Мышиная модель расслоения грудной аорты, индуцированного пероральной инфузией β-аминопропионитрила и подкожного ангиотензина II

Этот протокол предусматривает подробную пошаговую процедуру индукции расслоения грудного отдела аорты у мышей. В частности, он включает в себя точный расчет необходимых доз β-аминопропионитрила и ангиотензина II, процедуру наполнения осмотическим насосом и технику имплантации осмотического насоса.

Расслоение грудной аорты (ТАД) является смертельным сердечно-сосудистым заболеванием, которое не поддается эффективному лечению. Воспроизведение животных моделей патофизиологии ТАД имеет важное значение для изучения внутренних механизмов ТАД. Широко используемая модель TAD, индуцированная β-аминопропионитрилом (BAPN, необратимый и перорально активный ингибитор лизилоксидазы) у мышей, имеет ограничение, заключающееся в непостоянной частоте успеха. В этом протоколе подробно описана модифицированная мышиная модель ТАД, индуцированной пероральным приемом БАТН в сочетании с подкожной инфузией ангиотензина II (Ang II). После четырех недель введения БАТН с последующей инфузией Ang II в течение 24 ч была надежно индуцирована мышиная модель с характеристиками, аналогичными человеческому ТАД, и вероятность успешного построения модели ТАД значительно улучшилась. Пероральный прием BAPN ингибирует сшивку эластина и коллагена, что приводит к разрушению структуры стенки аорты и в определенной степени индуцирует образование дилатации и расслоения аорты. Последующая индукция Ang II еще больше усугубляет дегенерацию стенки аорты, тем самым способствуя возникновению ТАД. Следовательно, комбинация BAPN и Ang II представляет собой усовершенствованный подход к построению мышиной модели TAD, предлагая ценный инструмент для изучения патогенеза и потенциальных терапевтических подходов к TAD.

Расслоение грудной аорты (ТАД) – это серьезное заболевание аорты, вызванное разрывом интимы из-за кровотечения в стенке грудной аорты, в результате которого слои стенки аорты отрываются, кровь попадает в среду стенки аорты, образуя ложный просвет и вызывая давление на истинный просвет ^1,2,3. Эпидемиологические исследования показывают, что заболеваемость ТАД составляет от 7 до 9 случаев на 100 000 человек в^год4. В настоящее время считается, что патогенез ТАД обусловлен аномальной структурой и гемодинамикой среднего звена аорты, а такие факторы, как гипертония, дислипидемия и наследственные сосудистые заболевания, увеличивают риск развития ТАД⁵. Хирургическое вмешательство остается основным вариантом лечения ТАД. Тем не менее, в связи с высокими периоперационными рисками, изучение патогенеза ТАД и методы раннего вмешательства для задержки его прогрессирования имеют существенное значение для улучшения прогноза ТАД. Поскольку получить человеческие образцы и провести эксперименты непосредственно на людях очень сложно, необходимо создать животные модели ТАД, которые имитируют характеристики человеческого ТАД.

За последние несколько десятилетий было широко известно о многих животных моделях аневризмы аорты (АА). Тем не менее, до сих пор существует мало исследований по созданию моделей TAD; некоторые исследователи даже считают ТАД побочным продуктом животной модели^{АА 6}. Фактически, учитывая, что ТАД возникает в результате первоначального интимального разрыва грудной аорты с последующим быстрым расширением ложного просвета, это значительное различие в механизме отличает ТАД от аневризмы^{аорты 7}. На сегодняшний день наиболее часто используемой моделью ТАД является индуцированная β-аминопропионитрилом (BAPN) расслоением аорты у грызунов. БАПН, специфический и необратимый ингибитор лизилоксидазы, ингибирует сшивание эластических волокон и коллагеновых волокон в стенке аорты и широко используется на животных моделях расслоения аорты ^8,9,10. В большинстве случаев BAPN добавляли в питьевую воду мышей для построения моделей TAD, а комбинацию BAPN и ангиотензина II (Ang II) с помощью осмотического насоса использовали для построения моделей TAD^11,12. Однако эти методы построения ТАД-моделей подробно не описаны. Из-за различий в линиях мышей, введении BAPN, а также концентрации и продолжительности Ang II, частота и степень поражения TAD были нестабильными в разных экспериментах. Поэтому существует острая потребность в стабильном методе построения мышиных ТАД-моделей.

В данном протоколе подробно и шаг за шагом описывается простой и весьма успешный метод с использованием комбинации воды, обогащенной BAPN, и осмотического насоса Ang II для построения мышиной модели TAD. Этот протокол применим к большинству лабораторий и прост в освоении, что позволяет даже исследователям, не имеющим опыта в создании мышиных моделей, выполнять его последовательно.

Протоколы содержания животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Тяньцзиньского медицинского университета (номер одобрения TMUaMEC 2022036). В этом исследовании использовались трехнедельные самцы мышей C57BL/6J. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Содержание и группировка животных

1. Выращивайте мышей на стандартном поддерживающем корме. Для этого исследования используйте трехнедельных мышей.
2. Случайным образом распределите мышей по контрольной группе (контроль), группе перорального приема BAPN (BAPN), группе перорального приема BAPN и инфузии физиологического раствора (BAPN + физиологический раствор) и группе перорального приема BAPN и инфузии Ang II (BAPN + Ang II) (рис. 1). Обеспечьте мышей контрольной группы обычной питьевой водой.
3. Обеспечьте мышей группы БАТН питьевой водой с добавлением БАТН в дозе 1 мг/г/сут в течение 4 недель. Вводите мышам в группе BAPN + Ang II Ang II (1 нг/г/мин) и мышам в группе BAPN + физиологический раствор эквивалентное количество физиологического раствора в течение 24 часов после 4 недель перорального приема BAPN.

2. Подготовка к питьевой воде с добавлением БАТН

1. Обеспечьте мышей питьевой водой с добавлением BAPN в течение 4 недель подряд после 3 дней адаптивного кормления, установив 1 день в качестве индукционного цикла.
2. Взвесьте мышей в каждой клетке, чтобы рассчитать необходимое количество BAPN в питьевой воде.
3. Запишите объем воды (объем) каждой клетки за последние сутки.
4. Чтобы обеспечить достаточное потребление воды, используйте в 1,3 раза больше суточного объема воды (1,3 x объем) в качестве количества воды для индукционного цикла. Соответственно, растворяют в 1,3 раза больше необходимого веса БАПН в расчетном объеме питьевой воды. Подробный метод расчета и пример приведены в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в этом возрасте все еще находятся в периоде быстрого роста. Рекомендуется ежедневно регистрировать объем потребления воды мышами в течение модельного периода индукции, а питьевую воду с добавлением BAPN в клетке менять каждый день. Чтобы предотвратить разложение БАПН, оберните бутылку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.

3. Расчет массы Ang II

1. Взвесьте каждую мышь и рассчитайте необходимую для эксперимента массу Ang II, исходя из максимальной массы тела.
2. Используйте шаблон расчета (Таблица 2) для вычисления массы Ang II, необходимой для эксперимента.
3. Рассчитайте массу Ang II, необходимую для 130 μL раствора Ang II на мышь, так как для каждого насоса требуется примерно 100 μL.
4. Используйте шаблон расчета (Таблица 3) для расчета объема заполнения раствора Ang II и физиологического раствора, необходимого для эксперимента.

4. Роспуск Ang II

1. Хранить лиофилизированный порошок Ang II в герметичном флаконе при температуре -80 °C. Чтобы предотвратить конденсацию влаги, дайте Ang II уравновеситься до комнатной температуры, а затем центрифугируйте его перед открытием.
2. Взвесьте рассчитанное количество Ang II в стерильной микропробирке с помощью аналитических весов.
3. Добавьте рассчитанный объем нормального физиологического раствора в микротрубку, содержащую лиофилизированный Ang II, и тщательно перемешайте до полного растворения.
4. Приготовьте необходимый раствор Ang II отдельно для каждой мыши на чистом стенде в зависимости от массы тела. Переверните микропробирку вверх дном, чтобы раствор хорошо перемешался.

