyunun 100 ul ekleyerek 10x seyreltme, 96 plaka 12 kuyu içine aktarın.
10. 100 ul başına bir hücre (10x seri dilüsyonları toplam sayısı 19, normalde son seyreltme 10 ^-19 10 ^-11 aralığında olacak) bir final süspansiyon için bu hücrelerin 10x seri dilüsyonları yapmaya devam . Hemen her seyreltme seyreltme 100 ul, 96 plaka 12 kuyu içine aktarın. 18 saat inkübasyondan sonra, bir ters ışık veya sadece tek bir hücre içeren ya da açıkça tek bir hücre ayrılmış iki hücre içeren görünen floresan mikroskop ve işareti kuyu altında 96 kuyucuğu gözlemliyoruz. Her üç günde bir, her gün ve değişim ortamında gözlemleyerek tutun.
11. Kuyu% 80 confluent (yaklaşık bir hafta), 200 ul PBS ile işaretlenmiş kuyuları 100 ul PBS-tripsin-EDTA çözeltisi ile yıkayın ve onları trypsinize. Hücrelerin her biri de 1 ml bakım ortamı ile 6-plaka iyi bir içine işaretli transfer. Sonra 3 gün boyunca bu hücrelerin büyümesine bireysel T25 balona hücreleri aktarmak. Agonist peptidler (bölüm 2 bakınız) ile kalsiyum biyoparlaklık assay kullanarak bu hücrelerin test edin.
12. Kalsiyum biyoparlaklık plaka tayininde yüksek tepki ile adım 1.11 1 hücre hattı seçin ve ikinci kez tek bir hücre seçimi aşağıdaki adımları 1,9-1,11 gerçekleştirmek. Periyodik olarak hücre hatları dondurmak.
13. Adım 1.12 'de açıklanan ikincil seçim, en yüksek kalsiyum biyoparlaklık plaka tayininde tepki ile 2-3 hücre hatları seçin ve daha fazla kalsiyum biyoparlaklık plaka deneyleri için kültür onları korumak. Geçit numaraları takip edin. Zaman zaman, her zaman daha pasajlar ile hücre hatları sürekli performans bırakırsam onlara geri dönmek ve böylece erken geçişleri hücre hatları dondurma.

2. Kalsiyum biyoparlaklık plaka tahlil

1. Bir ifade vektör ilgi muhabiri gen Arter. Burada aequorin plazmid mtAEQ/pcDNA1 (bir hediye Dr. CJP Grimmelikhuijzen ve Michael Williamson, Kopenhag Üniversitesi, Danimarka) kullanılmıştır. E. plazmid Dönüşümü coli hücreleri MC1061/PS (Invitrogen) ve QIAprep dönmeye miniprep kiti (Qiagen Inc.) kullanarak onları arındırmak. Son adım olarak EDTA, su olmadan Tris tamponu ile plazmid Zehir.
2. Grow bakım ortamında istenilen reseptör ifade adım 1.13 hücre hatları. Hücrelerin% 90 konfluent, trypsinize santrifüj ve ardından adım 1.3 gibi 5 ml bakım ortamda hücrelerin yeniden askıya. Sulandırınız hücreleri (bakım ortamı ile ilgili 10x) ve mikroskobunda (Bright-Line hemasitometre) ile karşı hücre hücre sayısını. Hücre sayısı yaklaşık 2 x 10 ⁵ hücre / ml ayarlayın (9 meydanlarından birinde ortalama 20 hücre hemasitometre gösterdi). Altı plaka her kuyuya medya Tohum 2 ml seyreltilmiş hücreleri. 24 saat (hücreleri inkübasyondan sonra yaklaşık% 60 confluency ulaşmak gerekir) inkübe edin.
3. 6 kuyu plaka medya OPTI-MEM orta değiştirin. 4 ul FuGENE 6 Transfeksiyon reaktifi (Roche Biyokimyasallar) ile her bir iyi, bir mikrofuge'de tüp içinde 96 ul OPTI-MEM karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Her tüpe 1 mcg aequorin / pcDNA 1 plazmid DNA ekleyin ve sonra yavaşça 15-20 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin, 1 dakika için örnek sallamak. Plaka hafifçe sallayarak ise damla damla bir moda her kuyuya her karışımı ekleyin. Plakalar 6 saat inkübe ve antibiyotik olmadan% 10 fetal sığır serumu içeren orta F12K ortamı değiştirmek.
4. Altı plaka hücrelerin 24 saat süreyle inkübe sonra, trypsinize santrifüj ve 1.3 adım olarak hücreleri yeniden askıya. Hücre sayısı 400.000 hücre / ml adım 2.1 olarak sayın ve her kuyuya 96-de beyaz ince alt mikrotitre plaka (Costar 3610) 100 ul (toplam 40.000 cells/100 ul) transfer. Yaklaşık% 80 hücre confluency kadar başka bir 24 saat süreyle inkübe edin. Bu biyoparlaklık tayini için hücrelerin optimum konsantrasyonu.
5. Karanlıkta 5 mcM coelenterazine (Invitrogen) içeren bir kalsiyum ücretsiz DMEM medya (Invitrogen) 90μl/well hazırlayın (coelenterazine ışığa karşı hassastır). 2.4 'ten plaka, eski medya kaldırmak ve her kuyuya bu 90μl eklemek. 37 karanlıkta 3 saat plakaları ° C'de ve plaka hücrelerin test edilmesi için hazırız sonra% 5 CO _2.

