모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

이 프로토콜은 clonal 세포 라인 선택과 자신의 동족 GPCRs에 합성 arthropod neuropeptides의 구조 - 활동 관계를 분석하기 위해 칼슘 bioluminescence 분석에 대한 지침을 제공합니다. 이 분석은 합성 아날로그 설계 및 펩타이드 / 약물 리드 발견 수용체 deorphanization 및 구조 - 활동 관계 연구에 사용될 수 있습니다.

Arthropod 호르몬 수용체들은 많은 중요한 생리 및 행동 과정을 조절 같은 소설 살충제에 대한 잠재적인 공격 대상입니다. 그들의 대다수는 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)의 superfamily에 속합니다. 우리는 진드기와 모기의 arthropod kinin 수용체를 특성화에 초점을했습니다. Arthropod의 kinins는 myotropic, 이뇨제, 그리고 신경 전달 물질의 기능으로 다기능 neuropeptides 있습니다. 여기, 두 heterologous kinin에 곤충 kinins 구조 - 활동 관계를 체계적으로 분석하는 방법은 수용체 - 표현하는 것은 시스템에 설명되어 있습니다. 우리는 이뇨제, myotropic 및 / 또는 진드기와 모기의 소화 과정을 방해하는 잠재력을 지닌 biostable kinin analogs의 발전과 관련된 중요한 정보를 제공합니다.

남부 소 틱, Boophilus microplus (Canestrini), 그리고 모기 Aedes aegypti (리네 우스)에서 kinin 수용체는 안정 포유 동물 세포주 CHO - K1으로 표현했다. 이러한 수용체의 기능 분석은 이러한 재조합 세포 펩티드 신청시 세포질 칼슘 수준을 결정하는 세포 bioluminescence를 측정하는 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석을 사용하여 완료되었습니다. 이 방법은 aequorin 단백질, 발광 해파리로부터 격리 photoprotein을 활용합니다. 우리는 transiently 안정 kinin 수용체를 표현 세포 라인에 플라스미드 aequorin (mtAEQ/pcDNA1)을 transfected. 이러한 전지는 다음 어느 세포 aequorin와 단지 cofactor의 coelenterazine와 치료를했다. 이 증서에는 칼슘 농도 나타내는 발광 레벨을 방출, 칼슘의 존재에 나옵니다. kinin 수용체는 세포 내 칼슘의 출시를 통해 신호로, 신호의 강도는 펩타이드의 힘 관련이 있습니다.

이 프로토콜은 수정 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜의 합성이며.. 그것은 기능 플레이트 assays (Staubly 외, 2002 스테이블스 외, 1997을 통해 포유류의 세포 라인에 GPCRs의 안정 표현에 대한 단계별 지침을 제시 ). 이 방법론을 사용하여, 우리는 모기와 틱 kinin 수용체를 표현하는 안정적인 세포 라인을 설정할 수 있었다 세 모기 kinins의 힘을 비교, 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 중요한 아미노산 위치를 식별하고, 펩타이드의 세미 처리량 검사를 수행 도서관. 곤충 kinins는 내생 peptidases로 빠르게 효소 저하의 영향 때문에, 그들은 심각 해충 제어하거나 endocrinological 연구 도구로 사용에 제한됩니다. 따라서, 우리는 그들의 힘 및 biostability을 향상 아미노산 isobutyric의 산성 (Aib)이있는 kinin analogs을 테스트했습니다. 이 펩티다제 방지 아날로그 biostable 곤충 kinin의 analogs의 개발에 중요한 단서를 나타내고 neuropeptide 기반 arthropod 제어 전략의 개발에 도움이됩니다.

