Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

Questo protocollo fornisce le istruzioni per la selezione clonale di cellule di linea e un saggio di bioluminescenza di calcio per analizzare la struttura-attività di sintetizzata neuropeptidi artropodi sul loro affini GPCR. Questo test può essere utilizzato per deorphanization recettore e struttura-attività degli studi rapporto di sintesi per la progettazione analogica e peptide / farmaco-lead scoperta.

Recettori ormonali artropodi sono potenziali obiettivi per i pesticidi romanzo come si regolano molti processi fisiologici e comportamentali indispensabili. La maggior parte di essi appartengono alla superfamiglia delle proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR). Ci siamo concentrati sulla caratterizzazione artropodi recettori chinina da zecche e zanzare. Chinine artropodi sono neuropeptidi polifunzionale con myotropic, diuretico, e la funzione dei neurotrasmettitori. Qui, un metodo per l'analisi sistematica delle relazioni struttura-attività di chinine insetti su due eterologa chinina che esprimono i recettori sistemi è descritto. Forniamo informazioni importanti per lo sviluppo di analoghi biostabile chinina con la possibilità di interrompere il diuretico, myotropic, e / o processi digestivi a zecche e zanzare.

I recettori chinina dalla zecca del sud bestiame, Boophilus Microplus (Canestrini), e la zanzara Aedes aegypti (Linneo), sono stati stabilmente espressi nella linea cellulare di mammifero CHO-K1. Analisi funzionale di questi recettori sono stati completati con un saggio di bioluminescenza calcio piastra che misura bioluminescenza per determinare i livelli intracellulari di calcio citoplasmatico su richiesta peptide a queste cellule ricombinanti. Questo metodo sfrutta la proteina aequorina, un fotoproteine ​​isolato da meduse luminescenti. Noi trasfettate transitoriamente la aequorina plasmide (mtAEQ/pcDNA1) in linee cellulari che stabilmente espresso i recettori chinina. Queste cellule sono poi trattate con il coelenterazine cofattore, che complessi con aequorina intracellulare. Rompe questo legame, in presenza di calcio, che emettono i livelli di luminescenza indicativo della concentrazione di calcio. Come il recettore chinina segnali attraverso il rilascio di calcio intracellulare, l'intensità del segnale è legato alla potenza del peptide.

Questo protocollo è una sintesi di diversi protocolli precedentemente descritti, con modificazioni, presenta passo-passo le istruzioni per l'espressione stabile di GPCR in una linea cellulare di mammifero attraverso saggi piastra funzionale (Staubly et al, 2002 e Scuderie et al, 1997.. ). Utilizzando questa metodologia, siamo stati in grado di stabilire linee cellulari stabili che esprimono la zanzara ei recettori zecca chinina, confrontare la potenza di tre chinine zanzara, identificare critica posizioni di aminoacidi per il ligando-recettore, ed eseguire semi-throughput screening di un peptide biblioteca. Perché chinine insetti sono sensibili alla rapida degradazione enzimatica da parte di peptidasi endogene, sono fortemente limitate in uso come strumenti per il controllo dei parassiti o studi endocrinologici. Pertanto, abbiamo provato anche gli analoghi chinina amminoacido isobutirrico (Aib) per migliorare la loro potenza e biostabilità. Questo peptidasi-resistente analogica rappresenta una guida importante per lo sviluppo di analoghi biostabile chinine insetti e può contribuire allo sviluppo di strategie di artropodi neuropeptide controllo basato su.

