Method Article
هذا البروتوكول يوفر إرشادات لاختيار الخط نسيلي الخلية ومقايسة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم لتحليل العلاقات بين الهيكل والنشاط من نيوروببتيد المفصلية توليفها على GPCRs المشابهة لها. ويمكن استخدام هذا الاختبار لمستقبلات deorphanization والدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط التمثيلي للتصميم الصناعي والببتيد / المخدرات يؤدي الاكتشاف.
مستقبلات هرمون المفصلية هي الاهداف المحتملة لمبيدات الآفات الرواية كما أنها تنظم العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية والسلوكية. الغالبية منهم ينتمون إلى الفصيلة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs). فقد ركزنا على المستقبلات التي تميز كاينين المفصلية من القراد والبعوض. kinins المفصلية هي نيوروببتيد متعددة الوظائف مع myotropic ، مدر للبول ، ووظيفة الناقلات العصبية. هنا ، وهي طريقة لتحليل منهجي لهيكل والنشاط علاقات kinins الحشرات على كاينين غيروي two مستقبلات معربا عن النظم الموصوفة. ونحن نقدم معلومات مهمة ذات الصلة لوضع النظير كاينين biostable مع احتمال تعطيل مدر للبول ، myotropic ، و / أو عمليات الهضم في القراد والبعوض.
وأعرب عن ستابلي المستقبلات كاينين من قراد الأبقار جنوب العلس المتثني (Canestrini) ، وبعوض الزاعجة البعوض (لينيوس) ، في خط خلايا الثدييات CHO - K1. تم الانتهاء من التحليلات الفنية لهذه المستقبلات تلألؤ بيولوجي باستخدام لوحة فحص الكالسيوم الذي يقيس تلألؤ بيولوجي داخل الخلايا لتحديد مستويات الكالسيوم وبناء على طلب السيتوبلازمية الببتيد لهذه الخلايا المترابطة. هذا الأسلوب يستفيد من البروتين aequorin ، وهي معزولة عن photoprotein القناديل الانارة. نحن transfected عابر للaequorin البلازميد (mtAEQ/pcDNA1) في خطوط الخلايا التي عبرت عن ستابلي المستقبلات كاينين. ثم عولجت هذه الخلايا مع coelenterazine العامل المساعد ، والتي المجمعات مع aequorin داخل الخلايا. هذه السندات فواصل في وجود الكالسيوم ، التي تنبعث منها مستويات التلألؤ يدل على تركيز الكالسيوم. كما مستقبلات كاينين إشارات من خلال إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا ، وترتبط شدة إشارة إلى قوة من الببتيد.
هذا البروتوكول هو تجميع لعدة بروتوكولات مع التعديلات التي سبق وصفها ، بل يقدم خطوة بخطوة تعليمات للتعبير مستقرة GPCRs في خط خلايا الثدييات من خلال فحوصات لوحة فنية (Staubly وآخرون ، 2002 واسطبلات وآخرون ، 1997. ). باستخدام هذه المنهجية ، كنا قادرين على وضع خطوط الخلية مستقرة معربا عن البعوض والقراد المستقبلات كاينين ، قارن وقوة kinins البعوض الثلاثة ، تحديد المواقف الحرجة من الأحماض الأمينية للتفاعل يجند مستقبلات ، وأداء شبه سرعة فحص الببتيد المكتبة. لأن الحشرات kinins عرضة للتدهور السريع الأنزيمية التي peptidases الذاتية ، فهي محدودة في استخدامها كأدوات لمكافحة الآفات أو دراسات الغدد الصماء. ولذلك ، فإننا أيضا اختبار النظير كاينين تحتوي على الحمض الأميني isobutyric (AIB) لتعزيز قوتها وbiostability. هذا التناظرية ببتيداز المقاوم يمثل تؤدي مهمة في تطوير biostable النظير الحشرات وكاينين قد تساعد في تطوير neuropeptide القائم على استراتيجيات مكافحة المفصليات.
1. إنشاء خطوط الخلية مستقرة
2. لوحة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم مقايسة
3. عملية الصك وتحليل البيانات
4. ممثل النتائج :
تصرفت الزاعجة البعوض مستقبلات كاينين بعوض عند المعبر عنها في خلايا K1 CHO ، على مستقبلات multiligand وأجاب وظيفيا لتركيزات منخفضة تصل إلى 1 نانومتر من kinins three الزاعجة endogenours ، Aedae kinins 1-3 ، واختبارها باستخدام لوحة منفردة تلألؤ بيولوجي فحص الكالسيوم . الشكل 1 يبين أن النظام رتبة الفاعلية التي حصل عليها Aedae - K - 3> Aedae - K - 2> Aedae - K - 1 ، استنادا إلى قيم كل من المفوضية الأوروبية 50 - 3 - K Aedae ، 16.04 نانومتر ؛ Aedae - K - 2 ، 26.6 نانومتر ، وAedae - K - 1 ، 48.85 نانومتر ، والتي كانت تختلف اختلافا كبيرا إحصائيا (P <0.05) (Pietrantonio وآخرون ، 2005).