1. 안정적인 세포 라인의 구축

1. 관심의 GPCR을 복제하고 포유류의 시스템에 최적의 ribosomal 바인딩 (코작, 1986)의 시작 코돈 주변 5 '코작의 합의 순서 (GCCA / GCCATGG)을 통합 발현 벡터에 삽입. 여기서 우리는 모기 kinin 수용체 (.; Pietrantonio 외, 2005. 홈즈 외, 2003)에 대한 체크 kinin 수용체에 대한 플라스미드 pcDNA3.1/Bm-KR 및 플라스미드 pcDNA3.1/Aedae-KR을 사용합니다. 벡터는 포유 동물 세포에 선택에 대한 박테리아와 네오 마이신 (G418) 저항의 선택에 대한 암피실린 저항을 인코딩 - pcDNA3.1 ().
2. CHO - K1 빈 셀 (plasmids 제외) (ATCC, 머내서스, VA, 미국) 또는 37 T - 25 플라스크의 다른 원하는 세포주 (BD 팔콘) · 5 % CO ₂ humidified 인큐베이터에서 C (홈즈 외 그로 ., 2003). 별도로 명시하지 않는 한 모든 추가 incubations 이러한 조건 하에서 수행되어야합니다. 함께 성장 매체에서 빈 셀을 (F12K 매체 10% 태아 소 혈청)를 유지 1X 항생제 - Antimycotic (Invitrogen, CA).
3. 세포를 분리하기 위해 37 ° C.에 대한 모든 솔루션을 따뜻하게 T - 25 플라스크에 오래된 매체를 제거하고 PBS로 5 ML 씻어 후 PBS를 제거합니다. 세포를 trypsinize하려면 2 분 2 ML PBS - 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 (34 ML PBS, 2 ML 7.5 % 나트륨 중탄산염, 4 ML 10X 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))을 추가합니다. 3 ML 미디어를 추가하고 세포를 섞어 매체를 대기음 아래. 원뿔 튜브와 ~ 2백~3백g (1,000 RPM) 2 분 원심 분리기로 세포와 매체를 전송합니다. 뜨는 취소 5 ML 매체에서 다시 중지 세포. 신선한 매체 1시 5분 또는 1시 10분의 농도에 resuspended 세포를 희석하고 새로운 T - 25 플라스크에 5 ML을 전송.
4. 세포가 항생제없이 (2-3 일 정도) 건강하게 성장하는 씨앗 CHO - K1 세포를 T - 25 조직 문화 flasks로 성장 매체들이 야간 성장 후 그들은 약 30 %의 합류 (약 18 시간)까지. confluency의 정도는 거꾸로 형광 현미경 하에서 관찰 세포에 의해 결정하실 수 있습니다.
5. 각 샘플에 대해 다음과 섞어 준비 :
   1. 100 μl Opti - 멤 전 세럼 중간 (Invitrogen)을 감소와 함께 : 1-2 μg의 DNA (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR의 사용 4μl 예)를 결합합니다.
   2. DNA에 Lipofectin의 1:1 비율을 만들고, 100 μl F12K 혈청 무료로 중간에 6 μl Lipofectin 시약 (InvitrogenTM)를 섞는다. 30-45 분 실온에서 알을 품다.
   부드럽게 (총 부피 = 200 μL)를 드롭 현명한 방식으로 1.5.2과 1.5.1에​​서 솔루션을 섞는다. 10-15 분 실온에서있게 해줘요.
6. 세포에서 오래된 성장 매체를 제거하고 5 ML F12K 혈청 무료 매체로 세포를 세척 후 F12K 혈청 무료 매체를 제거합니다. 15 ML 관에서 부드럽게 드롭 현명한 방식으로 신선한 F12K 매체의 1.8 ML로 transfection 혼합물을 섞는다. 그런 다음, PBS와 단계 1.5에서 세포를 씻어하고 세포에 transfection이 새로운 솔루션을 추가합니다. 18 시간 동안 부화.
7. 항생제없이 중간 플러스 10% 태아 소 혈청을 F12K와 하룻밤 부화 매체를 변경합니다. 또 18 시간 동안 항생제없이 F12K 매체 플러스 10% 태아 소 혈청 (분리 세포에 대한 단계 1.3 참조) 두 개의 T - 25 flasks로 세포를 분리.
8. 선택적 매체 (F12K 매체 플러스 800μg/ml GENETICIN와 10% 태아 소 혈청, Invitrogen)로 매체를 교체합니다. 3-4주에 대한 선택적 매체를 사용하여 세포 문화. 시간이지나면서이 안정적으로 자신의 게놈 DNA에 플라스미드를 통합해야 전지 선택합니다. 유지 보수 매체 (F12K 매체 플러스 400μg/ml GENETICIN와 10% 태아 소 혈청)를 사용하여 세포를 유지 계속합니다. 주기적으로 예기치 않은 오염의 경우에는 손실을 방지하기 위해 동결 미디어의 1시 1분 비율 (20 % DMSO와 선택적 중간)와 세포 라인을 정지.
9. clonal 세포 라인을 선택 : 첫 번째 단계로, trypsinize 및 단계 1.3 유지 보수 매체와 1.8 단계에서 세포를 원심 분리기. 다시 중지 전지 5 ML 유지 보수 매체에 세포의 0.5 ML은 일시 중단하고 10X 희석를 만들기 위해 신선한 유지 보수 매체 4.5 ML를 추가 가져가라. 단일 세포에 대한 선택 각 잘 ~ 100 μl를 추가, 96 잘 접시 12 우물에 10 배 희석을 전송합니다.
10. 100 μl 당 하나의 셀 (; 10X 직렬 dilutions의 총계 ^~ 19 일반적으로 최종 희석은 10 ^-19 10 ^-11의 범위에서 될)의 이론적 최종 정지에 대해 이러한 세포의 10X 시리얼 dilutions을 계속 . 즉시 각 희석 다음, 96 잘 접시 12 우물에 희석 100 μl를 전송합니다. 18시간 보육 후, 거꾸로 빛 또는 유일한 하나의 세포를 포함하거나 분명 하나의 세포에서 나눈 두 세포를 포함하는 것처럼 형광 현미경 마크 웰스 이하 96 자 번호판을 관​​찰합니다. 모든 삼일 매일 및 변경 매체를 관찰 유지.
11. 우물은 80 % conflu 경우천만에 (주일), 200 μl PBS로 표시된 우물을 씻어 PBS - 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 100 μl으로 그들을 trypsinize. 잘 1 ML 유지 보수 매체와 6 자 판 잘 하나에 표시된 각 전송 세포. 3 일간 그 세포를 성장 다음 각 T25 플라스크에 세포를 전송합니다. 작용제의 펩티드 (2 절 참조)과 칼슘 bioluminescence 분석을 사용하여 이러한 세포를 테스트합니다.
12. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석에서 가장 높은 응답 단계 1.11에서 1 셀 라인을 선택하고 두 번째로 단일 셀 선택 다음 단계 1.9-1.11에 대한 수행합니다. 주기적으로 세포 라인을 정지.
13. 단계 1.12에 설명되어있는 보조 선택에서 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석에서 가장 높은 응답 2-3 셀 라인을 선택하고 추가로 칼슘 bioluminescence 플레이트 assays를위한 문화에서 그들을 유지합니다. 통과 번호를 추적할 수 있습니다. 더 많은 구절과 셀 라인이 지속적으로 실적을 중지하면 당신은 항상 그들에게 돌아갈 수 있도록 때때로 초기 구절에서 세포 라인을 정지.

2. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석

1. 발현 벡터에 관심있는 리포터 유전자를 Ligate. 여기 aequorin 플라스미드 mtAEQ/pcDNA1을 (DRS. CJP Grimmelikhuijzen과 마이클 윌리엄슨, 코펜하겐 대학, 덴마크의 선물) 사용됩니다. E.에있는 플라스미드를 변환 대장균 세포의 MC1061/PS (Invitrogen)과 QIAprep 스핀 miniprep 키트 (Qiagen 주식 회사)를 사용하여 정화. 최종 단계에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 아니라 물없이 트리스 버퍼와 플라스미드를 elute.
2. 보수 매체에서 원하는 수용체를 표현하는 단계를 1.13에서 세포 라인을 성장. 세포이 90 % 합류하는 경우, trypsinize 원심 분리기 다음 단계 1.3는 5 ML 유지 보수 매체에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 세포를 (유지 보수 매체에 대한 10 배) 희석하여 현미경 하에서 세포 카운터 (브라이트 - 라인 Hemacytometer)와 휴대폰 번호를 계산합니다. 약 2 × 10 ⁵ 세포 / ML에 휴대폰 번호를 조정 (9 사각형 중 하나에 평균 20 세포는 Hemacytometer에 보여주었다). 여섯 잘 접시의 각 우물에 미디어에 씨앗이 ML 희석 세포. 24 시간 (세포 배양 후 약 60 %에 도달해야 confluency)에 품어.
3. OPTI - 멤 매체에 6 우물 판에서 미디어를 변경합니다. 각 잘 들어, microfuge 튜브 4 μl FuGENE 6 Transfection 시약 (로체 Biochemicals)에 96 μl OPTI - 멤를 섞어 5 분 실온에서 앉아 보자. 각각의 튜브에 aequorin / pcDNA 1 플라스미드 DNA 1 μg를 추가하고 나서 부드럽게 15-20 분 상온에서 품어, 1 분 샘플을 흔들. 부드럽게 잘 번호판을 흔들어 동안 dropwise 방식으로 각 우물에 각 혼합물을 추가합니다. 6 시간 동안 접시를 부화하고 항생제없이 10% 태아 소 혈청을 포함하는 미디어를 F12K 수있는 매체를 변경합니다.
4. 24 시간 동안 식스 웰 플레이트에있는 세포를 잠복기 후, trypsinize 원심 분리기 및 단계 1.3로 세포를 다시 일시 중지합니다. 단계 2.1로 400,000 셀 / ML에 휴대폰 번호를 카운트하고 96 잘 흰색 얇은 바닥 microtitre 플레이트 (코스타 3610)의 각 우물에 100 μl (총 40,000 cells/100 μl)를 전송합니다. 80 %의 세포 confluency까지 24 시간 동안 부화. 이것은 bioluminescence 분석을위한 세포의 최적 농도이다.
5. 어둠 5 μm의의 coelenterazine (Invitrogen)에 포함된 칼슘이없는 DMEM 매체 (Invitrogen)의 90μl/well 준비 (coelenterazine 것은 민감한 빛입니다.) 2.4에서 접시를 타고 이전 미디어를 제거하고 각 우물에이 90μl를 추가합니다. 37 어둠 속에서 3 시간 동안 접시를 품어 ° C와 접시에있는 세포가 시험을 준비하는 이후 5% CO _2.

3. 악기 운영 및 데이터 분석

1. 각 bioluminescence 플레이트 판독기가 다릅니다. 우리는 bioluminensence 모드에서 NOVOstar (BMG의 Labtechnologies) 플레이트 판독기를 사용하여 우리의 분석을 수행합니다. 다른 악기를 사용하는 경우 프로토콜을 적응해야합니다.
2. 사용하기 전에 플레이트 판독기 펌프 (또는 PRIME 펌프) 정리. 접시 홀더에 접시를 올려 놓기 전에 방에 불을 끕니다. 플레이트 소유자가 폐쇄되면에 불을 켭니다.
3. 칼슘없는 DMEM 매체에서 펩티드를 (1.5 ML Eppendorf 튜브) Solubilize. "기음 깊이"를 사용하기 전에 펩타이드 솔루션의 "위치 결정"을 설정합니다. 펩티드의 농도 (FFFSWG - NH2, Aedes - K1 - 3, 또는 기타 원하는 펩타이드)를 다양한 10 μl (10X)로 세포를 도전 즉시 발광 녹음을 시작합니다. 우리는 50 초 총 시간에 대한 각 잘 매 2 초 동안 발광 (465 nm의)를 기록하는 악기를 설정했습니다.
4. 이러한 적극적인 아날로그 (아날로그 FFFSWGa이 타네 - Bageshwar 외. 2009 년, 사용되고있다)와 같은 벡터에만 transfected 세포로 대조군과 같은 긍정적인 컨트롤을 포함시키십시오. 부정적인 제어 (대표 결과를 참조) 기준 임계값을 설정하는 데이터 분석 중에 필요합니다.관련없는 비활성 펩타이드 또한 대조군으로 추가할 수 있습니다.
5. 실행이 완료되면, 악기 펌프 (또는 PRIME 펌프) 다음 다음 펩타이드 샘플 장소를 씻으십시오. 데이터를 저장하고 다시 펌프를 세척.
6. 데이터 처리 : Microsoft Excel의 데이터 시트에 각 우물에서 발광의 데이터를 전송합니다.
7. Excel에서 GraphPad 소프트웨어 주식 회사 (샌디에고, CA, 미국)에서 프리즘 소프트웨어 4.0 데이터를 붙여 넣습니다. 다양한 펩타이드의 농도는 X - 축이며 bioluminescence 단위는 Y 축입니다. 데이터를 정상화하려면 로그 - 반응 곡선을 플롯. 각 펩타이드에 대한 농도 - 반응 곡선을 얻기 위해 비선형 회귀 곡선에 맞게 분석 (변수 경사와 sigmoidal 선량 - 반응 방정식)을 선택합니다. 프로그램 플롯 결국 가치 및 EC ₅₀ 제공합니다.
8. 각 실험 데이터 분석을 위해 세 번 반복해야합니다.

4. 대표 결과 :

CHO - K1 세포로 표현하면, 모기 Aedes aegypti kinin 수용체는 multiligand 수용체와 같은 행동과 기능의 세 endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3 1 NM으로 낮은 농도에 응답, 단독 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석을 사용하여 테스트 . Aedae - K -, 얻은 힘의 순위의 순서가 Aedae - K - 3, 16.04 NM의 각 EC ₅₀ 값에 따라 Aedae - K - 3> Aedae - K - 2> Aedae - K - 1,라고 그림 1 보여줍니다 통계 (Pietrantonio 외., 2005) (P <0.05) 크게 달랐다 2, 26.6 NM 및 Aedae - K - 1, 48.85 NM.

우리는 또한 kinin 잔류물은 kinin 펩타이드 - 수용체 상호 작용에 대한 중요한 결정이 분석를 사용합니다. 곤충 kinin의 펩티드는 또한 핵심으로 알려진 생물 학적 활동에 필요한 최소한의 순서를 나타내는 C - 터미널 pentapeptide을 서로 나누세요. 표 1에서 kinin 펩타이드 코어 analogs는 핵심 kinin pentapeptide FFSWGa의 알라닌 대체 시리즈로 합성되었으며 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석 (타네 - Bageshwar 외., 2006)에 의해 테스트. 우리는 아미노산 PHE ¹ TRP ⁴ 두 수용체에 대한 곤충 kinins의 활동에 필수적인 것으로 나타났다.

분석은 또한 향상된 biostability위한 펩티드를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 표 2는 체크 재조합 kinin 수용체와 그림 2에서 테스트 아미노산 isobutyric 산성 (Aib)이있는 설계 kinin analogs은 칼슘에 의해 CHO - K1 세포 라인을 표현 틱 kinin 수용체 6 알파 - 아미노 isobutyric 산성 analogs의 활동 비교를 보여줍니다 보여줍니다 bioluminescence 플레이트 분석 (타네 - Bageshwar 외., 2009). hexapeptide 아날로그 FFFSWGa는 수용체 활동에 대한 긍정적인 제어에 추가됩니다. 아날로그 FF [Aib] WGA이 hexapeptide 제어 아날로그보다 적극적인 결과. 이 aminoisobutyric 산성 교체, [Aib] FF [Aib] WGA와 아날로그 (표 2 및 그림 2) 테스트를 두 번 교체 analogs 중 가장 강력했다.

이 분석이되었으며, Nachman 및 Pietantonio (2010), Nachman 외 볼 적용할 수있는 방법에 대한 더 많은 예제. (2009), 타네 - Bageshwar 외. (2008a), 그리고 타네 - Bageshwar 외. (2008b).

그림 1. Aedes의 견적은 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석하여 CHO - K1 E10 세포에 대한 효과적인 농도 (EC ₅₀₎ kinins. 농도 - 반응 곡선의 y 축은 각에 대한 관찰 최대한 응답의 백분율로 표시 bioluminescence 단위로부터 얻은 것입니다 펩타이드. 데이터 포인트는 세 독립적인 실험을하는 동안 얻은 여섯 복제의 평균을 나타냅니다. 바 표준 오류를 나타냅니다. (A) Aedae - K1 EC ₅₀ 추정은 = 48 NM. (B) Aedae - K2 EC ₅₀ 추정은 = 26 NM. (C) Aedae - K3 EC ₅₀ 추정은 = 16 NM. EC ₅₀ Aedae - K3 50 Aedae - K2 50 Aedae - K1, P는 <0.05. 통계 분석 및 그래프는 GraphPad의 프리즘 4.0 소프트웨어와 함께했다.

그림 2. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석하여 CHO - K1 세포 라인을 표현 체크 kinin 수용체 6 알파 - 아미노 isobutyric 산성 analogs의 활동 비교. y 축은 농도에서 관찰 bioluminescence의 백분율로 각 아날로그에 대한 퍼센트 최대한 bioluminescence 단위를 나타냅니다 각 아날로그에 대한 검사를 모든 농도 사이에 관찰 최대한의 반응 비교. 통계 분석 및 그래프는 GraphPad의 프리즘 4.0 소프트웨어와 함께 수행했다.

표 1. 추정 potencies (EC _50)와 진드기와 모기 수용체 transfected 세포 라인에 대한 테스트의 모든 펩티드의 최대한의 bioluminescence 응답 *.

* EC ₅₀ 반 최대한의 반응을 유도하는 데 필요한 농도를 추정하고있다. I : bioluminescence 응답 미만 300 단위 (벡터 전용 transfected 세포 수준) 인 경우 비활성. A : 펩타이드 FFSWGa에있는 각각의 물질 알라닌로 대체되었습니다 위치. ND : 아날로그가 테스트했지만 역시 매우 활성화되지 이하 molarities에 적극 아니었 따라서 EC50 결정 수 없습니다되었습니다.

표 2. 아미노산 isobutyric 산성 (Aib)이있는 Kinin analogs (K)는 체크 재조합 kinin 수용체에 대한 테스트. AC : 아세틸, α 나 : α - 메틸 페닐알라닌, β3F : β3 - 페닐알라닌, : 아미드.

우리는이 프로토콜을 사용하여 Arachnida (진드기, 진드기 및 스파이더), 틱 k​​inin 수용체에서 발견된 최초의 neuropeptide 수용체의 기능 특성을 수행할 수있었습니다. 이 방법은 세 가지 기본 애플 리케이션을했다. 첫째, 기술은 리간드 활동 측정을 통해 수용체 deorphanization에 대해 적용할 수 있습니다. 둘째, 분석은 리간드 - 수용체 구조 - 활동 관계 (SAR)을 해결할 수 있습니다. 셋째, 방법은 약물 발견에 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 거의 모든 GPCR에 agonists 또는 antagonists의 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 작은 도서관의 심사를 위해이 프로토콜을 적응하기 시작하고 있습니다. 우리가 활용 세포 라인은 유비 쿼터스 G 단백질 G ₁₆ 표현하지 않습니다. 우리는 그것이 필요하지 않았기 때문에 GQ 단백질과 세포내 칼슘 캐스케이드를 통해 arthropod kinin 수용체가 신호를 여기에 같이 그들은 포유 동물 세포에 신호 특성을 보존.

DRS. 코펜하겐 대학 (덴마크)에서 CJP Grimmelikhuijzen와 마이클 윌리엄슨은 aequorin이 플라스미드 제공을위한 감사합니다. 우리의 공동 작업자, ARS - USDA (TX, 미국)에서 박사 로널드 J. Nachman는 펩타이드 합성 및 NOVOstar 플레이트 리더를 제공 인정받고 있습니다.