3. Enstrüman işlem ve veri analizi

1. Her biyoparlaklık plaka okuyucusu farklıdır. Biz bioluminensence modunda Novostar (BMG Labtechnologies) plaka okuyucu kullanarak tahlil gerçekleştirin. Farklı bir araç kullanıyorsanız, protokol ayak uydurması gerekmektedir.
2. Kullanmadan önce plaka okuyucu pompaları (veya BAŞBAKANLIK POMPALAR) temizleyin. Plaka sahibi plaka koymadan önce oda ışığı kapatın. Plaka sahibinin kapalı sonra, ışıkları açmak.
3. Peptidler (1,5 ml Eppendorf tüp) kalsiyum serbest DMEM medya çözünür. "Aspire Derinlik" ve "Pozisyon Belirlenmesi" Kullanmadan önce peptid çözüm ayarlayın. Peptidler konsantrasyonları (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, ya da istenen başka bir peptid) değişen 10 ul (10x) hücreleri Challenge ve ışık emisyon hemen kaydetmeye başlarsınız. Biz, toplam süre 50 saniye, her iyi, her 2 saniyede bir ışık yayma (465 nm) kayıt alet var.
4. Gibi etkin bir analog (analog FFFSWGa Taneja-Bageshwar ve ark, 2009, kullanılmakta olan) ve vektör sadece transfekte hücreler gibi bir negatif kontrol olarak pozitif kontrol emin olun. Negatif kontrol (temsilcisi sonuçlarını görmek), temel eşik ayarlamak için veri analizi sırasında gerekli olacaktır.Alakasız bir inaktif peptid negatif kontrol olarak da eklenebilir.
5. Run tamamlandıktan sonra, cihaz pompa (veya BAŞBAKANLIK POMPALAR), ardından sonraki peptid örnek yerde yıkayın. Verileri kaydetmek ve pompalar tekrar yıkayın.
6. Veri işleme: Her iyi bir Microsoft Excel veri sayfası ışık emisyon verileri aktarın.
7. Excel GraphPad Software Inc (San Diego, CA, USA) Prism yazılımının 4.0 veri yapıştırın. Çeşitli peptid konsantrasyonları X ekseni ve biyoparlaklık birimleri Y ekseni. Verileri normalleştirmek için bir günlük-yanıt eğrisi arsa. Her peptid konsantrasyon-yanıt eğrileri elde etmek için bir doğrusal olmayan regresyon eğrisi uyum analizi (değişken eğim ile sigmoidal doz-yanıt denklemi) seçin. Programı araziler sonunda değerler ve AT ₅₀ verir.
8. Her deney veri analizi için üç kez tekrarlanması gerekir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

CHO-K1 hücrelerde ifade edildiğinde, sivrisinek Aedes aegypti kinin reseptör multiligand reseptör olarak davrandığını ve işlevsel 1 nM üç endogenours Aedes kininler, Aedae kininler 1-3 gibi düşük konsantrasyonlarda yanıt, tek başına kalsiyum biyoparlaklık plaka assay kullanılarak test . Aedae-K-elde potens sıralaması Aedae-K-3, 16.04 nM ilgili EC ₅₀ değerleri dayalı Aedae-K-3> Aedae-K-2> Aedae-K-1, Şekil 1'de görüldüğü istatistiksel olarak (Pietrantonio ve ark, 2005) (p <0.05) anlamlı derecede farklı idi 2, 26.6 nM ve Aedae-K-1, 48.85 nM.

Ayrıca kinin artıkları kinin peptid-reseptör etkileşimi için kritik olduğunu belirlemek için bu testte kullanılır. Böcek kinin peptidlerin, çekirdek olarak da bilinen biyolojik aktivite için gerekli asgari sıra temsil eden bir C-terminal Pentapeptid paylaşıyoruz. Tablo 1'de, kinin peptid çekirdek analogları çekirdekli kinin Pentapeptid FFSWGa bir Alanin yedek serisi olarak sentezlenmiş ve kalsiyum biyoparlaklık plaka assay (Taneja-Bageshwar ve ark, 2006) tarafından test edilmiş. Biz amino asitler Phe ¹ ve Trp ^4, her iki reseptörlerine böcek kininler faaliyet için gerekli olduğu bulundu.