1. Creazione di linee cellulari stabili

1. Clonare il vostro GPCR di interesse e inserirlo in un vettore di espressione che incorpora un 5 'sequenza consenso Kozak (AMCC / GCCATGG) intorno al codone di inizio per la ottimale legame ribosomiale in un sistema di mammifero (Kozak, 1986). Qui usiamo il pcDNA3.1/Bm-KR plasmide per il recettore zecca chinina, e il plasmide pcDNA3.1/Aedae-KR per il recettore zanzara chinina (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. Il pcDNA3.1 (-) vettore codifica resistenza all'ampicillina per la selezione di batteri e neomicina (G418) resistenza per la selezione in cellule di mammifero.
2. Crescere CHO-K1 celle vuote (senza plasmidi) (ATCC, Manassas, VA, USA) o altri linea cellulare desiderato in un T-25 pallone (BD Falcon) a 37 ° C in un 5% di CO ₂ umidificata incubatore (Holmes et al ., 2003). Tutte le incubazioni più dovrebbe essere fatto in queste condizioni se non diversamente specificato. Mantenere le celle vuote nel mezzo di crescita (media F12K con il 10% di siero fetale bovino) con 1X antibiotici Antimicotici (Invitrogen, CA).
3. Per dividere le celle, riscaldare tutte le soluzioni a 37 ° C. Rimuovere vecchi media nel T-25 pallone e lavare con 5 ml di PBS e quindi rimuovere PBS. Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml di PBS-tripsina-EDTA (34 ml di PBS, 2 ml di bicarbonato di sodio 7,5%, 4 ml 10X tripsina-EDTA) per 2 min. Aggiungere 3 ml di mezzo e aspirare media su e giù per miscelare cellule. Trasferimento di media con le cellule in una provetta conica e centrifugare per 2 min a ~ 200-300 g (1.000 rpm). Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di mezzo. Diluire le cellule risospese ad una concentrazione di 1:5 o 1:10 con terreno fresco e trasferire 5 ml in una nuova T-25 pallone.
4. Dopo che le cellule crescono sani (circa 2-3 giorni), il seme CHO-K1 cellule in fiasche tessuto T-25 cultura e farle crescere durante la notte nel mezzo di crescita senza antibiotici fino a circa il 30% confluenti (circa 18 ore). Il grado di confluenza può essere determinato dalle cellule sotto osservazione invertita microscopia a fluorescenza.
5. Preparare le miscele seguenti per ogni campione:
   1. Combina 1-2 DNA mcg (esempio: 4μl uso di 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) con 100 l Opti-MEM ho ridotto Media siero (Invitrogen).
   2. Mix 6 Reattivo microlitri Lipofectin (InvitrogenTM) in 100 l di media F12K siero libero, facendo un rapporto 1:1 di Lipofectin al DNA. Incubare a temperatura ambiente per 30-45 min.
   Mescolare delicatamente le soluzioni da 1.5.1 a 1.5.2 in una goccia a goccia moda (volume totale = 200 mL). Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10-15 min.
6. Rimuovere il supporto di vecchia crescita dalle cellule e lavare le cellule con 5 ml di mezzo F12K siero libero e poi rimuovere il supporto di F12K siero libero. In un tubo da 15 ml, mescolare delicatamente la miscela di trasfezione in 1,8 ml di medium F12K fresco in un goccia a goccia moda. Allora, lavate le cellule dal punto 1.5 con PBS e aggiungere questa nuova soluzione di trasfezione per le cellule. Incubare per 18 ore.
7. Modificare il medio F12K medio più il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici e incubare una notte. Dividere le celle in due T-25 palloni di media F12K più il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici per altre 18 ore (per la divisione delle celle si prega di vedere il punto 1.3).
8. Sostituire la media con terreno selettivo (media F12K più 10% di siero fetale bovino con 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Coltura le cellule utilizzando il terreno selettivo per 3-4 settimane. Nel corso del tempo questo selezionerà per le cellule che hanno incorporato il plasmide stabilmente nel loro DNA genomico. Continuare a mantenere le cellule utilizzando terreno di mantenimento (media F12K più 10% di siero fetale bovino con 400μg/ml GENETICIN). Periodicamente congelare linee cellulari con rapporto 1:1 dei supporti di congelamento (terreno selettivo con il 20% DMSO) per evitare che perde in caso di contaminazione inattese.
9. Selezione clonale linee cellulari: in una prima fase, trypsinize e centrifugare le cellule a partire dal punto 1.8 con terreno di mantenimento come al punto 1.3. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzo di manutenzione, prendere 0,5 ml della cellula sospendere e aggiungere 4,5 ml di terreno di mantenimento fresca per fare una diluizione 10x. Trasferire la diluizione 10x in 12 pozzetti di una piastra 96 ​​pozzetti, aggiungendo 100 l in ciascun pozzetto di selezionare per le singole cellule.
10. Continuare a fare 10x diluizioni seriali di queste cellule per una sospensione teorica finale di una cella per 100 l (di solito la diluizione finale sarà nel range di 10 ^-11 e 10 ^-19; il numero totale di 10x diluizioni seriali è ^~ 19) . Subito dopo ogni diluizione, trasferire 100 ul della diluizione in 12 pozzetti della piastra 96 ​​pozzetti. Dopo 18 ore di incubazione, osservare Piastre a 96 pozzetti sotto una luce invertito o pozzi microscopio a fluorescenza e marchio che sembrano contenere solo una singola cella o contenere due celle che, ovviamente, divisi da una sola cellula. Mantenere l'osservanza di ogni giorno e medie cambiano ogni tre giorni.
11. Quando i pozzi sono 80% confluENT (circa una settimana), lavare i pozzi contrassegnati con 200 l di PBS e trypsinize con 100 l di PBS-tripsina-EDTA soluzione. Cellule trasferimento da ciascuno segnato anche in un pozzetto di un 6-pozzetti con 1 ml di mezzo di manutenzione. Crescere queste cellule per 3 giorni poi trasferire le cellule in singoli T25 pallone. Test di queste cellule mediante il test bioluminescenza calcio con peptidi agonisti (vedere la sezione 2).
12. Selezionare 1 linea cellulare da 1,11 passo con la più alta risposta al saggio di bioluminescenza piatto di calcio e di eseguire per la seconda volta la singola cellula seguenti passaggi selezione 1,9-1,11. Periodicamente congelare linee cellulari.
13. Dalla selezione secondario descritto al punto 1.12, scegliere 2-3 linee cellulari con la più alta risposta nel saggio piatto calcio bioluminescenza e mantenerli in coltura per ulteriori test calcio bioluminescenza piatto. Tenere traccia dei numeri passaggio. Di tanto in tanto, congelare linee cellulari da primi passaggi in modo che si può sempre tornare indietro a loro se le linee cellulari con più passaggi fermare l'esecuzione in modo coerente.