5. Наполнение осмотического насоса

1. Достаньте две части осмотического насоса из упаковки и подготовьте насос с помощью стерильных инструментов, чтобы избежать риска инфицирования.
2. Взвесьте каждый насос, включая корпус насоса и замедлитель потока, с помощью аналитических весов. Запишите данные и используйте их для расчета коэффициента заполнения.
3. Приложите наполнительную трубку к только что открытому стерильному шприцу объемом 1 мл и осторожно отсасывайте приготовленный раствор Ang II, описанный выше, стараясь не аспирировать пузырьки воздуха.
4. Удерживайте заправочную трубку в вертикальном положении и осторожно удалите из шприца все пузырьки воздуха. Сохраняйте это положение, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь заливной трубки.
5. Аккуратно вставьте конец заправочной трубки в отверстие в верхней части осмотического насоса до тех пор, пока его нельзя будет вставлять дальше.
6. Держите осмотический насос вертикально и медленно сожмите поршень шприца. Как только раствор Ang II появится на выходе, немедленно остановитесь и осторожно снимите заливную трубку.
7. Осторожно и медленно вставьте замедлитель потока в отверстие осмотического насоса до тех пор, пока не останется видимого зазора между замедлителем потока и верхней частью насоса. Сотрите излишки раствора Ang II стерильной абсорбирующей бумагой.
8. Взвесьте загруженный насос на аналитических весах и запишите это. Разница в весе насоса до и после инфузии — это масса загруженного раствора Ang II.
9. Рассчитайте норму заполнения по следующей формуле:
   Скорость наполнения = (масса заполненного насоса - масса пустого насоса) / (стандартный объем) x 100%
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем наполнения должен составлять более 90% от стандартного объема, указанного в инструкции по эксплуатации. Если это так, заливка выполнена успешно. Если нет, насос следует слить и снова залить.
10. Поместите наполненные насосы в стерильный физиологический раствор при температуре 37 °C с поднятой головой замедлителя не менее чем на 6 часов до имплантации.

6. Хирургическая процедура по имплантации помпы

1. Автоклавирование всех хирургических инструментов, включая ножницы, гемостатики, пинцеты, игольчатые щипцы и иглы для наложения швов, проводится за 24 ч до имплантации помпы.
2. Поместите мышь в анестезиологическую индукционную камеру с 1,5%-2% изофлураном со скоростью потока 2 л/мин и стабилизируйте мышь в течение 2 минут. Сбрейте шерсть мыши на участке около 2 см × 1 см на средней части лопаточной кожи.
   Примечание: Поскольку реакция мыши на изофлуран вариабельна, может потребоваться корректировка концентрации для поддержания стабильной анестезии.
3. Поместите мышь в положение лежа так, чтобы носик находился в носовом конусе, подключенном к аппарату для анестетика изофлурана. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией. Следите за тем, чтобы мышь не реагировала на болезненные раздражители до и во время имплантации помпы.
4. Продезинфицируйте спинную кожу трижды медицинским йодофором.
5. Аккуратно сделайте поперечный разрез около 1 см на коже с помощью скальпеля.
6. Аккуратно захватите край резца изогнутыми щипцами и тупо рассеките подкожную клетчатку еще одной парой изогнутых щипцов, чтобы создать карман для помпы. Убедитесь, что карман достаточно большой, чтобы насос мог свободно перемещаться.
7. Вставьте наполненный насос в подкожный карман так, чтобы головка замедлителя потока располагалась ближе к каудальному концу мыши. Оставьте достаточно места для закрытия разреза и не допускайте перерастяжения кожи.
8. После того, как насос будет имплантирован, аккуратно выровняйте режущий край и закройте кожу нерассасывающимися швами 6-0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно осмотрите место разреза, чтобы убедиться, что рана полностью закрыта и что насос не давит непосредственно на разрез.
9. Снова очистите разрез йодофором и нанесите 5% лидокаиновый обезболивающий гель местно с помощью стерильного ватного тампона. Выключите изофлуран (0%).