Tahlil de, gelişmiş biostability için tasarlanmış peptidler test etmek için kullanılabilir. Tablo 2 kene rekombinant kinin reseptörü ve Şekil 2 test izobütirik amino asit (Aib) içeren tasarlanmış kinin analogları bir kalsiyum CHO-K1 hücre hattı ifade eden kene kinin reseptör alfa-amino altı izobütirik asit analogları faaliyet karşılaştırma gösterir biyoparlaklık plaka assay (Taneja-Bageshwar ve ark, 2009). Hexapeptid analog FFFSWGa reseptör aktivitesi için bir pozitif kontrol için eklenir. Analog FF [Aib] WGA, bu Hexapeptid kontrol analog daha aktif sonuçlandı. Iki aminoisobutyric asit değiştirmeleri, [Aib] FF [Aib] WGA, analog test (Tablo 2 ve Şekil 2) çift değiştirme analogları en güçlü oldu.

Bu testte olmuştur ve Nahman ve Pietantonio (2010), Nachman ark uygulanabilir nasıl daha fazla örnek için. (2009), Taneja-Bageshwar ve ark. (2008a), ve Taneja-Bageshwar ve ark. (2008b).

Şekil 1. Aedes Tahmini kalsiyum biyoparlaklık plaka yöntemi ile CHO-K1 E10 hücreleri etkili konsantrasyonu (EC ₅₀₎ kininler konsantrasyon-yanıt eğrileri y-ekseni, her biri için gözlenen maksimal yanıt bir yüzdesi olarak ifade biyoparlaklık üniteleri elde edildi peptid. Veri noktaları üç bağımsız deney sırasında elde edilen ortalama altı çoğaltır temsil eder. Barlar standart hata temsil eder. (A) Tahmini Aedae-K1 EC ₅₀ = 48 nM. (B) Tahmini Aedae-K2 EC ₅₀ = 26 nM. (C) Tahmini Aedae-K3 EC ₅₀ = 16 nM. EC ₅₀ Aedae-K3 50 Aedae-K2 50 Aedae-K1, p <0.05. İstatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 4.0 yazılımı ile.

Şekil 2. Bir kalsiyum biyoparlaklık plaka yöntemi ile CHO-K1 hücre hattı ifade eden kene kinin reseptör alfa-amino altı izobütirik asit analogları Faaliyet karşılaştırılması. Y ekseni bir konsantrasyon gözlenen biyoparlaklık bir yüzdesi olarak ifade edilen her analog yüzde maksimum biyoparlaklık birimleri temsil eder her analog test edilen tüm konsantrasyonları arasında gözlenen maksimal yanıt karşı. İstatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 4.0 yazılımı ile yapıldı.

Tablo 1. Tahmini potenslerine (EC ₅₀₎ ve maksimal biyoparlaklık yanıt kene ve sivrisinek reseptör transfekte hücre hatları üzerinde test edilen tüm peptidlerin *.

* EC ₅₀ yarım maksimum yanıt elde etmek için gerekli konsantrasyonu tahmin ediyor. I: biyoparlaklık yanıt en az 300 adet (yalnızca vektör transfekte hücreler seviyesi) ise İnaktif. A: peptid FFSWGa ilgili kalıntı alanin almıştır konumu. ND: Analog test edilmiş, ancak ya çok aktif olmayan veya düşük molarities aktif değildi, böylece EC50 tespit edilemedi.

(Tablo 2). Kinin, amino izobütirik asit (Aib) içeren kene rekombinant kinin reseptör analogları (K ) test. AC: asetil; α Me: α metil-fenilalanin; β3F: β3-fenilalanin; a: amid.

Biz bu protokolü kullanarak, Arachnida (keneler, kene ve örümceklere), kene kinin reseptör keşfedilen ilk nöropeptid reseptör fonksiyonel karakterizasyonu yapabilecektir. Bu yöntem, üç temel uygulamalar vardır. İlk olarak, teknik ligand aktivite ölçümleri ile reseptör deorphanization için uygulanabilir. İkincisi, tahlil ligand-reseptör yapı-aktivite ilişkileri (SAR) çözebilirsiniz. Üçüncü olarak, ilaç keşfi yöntemleri kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, hemen hemen her GPCR agonistleri veya antagonistleri faaliyet çalışma kullanılabilir. Biz küçük kütüphanelerin tarama için bu protokolü adapte başlıyor. Kullanılan hücre hattı, her yerde G proteini _G 16 ifade etmez . Biz bunu gerek yoktu, çünkü Gq protein ve hücre içi kalsiyum kaskad ile eklembacaklıların kinin reseptörleri, sinyal ve burada gösterildiği gibi memeli hücrelerinde bu sinyalizasyon özellikleri korumak.

Dr. CJP Grimmelikhuijzen Kopenhag Üniversitesi (Danimarka) ve Michael Williamson aequorin plazmid sağlamak için takdir edilmektedir. Bizim işbirlikçi ARS-USDA (Teksas, ABD), Dr. Ronald J. Nachman, peptid sentezi ve Novostar plaka okuyucu sağlamak için kabul edilmektedir.