2. Il calcio bioluminescenza saggio piatto

1. Legare il gene reporter di interesse in un vettore di espressione. Qui abbiamo usato mtAEQ/pcDNA1 plasmide aequorina (un dono di Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson, Università di Copenhagen, Danimarca). Trasformare il plasmide in E. coli MC1061/PS (Invitrogen) e purificare usando un QIAprep giro miniprep kit (Qiagen Inc.). Nella fase finale eluire il plasmide con Tris buffer senza EDTA, non l'acqua.
2. Crescono linee cellulari a partire dal punto che esprimono il recettore 1,13 desiderato in terreno di mantenimento. Quando le cellule sono il 90% confluenti, trypsinize, centrifuga e poi ri-sospendere le cellule in 5 ml di terreno di mantenimento come al punto 1.3. Diluire le cellule (circa 10x con terreno di mantenimento) e contare il numero di cellule con cellule contatore (Bright-line emocitometro) al microscopio. Regolare il numero di cellulare di circa 2 x 10 ⁵ cellule / ml (media 20 celle in uno dei 9 quadrati mostrato nel emocitometro). Seed 2 celle ml diluito in media in ciascun pozzetto di una piastra ben sei. Incubare per 24 ore (le cellule dovrebbe raggiungere circa il 60% dopo la confluenza di incubazione).
3. Cambiare supporto nella piastra 6 pozzi a OPTI-MEM medium. Per ogni bene, mescolare 96 microlitri OPTI-MEM con 4 microlitri FuGENE 6 reagente Transfection (Biochemicals Roche) in una provetta per microcentrifuga e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 mg di aequorina / pcDNA 1 DNA plasmidico in ciascuna provetta e poi delicatamente agitare il campione per 1 min, incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Aggiungi ciascuna miscela in ciascun pozzetto in modo goccia a goccia, mentre scuotendo leggermente la piastra bene. Incubare le piastre per 6 ore e mezzo per cambiare il F12K terreno contenente 10% di siero fetale bovino senza antibiotico.
4. Dopo aver incubato le cellule in sei pozzetti per 24 ore, trypsinize, centrifuga e risospendere le cellule come punto 1.3. Contare il numero di cellulare a 400.000 cellule / ml come passo 2.1 e trasferire 100 ul (totale 40.000 cells/100 microlitri) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo bianco sottile microtitolazione (Costar 3610). Incubare per altre 24 ore fino a circa l'80% confluenza delle cellule. Questa è la concentrazione ottimale di cellule per l'analisi bioluminescenza.
5. Preparare 90μl/well di un calcio senza mezzi DMEM (Invitrogen) contenente 5 coelenterazine mM (Invitrogen) al buio (coelenterazine è sensibile alla luce). Prendete il piatto da 2,4, rimuovere i supporti vecchi e aggiungere questo 90μl in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 3 ore al buio a 37 ° C e 5% di CO _2, dopo che le cellule nella piastra sono pronti per essere testati.