7. Послеоперационный уход за животными

1. Внимательно наблюдайте за мышами после имплантации насоса и поместите их в клетку для восстановления вместе с электрическим одеялом с подогревом.
2. Дайте мышам восстановиться в одиночестве в теплой клетке в течение как минимум 20 минут, пока они не проснутся, а затем верните их в исходную клетку.
3. Наблюдайте за мышами ежечасно в течение первых 6 ч после операции. В течение следующих 18 ч наблюдайте за мышами с интервалом в 6 ч. Немедленно собирайте образцы, если мыши находятся в умирающем состоянии или умирают во время введения Ang II.

8. Забор, фиксация, очистка и визуализация аорты

1. Обезболивайте мышей из всех экспериментальных групп изофлураном, а затем принесите их в жертву путем вывиха шейки матки в конце исследования.
2. Поместите мышей в лежачее положение и закрепите их на мышиной пластине. Сделайте разрез в нижней части живота и протяните его через стенку грудной клетки до полного обнажения грудной и брюшной полостей.
   1. Немедленно сделайте небольшой разрез в правом предсердии, введите стерильный шприц в левый желудочек и медленно вводите примерно 10 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) через левый желудочек, пока легкие и печень не станут белыми.
3. Впоследствии проводят резекцию легких, печени, селезенки, кишечника. Полностью обнажите всю аорту и измерьте максимальный диаметр грудной аорты с помощью цифрового штангенциркуля. Рассеките аорту от сердца и пересеките все артериальные ветви и общие подвздошные артерии, чтобы собрать всю аорту.
4. Сфотографируйте аорту с помощью цифровой камеры, законсервируйте ее в 4% параформальдегиде в течение 24-48 часов и заделайте в парафин для разрезания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не травмировать кишечный тракт, так как это может помешать анализу тканей.
5. Срезы парафина аорты толщиной 3-5 мкм с помощью микротома, затем проводят депарафинизацию и гидратацию. Окрашивайте срезы гематоксилином и эозином (H&E) и Elastic-Van Gieson (EVG) с помощью соответствующих наборов для окрашивания в соответствии с инструкциями производителя.

В общей сложности 70 самцов мышей C57BL/6J в возрасте 3 недель были включены в это исследование и случайным образом распределены в четыре группы: контрольная (n = 10), BAPN (n = 20), BAPN + физиологический раствор (n = 20) и BAPN + Ang II (n = 20). В группе BAPN у 11 из 20 мышей развилось расслоение грудной аорты (TAD) через 28 дней после введения BAPN, при этом 4 мыши умерли от разрыва аорты. В группе BAPN + физиологический раствор у 12 из 20 мышей развился TAD, 4 из которых умерли из-за разрыва. Примечательно, что в группе BAPN + Ang II у всех 20 мышей развился TAD, и 7 из них умерли от разрыва аорты. В контрольной группе образования ТАД не наблюдалось (рис. 2А). Репрезентативные изображения аорты из каждой группы показаны на рисунке 2B.

Средние максимальные диаметры аорты составляли 1,00 ± 0,09 мм (контроль), 2,57 ± 0,22 мм (BAPN), 2,57 ± 0,33 мм (BAPN + физиологический раствор) и 2,78 ± 0,23 мм (BAPN + Ang II) (рис. 2C). По сравнению с контрольной группой, все три модельные группы показали значительно увеличенный максимальный диаметр аорты; Тем не менее, существенных различий между самими модельными группами не наблюдалось.

Гистологический анализ с использованием H&E окрашивания выявил утолщение стенок аорты и выраженную воспалительную инфильтрацию клеток в группах BAPN, BAPN + Физиологический раствор и BAPN + Ang II по сравнению с контрольной группой. Окрашивание EVG также продемонстрировало фрагментацию и потерю эластичных волокон в этих группах (рис. 3).