علينا أيضا أن تستخدم هذا الاختبار لتحديد بقايا كاينين حاسمة للتفاعل مستقبلات الببتيد كاينين. الحشرات الببتيدات كاينين مشاركة خماسي الببتيد C - المحطة التي تمثل الحد الأدنى من تسلسل المطلوبة للنشاط بيولوجي ، والمعروف أيضا باسم الأساسية. في الجدول رقم 1 ، تم توليفها جوهر الببتيد كاينين النظير باعتبارها سلسلة من استبدال ألانين FFSWGa الأساسية خماسي الببتيد كاينين واختبارها من قبل لوحة فحص الكالسيوم تلألؤ بيولوجي (تانيجا - Bageshwar وآخرون ، 2006). وجدنا أن الأحماض الأمينية الفنيل ألانين 1 و 4 التربتوفان كانت ضرورية لنشاط الحشرات kinins لكل من المستقبلات.
في مقايسة يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار الببتيدات المصممة لتعزيز biostability. ويبين الجدول 2 النظير تصميم كاينين التي تحتوي على حمض أميني isobutyric (AIB) اختباره على مستقبلات القراد كاينين المؤتلف ويبين الشكل 2 مقارنة النشاط ستة ألفا الأمينية حمض isobutyric النظير على القراد مستقبلات كاينين معربا عن CHO - K1 خط خلية من الكالسيوم تلألؤ بيولوجي مقايسة لوحة (تانيجا - Bageshwar وآخرون ، 2009). يضاف hexapeptide التناظرية FFFSWGa لمراقبة إيجابية لنشاط مستقبلات. أدى التناظرية FF [AIB] WGA أكثر نشاطا من هذا التحكم التناظرية hexapeptide. كان التناظرية مع اثنين من البدلاء حمض aminoisobutyric ، [AIB] FF [AIB] WGA ، وأقوى من النظير المزدوج استبدال اختبار (الجدول 2 والشكل 2).
لمزيد من الأمثلة عن كيفية هذا الاختبار قد تم ويمكن تطبيق رؤية نحمان وPietantonio (2010) ، نحمان وآخرون. (2009) ، تانيجا - Bageshwar وآخرون. (2008a) ، وتانيجا - Bageshwar وآخرون. (2008b).
الشكل 1. تقدير الزاعجة kinins التركيز الفعال (EC 50) على الخلايا CHO K1 - E10 بواسطة فحص لوحة الكالسيوم تلألؤ بيولوجي. تم الحصول على المحور الصادي في منحنيات التركيز والاستجابة من وحدات تلألؤ بيولوجي كنسبة مئوية من الحد الأقصى لوحظ استجابة لكل الببتيد. نقاط البيانات تمثل المتوسط ستة يعيد تم الحصول عليها خلال ثلاث تجارب مستقلة. أشرطة تمثل الخطأ المعياري. (أ) تقدير Aedae - K1 EC 50 = 48 نانومتر. (ب) تقدير Aedae K2 - EC 50 = 26 نانومتر. (ج) تقدير Aedae K3 - EC 50 = 16 نانومتر. EC - 50 Aedae K3 50 Aedae K2 50 Aedae - K1 ، P <0.05. والتحليل الإحصائي والرسوم البيانية مع برنامج بريزم 4.0 GraphPad.
الشكل 2. مقارنة النشاط ستة ألفا الأمينية حمض isobutyric النظير على مستقبلات القراد كاينين معربا عن CHO - K1 خط خلية لوحة فحص الكالسيوم تلألؤ بيولوجي ، والمحور الصادي يمثل الوحدات في المئة تلألؤ بيولوجي القصوى لكل التناظرية كنسبة مئوية من تلألؤ بيولوجي لوحظ عند تركيز مقابل الاستجابة القصوى لوحظ بين جميع التركيزات اختبار لكل التناظرية. وأجريت التحليلات الإحصائية والرسوم البيانية مع بريزم GraphPad 4.0 البرمجيات.
قراد مستقبلات خط الخلية | خط البعوض مستقبلات الخلية | |||
الببتيد | EC 50 (نانومتر) | تلألؤ بيولوجي الاستجابة القصوى في 1 ملم | EC 50 (نانومتر) | تلألؤ بيولوجي الاستجابة القصوى في 1 ملم |
AFSWGa | أنا | أنا | أنا | أنا |
FASWGa | 586 | 5600 | ND | 400 |
FFAWGa | 64 | 12800 | 621 | 3050 |
FFSAGa | أنا | أنا | أنا | أنا |
FFSWAa | 417 | 10600 | 2800 | 1830 |
FFSWGa | 590 | 10800 | ND | 525 |
FSWGa | أنا | أنا | أنا | أنا |
FFSWa | أنا | أنا | أنا | أنا |
FFSWG - OH | أنا | أنا | أنا | أنا |
FFFSWGa | 259 | 13000 | 562 | 10000 |
FF [AIB] WGA | 29 | 12700 | 445 | 9300 |
الجدول 1. potencies المقدرة (EC 50) واستجابة القصوى تلألؤ بيولوجي من الببتيدات جميع اختبارها على القراد والبعوض مستقبلات الخلية خطوط transfected *.