3. Strumento funzionamento e l'analisi dei dati

1. Ogni lettore di piastre bioluminescenza è diverso. Realizziamo i nostri test con un (Labtechnologies BMG) lettore di piastre Novostar in modalità bioluminensence. Se si utilizza uno strumento diverso, è necessario adattare il protocollo.
2. Purge le pompe piastra lettore (o POMPE PRIME) prima dell'uso. Spegnere la luce nella stanza prima di mettere la piastra sul portatarga. Una volta che il portatarga ha chiuso, accendere le luci.
3. Solubilizzare peptidi (in un tubo Eppendorf da 1,5 ml) nel calcio senza mezzi DMEM. Impostare la "Profondità Aspirare" e "Determinazione di posizione" della soluzione di peptide prima dell'uso. Sfida le cellule con 10 microlitri (10x) di concentrazioni variabili dei peptidi (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, o altro peptide desiderato) e immediatamente iniziare a registrare l'emissione luminosa. Abbiamo impostato lo strumento per registrare l'emissione di luce (465 nm) per ogni bene ogni 2 secondi per un tempo totale di 50 secondi.
4. Assicurati di includere un controllo positivo, come un attivo analogico (analogico FFFSWGa è stato utilizzato, Taneja-Bageshwar et al., 2009) e un controllo negativo come le cellule trasfettate solo vettore. Il controllo negativo sarà necessario durante l'analisi dei dati per impostare la soglia di riferimento (vedi risultati rappresentativi).Un estraneo, peptide inattivo può anche essere aggiunto come controllo negativo.
5. Dopo la corsa è terminata, lavare la pompa strumento (o POMPE PRIME) e poi inserire il vostro campione successivo peptide. Salvare i dati e lavare le pompe di nuovo.
6. Il trattamento dei dati: Trasferire i dati di emissione di luce da ogni bene in un foglio dati di Microsoft Excel.
7. Incollare i dati da Excel a software Prism 4.0 da GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). Le concentrazioni di peptide vari è l'asse X e unità bioluminescenza è l'asse Y. Per normalizzare i dati, la trama di un registro curva di risposta. Selezionare una curva di analisi di regressione lineare in forma (sigmoidale dose-risposta equazione con pendenza variabile) per ottenere curve concentrazione-risposta per ciascun peptide. Il programma traccia i valori, alla fine, e dà la CE _50.
8. Ogni esperimento deve essere ripetuto tre volte per l'analisi dei dati.

4. Rappresentante dei risultati:

Quando espressa in cellule CHO-K1, la zanzara Aedes aegypti recettore chinina si è comportato come un recettore multiligand e funzionalmente risposto a concentrazioni fino a 1 nM del endogenours tre Aedes chinine, Aedae chinine 1-3, testato singolarmente usando la bioluminescenza saggio di calcio piastra . La Figura 1 mostra che l'ordine rango di potenza è stato ottenuto Aedae-K-3> Aedae-K-2> Aedae-K-1, sulla base dei rispettivi valori di EC ₅₀ Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM e Aedae-K-1, 48,85 nM, che sono state differenze statisticamente significative (P <0,05) (Pietrantonio et al., 2005).

Abbiamo anche usato questo test per determinare quali residui di chinina sono fondamentali per la chinina peptide-recettore. Insetti peptidi chinina condividere un C-terminale pentapeptide che rappresenta la sequenza di minimi necessari per l'attività biologica, noto anche come nucleo. Nella tabella 1, la chinina analoghi nucleo peptidi sono stati sintetizzati come una serie sostituzione Alanina della chinina nucleo pentapeptide FFSWGa e testato da un test piastra di calcio bioluminescenza (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Abbiamo scoperto che gli aminoacidi Phe Trp ¹ e ⁴ sono stati essenziali per l'attività delle chinine insetti per entrambi i recettori.

Il test può anche essere utilizzato per testare peptidi progettato per biostabilità migliorata. La tabella 2 mostra gli analoghi progettato chinina contenenti aminoacidi isobutirrico (Aib), testato sul recettore tick ricombinante chinine e la Figura 2 mostra il confronto l'attività di sei alfa-amino acido isobutirrico analoghi sul recettore chinina tick esprimere CHO-K1 linea cellulare da un calcio bioluminescenza saggio piastra (Taneja-Bageshwar et al., 2009). Il esapeptide analogico FFFSWGa è aggiunto per un controllo positivo per l'attività del recettore. L'analogo FF [Aib] WGA portato più attivi di questo controllo analogico esapeptide. L'analogo con due sostituzioni acido aminoisobutyric, [Aib] FF [Aib] WGA, è stato il più potente della doppia sostituzione analoghi testate (Tabella 2 e Figura 2).

Per ulteriori esempi di come questo saggio è stata e può essere applicato vedere Nachman e Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), e Taneja-Bageshwar et al. (2008b).

Figura 1. Stima di Aedes chinine concentrazione efficace (CE ₅₀₎ su cellule CHO-K1 E10 da un calcio-bioluminescenza saggio piatto. L'asse y nel curve concentrazione-risposta è stato ottenuto da unità di bioluminescenza, espressa in percentuale della risposta massima osservata per ogni peptide. Punti dati rappresentano la media di sei repliche ottenute nel corso di tre esperimenti indipendenti. Barre rappresentano l'errore standard. (A) Stima della Aedae-K1 EC ₅₀ = 48 nM. (B) Stima del Aedae-K2 EC ₅₀ = 26 nM. (C) Stima del Aedae-K3 EC ₅₀ = 16 nM. EC ₅₀ Aedae-K3 50 Aedae-K2 50 Aedae-K1, p <0,05. Analisi statistiche e grafici sono stati con il software Prism GraphPad 4.0.

Figura 2. Confronto l'attività di sei alfa-amino acido isobutirrico analoghi sul recettore tick kinin esprimere CHO-K1 linea cellulare da un saggio di piatto calcio bioluminescenza. L'asse y rappresenta la massima unità di bioluminescenza per cento per ogni analogico espressa in percentuale di bioluminescenza osservato una concentrazione rispetto alla risposta massima osservata tra tutte le concentrazioni testate per ciascun analogico. Analisi statistiche e grafici sono stati eseguiti con il software Prism GraphPad 4.0.

Tabella 1. Potenze stimato (CE ₅₀₎ e la risposta bioluminescenza massima di tutti i peptidi testati su zecche e zanzare linee cellulari transfettate recettore *.

* L'EC ₅₀ stime la concentrazione necessaria per indurre una mezza massima risposta. I: inattivo se la risposta bioluminescenza è inferiore a 300 unità (livello del vettore solo cellule transfettate). R: La posizione in cui il residuo corrispondente nella FFSWGa peptide è stato sostituito da alanina. ND: L'analogico è stato testato, ma era o non era molto attivo o non attivo a basse molarità, quindi un EC50 non può essere determinato.

Tabella 2. Chinina analoghi (K) che contiene aminoacidi isobutirrico (Aib), testato sul recettore tick ricombinante chinina. Ac: acetil; α me: α metil-fenilalanina; β3F: β3-fenilalanina, un: ammide.

Siamo stati in grado di eseguire la caratterizzazione funzionale del recettore del neuropeptide scoperto dal Aracnidi (zecche, acari e ragni), il recettore chinina zecca, con questo protocollo. Questo metodo ha tre applicazioni principali. In primo luogo, la tecnica può essere applicata per deorphanization recettore attraverso misurazioni dell'attività ligando. In secondo luogo, il test può risolvere ligando-recettore relazioni struttura-attività (SAR). In terzo luogo, i metodi possono essere utilizzati nella scoperta della droga. Inoltre, questo protocollo può essere usato per studiare l'attività di agonisti o antagonisti su quasi tutti i GPCR. Stiamo cominciando ad adattare questo protocollo per lo screening di librerie di piccole dimensioni. La linea cellulare abbiamo utilizzato non esprime la proteina onnipresente G G _16. Non abbiamo bisogno perché artropodi recettori chinina segnale attraverso le proteine ​​Gq e la cascata di calcio intracellulare e conservano questa proprietà di segnalazione in cellule di mammifero come mostrato qui.

Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson presso l'Università di Copenaghen (Danimarca) sono apprezzati per fornire le aequorina plasmide. Il nostro collaboratore, il dottor Ronald J. Nachman da USDA-ARS (TX, USA), è riconosciuto per la sintesi di peptidi e per fornire il lettore di piastre Novostar.