Рисунок 1: Схематический протокол для индукции расслоения грудного отдела аорты. Расслоение аорты индуцировали у 3-недельных мышей C57BL/6J путем перорального введения β-аминопропионитрила (BAPN) или последующей инфузии ангиотензина II (Ang II). Мыши в контрольной группе и группе БАТН получали обычную питьевую воду или питьевую воду с добавлением БАТН (1 мг/г/день) в течение 4 недель соответственно. Мышам в группе BAPN + Ang II или в группе BAPN + физиологический раствор вводили Ang II (1 нг/г/мин) или эквивалентный объем физиологического раствора в течение 24 ч после завершения четырехнедельного лечения BAPN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Частота и морфология расслоения аорты в каждой группе. (A) Частота расслоения и разрыва аорты в каждой группе. (B) Репрезентативная общая морфология аорты из каждой группы; масштабная линейка = 5 мм. (C) Количественная оценка максимальных диаметров аорты у мышей с расслоением аорты (n = 6 в группе); p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Гистологическая характеристика расслоенных аорт . Репрезентативные гематоксилин и эозин (ПЭ) и эластин ван Гизон (ЭВГ) окрашивали участки аортальной ткани из каждой группы. Черные стрелки указывают на ложные просветы (F); масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Расчет дозировки БАТН и объема воды. Необходимое количество BAPN основывалось на общей массе тела мышей в клетке и среднесуточном потреблении воды. Чтобы обеспечить достаточный забор, расчетный объем воды был умножен на коэффициент 1,3. Например, для четырех мышей с общей массой тела 72,1 г и суточной нормой воды 10,9 мл 93,7 мг БАТН растворяли в 14,17 мл питьевой воды в течение одного индукционного цикла.

Таблица 2: Расчет количества Ang II для инфузии осмотическим насосом. Требуемая масса Ang II была рассчитана для достижения скорости подачи 1 нг/г/мин для каждой мыши, исходя из расчета 130 мкл раствора на насос. Например, для мыши массой 23,5 г требуемая концентрация раствора составляла 1410 нг/мкл, в результате чего общая масса Ang II составила 1,833 мг для 10 мышей. Это количество растворяли в 1300 мкл физиологического раствора.

Таблица 3: Расчет объемов наполнения Ang II и солевым раствором на одну мышь. Объемы наполнения регулировались в соответствии с массой тела индивидуальной мыши, максимум 100 μл на насос. Например, мышь весом 22 г получала 93,6 мкл раствора Ang II, а оставшиеся 6,4 мкл заполняли физиологическим раствором для достижения общего объема в 100 мкл.

Из-за ограниченного понимания угрожающего жизни расслоения грудного отдела аорты (ТАД) создание стабильных животных моделей имеет важное значение для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе возникновения и прогрессирования ТАД. β-аминопропионитрил (БАПН), ингибитор лизилоксидазы, широко используется в моделях ТАД у грызунов, поскольку он нарушает сшивание коллагена и эластина, тем самым ослабляя стенку аорты и повышая ее восприимчивость к механическим^{нагрузкам13}. Тем не менее, применение только БАТН часто приводит к непоследовательной заболеваемости ТАД в разных исследованиях.

Являясь ингибитором лизилоксидазы, BAPN необратимо ингибирует сшивание эластина и коллагена¹⁰. Принято считать, что во время ювенильной фазы сшивание этих компонентов внеклеточного матрикса все еще^{продолжается14}. Таким образом, введение БАПН в течение этого критического окна развития может быть особенно эффективным для нарушения созревания матрицы, увеличивая вероятность успешной индукции ТАД. Несколько исследований показали, что БАТН сам по себе может индуцировать ТАД у молодых мышей, хотя зарегистрированная частота варьирует в широких пределах, варьируясь от 9% до 91% после 4 недель введения БАТН 12,15,16.

Примечательно, что в последние десятилетия возникновение ТАД у людей показало тенденцию к более молодому возрасту, при этом некоторые исследования показывают, что средний возраст осложнений аорты приходится на период от 30 до 40 лет^17,18. Поскольку BAPN индуцирует TAD у мышей в возрасте от 3 до 4 недель, нарушая поперечное сшивание эластина и коллагена во время развития внеклеточного матрикса, эта модель может лучше отражать патофизиологию и молекулярные особенности раннего начала TAD у людей^.

Напротив, одного БАТН недостаточно для индуцирования ТАД у взрослых мышей ^9,20. Чтобы решить эту проблему, различные исследования сочетали BAPN с дополнительными вмешательствами. Например, было показано, что одновременное введение метилового эфира NG-нитро-L-аргинина (L-NAME), BAPN и ангиотензина II (Ang II) индуцирует TAD у взрослых мышей²¹. Среди них комбинация BAPN и Ang II является наиболее часто используемой стратегией для повышения заболеваемости TAD. Ren et al. сообщили о 100% частоте ТАД при введении Ang II в течение 24 ч после 4-недельного режима приема БАТН, что согласуется с результатами данного исследования¹². Кроме того, введение Ang II было связано с дозозависимыми показателями смертности 14%, 39% и 67% после 12 ч, 24 ч и 48 ч инфузии, соответственно,²², что также согласуется с показателями смертности, наблюдаемыми в нашей экспериментальной модели.

Существует несколько режимов введения БАТН, включая доставку через питьевую воду, осмотические насосы, желудочный зонд, диету и внутрибрюшинную инъекцию 21,22,23,24. Среди них введение через питьевую воду является наиболее часто используемым методом для молодых мышей. Осмотические насосы, с другой стороны, хорошо зарекомендовали себя для обеспечения последовательного и устойчивого высвобождения соединений и часто используются для инфузии Ang II на мышиных моделях аневризмы аорты²⁵. Несмотря на то, что подкожная инфузия с помощью насосов может считаться оптимальным методом доставки БАТН, растворимость БАТН и производительность насоса ограничивают его осуществимость. Максимальная растворимость БАТН в воде составляет примерно 50 мг/мл, что недостаточно для удовлетворения требований к концентрации для эффективной доставки с помощью насоса. Следовательно, необходим высококонцентрированный раствор БАТН. Как и в настоящем исследовании, в последних протоколах принят комбинированный подход, предусматривающий введение BAPN в питьевую воду и доставку Ang II с помощью осмотических насосов²⁶. Этот метод представляется оптимальным для доставки БАТН молодым мышам.

В настоящее время в литературе не существует стандартизированного консенсуса относительно оптимальной дозы и продолжительности введения БАТН. В то время как во многих исследованиях использовалась доза 1 мг/г/день, когда БАТН поступает через питьевую воду, другие описывали концентрации БАТН в терминах 1-3 мг/мл или от 0,2% до 0,6% (масс./об.)^{27,28,29,30,31}. Добавление БАТН в питьевую воду может изменить количество воды, потребляемой мышами, а потребление воды может не коррелировать линейно с массой тела. Следовательно, фиксированная концентрация БАТН может привести к изменчивости фактического потребления БАТН на одну мышь. Чтобы решить эту проблему, текущее исследование скорректировало ежедневную дозу питьевой воды с добавлением BAPN в зависимости от массы тела и потребления воды, стремясь поддерживать постоянную дозу 1 мг/г/день.

Однако этот протокол имеет несколько ограничений. Во-первых, в нем отсутствуют исходные данные о частоте и патологическом прогрессировании ТАД в промежуточные временные точки. Во-вторых, в этом исследовании использовались только самцы мышей. В то время как ТАД более распространен среди мужчин, сообщается, что у женщин наблюдаются худшие исходы, включая более высокую смертность и снижение долгосрочной выживаемости после хирургического лечения^32,33. Интересно, что в некоторых исследованиях наблюдалась более низкая частота расслоения аорты у самок мышей, получавших BAPN и Ang II^26,34, что требует дальнейшего изучения. В-третьих, начало индукции ТАД в возрасте 3 недель (аналогично подростковому возрасту человека) может не полностью отражать патофизиологические механизмы, лежащие в основе ТАД у взрослых. Наконец, групповое содержание в период введения БАТН (4 мыши в клетке) приводит к вариабельности индивидуального потребления воды, что может способствовать различиям в воздействии БАТН и тяжести симптомов.

В заключение, этот протокол описывает стабильную, высокочастотную и воспроизводимую мышиную модель ТАД, которая точно имитирует патологические особенности ТАД человека. Благодаря своей простоте и надежности, эта модель представляет собой ценную полезность для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе возникновения и прогрессирования ТАД, а также для оценки потенциальных терапевтических стратегий.

Авторы данной рукописи не могут заявить об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (82370299) и Тяньцзиньским проектом строительства ключевой медицинской дисциплины (специальности) (TJYXZDXK-060B).