* وتشير تقديرات المفوضية الأوروبية 50 في التركيز المطلوب للحث على الاستجابة نصف القصوى. الأول : الاستجابة النشطة إذا تلألؤ بيولوجي أقل من 300 وحدة (مستوى ناقلات فقط خلايا transfected). ج : إن الموقف حيث تم استبدال بقايا منها في FFSWGa الببتيد بواسطة ألانين. ND : تم اختبار التناظرية ولكن إما غير نشطة جدا أو لم يكن أقل نشاطا في molarities ، وبالتالي لا يمكن أن تحدد أن هناك EC50.
K - AIB - 1 | [AIB] FF [AIB] WGA |
K - AIB - 2 | [α MEF] FF [AIB] WGA |
K - AIB - 3 | AC - R [AIB] FF [AIB] WGA |
K - AIB - 4 | AC - R [β3F] FF [AIB] WGA |
K - AIB - 5 | [AIB] RFF [AIB] WGA |
K - AIB - 6 | [AIB - AIB - AIB - AIB] RFF [AIB] WGA |
الجدول 2. كاينين النظير (K) التي تحتوي على حمض أميني isobutyric (AIB) اختباره على مستقبلات القراد كاينين المؤتلف. ميلان : الاسيتيل ؛ α البيانات : α الميثيل فينيلالاناين ؛ β3F : β3 - فينيلالاناين ؛ أ : أميد.
كنا قادرين على تنفيذ التوصيف الوظيفي لمستقبلات neuropeptide first اكتشف من العناكب (القراد والعث والعناكب) ، ومستقبلات كاينين القراد ، وذلك باستخدام هذا البروتوكول. هذا الأسلوب ثلاثة طلبات الابتدائي. أولا ، يمكن تطبيق هذه التقنية للمستقبل من خلال قياسات deorphanization النشاط يجند. ثانيا ، يمكن للمقايسة حل يجند مستقبلات العلاقات بين الهيكل والنشاط (ريال سعودي). ثالثا ، يمكن استخدام الأساليب في اكتشاف الأدوية. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة نشاط منبهات أو الخصوم على GPCR أي تقريبا. بدأنا على التكيف مع هذا البروتوكول للفحص من المكتبات الصغيرة. خط خلية تستخدم نحن لا يعبر عن بروتين موجود في كل مكان G G 16. لم نكن بحاجة لأن المفصليات مستقبلات كاينين إشارة من خلال بروتين (جي كيو) وتتالي الكالسيوم داخل الخلايا والحفاظ على هذه الخصائص التي يشير في خلايا الثدييات كما هو موضح هنا.
الدكاترة. هي محل تقدير ويليامسون CJP Grimmelikhuijzen مايكل من جامعة كوبنهاغن (الدنمارك) لتوفير aequorin البلازميد. ومن المسلم به متعاون لدينا ، والدكتور رونالد J. نحمان من ARS - USDA (تكساس ، الولايات المتحدة) ، لتخليق الببتيد وتقديم للقارئ لوحة NOVOstar.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
CHO - K1 الخلايا | ATCC | CCL - 61 | ماناساس ، فرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. |
F12K المتوسطة | Invitrogen | 21127 | |
المصل البقري الجنين | سيغما الدريخ | F0643 | |
التربسين - EDTA (10X) | Invitrogen | 15400 | |
مضاد فطري للمضادات الحيوية | Invitrogen | 15240 | |
OPTI - MEM انخفاض أنا متوسطة المصل | Invitrogen | 31985 | |
Lipofectin الكاشف | Invitrogen | 18292-011 | |
GENETICIN | Invitrogen | 10131035 | |
MC1061/P3 Ultracomp | Invitrogen | C663 - 03 | |
QIAprep تدور عدة miniprep | شركة Qiagen | 19064 | |
FuGENE كاشف ترنسفكأيشن 6 | روش | 11 814 443 001 | |
96 - جيدا بيضاء رقيقة أسفل لوحة microtitere | Costar | 3610 | |
الكالسيوم الخالية من وسائل الاعلام DMEM | Invitrogen | 21068 | |
Coelenterazine | Invitrogen | C - 2944 | |
مشرق الخط عدادة الكريات | Hausser العلمية | هورشام ، والسلطة الفلسطينية | |
NOVOstar | Labtechnologies BMG | ||
المنشور البرمجيات 4.0 | GraphPad شركة برمجيات | سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. | |
T - 25 و T - 75 قوارير | فالكون دينار بحريني | 353014 و353135 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved