Система культивирования органов для оценки токсичности вспомогательных веществ и фармацевтических препаратов для внутриглазного лечения

Целью данного протокола является оценка изменений метаболической активности и преломляющей функции хрусталика в ответ на экспериментальное лечение.

Катаракта, являющаяся основной причиной слепоты, является серьезным бременем для десятков миллионов людей во всем мире, страдающих этим заболеванием. Воздействие химических веществ, наряду с другими факторами окружающей среды, является установленной причиной катаракты. Тестирование на офтальмологическую токсичность может оценить, могут ли фармацевтические препараты и их компоненты способствовать повреждению хрусталика, которое может привести к катаракте или помочь в лечении катаракты.

Исследования in vitro и испытания на животных in vivo могут быть использованы для оценки безопасности химических веществ до начала клинических исследований. Тест Дрейза — текущий стандарт in vivo для тестирования глазной токсичности и раздражения — подвергся критике за недостаточную чувствительность и объективные измерения определения глазной токсичности. Клеточные анализы in vitro ограничены, поскольку клеточные культуры не могут надлежащим образом смоделировать неповрежденный функциональный хрусталик.

Описанный здесь метод представляет собой чувствительную альтернативу испытаниям на животных in vitro , предназначенную для оценки реакции неповрежденного бычьего хрусталика на лечение как на уровне клеточной активности, так и на уровне общей рефракции. Нетоксичный реагент резазурин метаболизируется пропорционально уровню активности клеток. Лазерно-сканерный анализ линзы измеряет способность линзы преломлять падающие лучи света в одну точку с минимальной погрешностью, непосредственно связанной с его естественной функцией. Метод может быть использован для определения как острых, так и отсроченных изменений хрусталика, а также восстановления хрусталика после химических воздействий или воздействий окружающей среды.

Катаракта, поражающая более 20 миллионов человек, является наиболее распространенной причиной слепоты во всем мире ^1,2. Катаракта чаще всего возникает из-за возрастных изменений хрусталика, но также вызвана травмой, генетическими состояниями, болезнями или токсическим воздействием². В настоящее время лечение включает в себя хирургическое вмешательство по замене хрусталика, дорогостоящую и инвазивную процедуру, доступную в основном в развитых странах. Обширное бремя катаракты направило десятилетия исследований на профилактику катаракты и разработку нехирургических методов лечения. В обоих случаях важность доклинических испытаний на токсичность, эффективность и фармакокинетику офтальмологических препаратов имеет первостепенное значение. Этот процесс разработки лекарств в значительной степени опирается на информацию, полученную в ходе исследований, проведенных на животных.

В настоящее время стандартом для тестирования глазной токсичности in vivo является тест Дрейза, включающий доставку исследуемого соединения в конъюнктивальный мешок живого животного. Тест подвергся значительной критике, особенно в отношении этики животных, субъективности, плохой повторяемости и^{изменчивости}. Кроме того, в тесте Дрейза нет компонента, который напрямую отслеживал бы воздействие исследуемых веществ на объектив. Значительные усилия были вложены в разработку альтернативных моделей in vitro ⁴. Тем не менее, ни один из них не был достаточно валидирован, чтобы заменить тест Дрейза⁵. Аналогичным образом, многие из этих моделей сталкиваются с ограничениями в отношении прямого применения к катаракте и другим сложным патологиям⁶. Например, методы оценки прозрачности объектива при размещении над сеткой по своей сути субъективны⁷. Исследования клеточных культур надежны и широко используются, хотя характеристики монослоя клеток могут отличаться от характеристик первичной культуры тканей⁸.

Целые хрусталики могут быть отделены от глаз животных и культивированы для сохранения их первоначальной структуры и функции. Одним из анализов, который полезен для оценки функции хрусталика при сохранении состояния органа, является анализ с помощью лазерного сканера хрусталика с использованием сканера, разработанного в Университете Ватерлоо в Канаде. Анализ представляет собой сканирующую систему, в которой используется серия лазерных проекций для измерения оптического качества или преломляющих характеристик хрусталика. Линзы сканируются в специальных двухсегментных камерах для культивирования, что позволяет лучам проходить снизу через линзу (рис. 1A). Камера, установленная внутри сканера, фиксирует изображение лазера, проходящего через объектив в многочисленных точках. Программное обеспечение сканера вычисляет расстояние за линзой, на котором она пересекается с центральной осью (расстояние до задней вершины, BVD), производя серию измерений, которые показывают, насколько последовательно линза фокусирует свет в одной точке (рис. 1).

Ячеистые свойства хрусталика, такие как плотное и упорядоченное расположение его ячеек, помогают поддерживать прозрачность и минимизировать рассеяние, чтобы линза могла функционально^{фокусировать свет.} Эта мера может быть использована для интерпретации того, насколько сильно химическое вещество нарушает основную структуру хрусталика, такую как градиентный показатель преломления, и насколько функция нарушается из-за индуцированных помутнений. Другие исследования, в которых изучалась реакция культивируемых хрусталиков и везикул хрусталика, показывают, что рассеяние света является продуктом структурных изменений, по сравнению с метаболическими изменениями, и что нарушения липидов и белков хрусталика могут повлиять на показатель преломления и, следовательно, увеличить рассеяние^10,11.

Линзовый лазерный сканер может быть использован в сочетании с метаболическими реагентами в анализах для определения биохимических показателей токсичности клеток. Резазурин представляет собой нетоксичный химический реагент, метаболизируемый активными клетками с образованием восстановленного продукта (резоруфина) с измеряемой флуоресценцией¹². Хрусталик в значительной степени лишен органелл, за исключением метаболически активных митохондрий, сосредоточенных в переднем эпителии и поверхностных корковых волокнах, удовлетворяющих энергетические потребности хрусталика^13,14. Повреждение хрусталика на клеточном уровне может нарушить обмен веществ и часто предшествует возникновению патогенных структурных изменений и катаракты¹⁵.

Целью данного метода является оценка влияния ксенобиотиков и воздействия окружающей среды на хрусталик, которые могут способствовать развитию катаракты. Протокол включает в себя два анализа для оценки эффекта лечения с использованием культивируемого бычьего хрусталика. Преимущество этого подхода заключается в том, что он обеспечивает как клеческую, так и функциональную оценку того, как хрусталик как первичная ткань реагирует на лечение. Это чувствительная и объективная оценка хрусталика по сравнению с другими распространенными методами 16,17,18.

Модель была успешно использована для оценки эффектов различных воздействий, включая поверхностно-активные вещества, потребительские товары, алкоголь и ультрафиолетовое излучение 17,19,20. Изменения оптического качества постоянно присутствуют в культивируемых линзах в ответ на токсическое воздействие²¹. Способность этого метода поддерживать долгосрочную культуру хрусталика хорошо подходит для мониторинга потенциально отсроченного эффекта соединения и восстановления хрусталика от индуцированного повреждения или катаракты^22,23. Результаты, полученные в результате применения этого протокола, могут быть использованы для снижения зависимости от испытаний на животных при разработке офтальмологических продуктов.

Все протоколы экспериментов были проведены в соответствии с этической политикой Университета Ватерлоо в отношении исследований с использованием тканей животных. Бычьи глаза для данного исследования были получены от немолочных коров в течение нескольких часов после смерти и немедленно препарированы, что занимает до 8 часов с момента получения глаз. Глаза должны быть немедленно рассечены для сохранения стерильности и качества диссекции. Питательную среду подготавливают до рН 7,4 и стерильно фильтруют перед добавлением FBS²¹. Все процедуры проводятся в стерильных условиях, при этом источники материалов и оборудования указаны в Таблице материалов.

1. Культура хрусталика крупного рогатого скота

1. Препарируйте хрусталик путем удаления экстраокулярных мышц и тканей склеры, удаления задней половины глазного яблока и стекловидного тела, удаления радужки и цилиарного тела вместе с хрусталиком, затем отрезания зонулярных креплений, при этом окончательный разрез расположить таким образом, чтобы хрусталик опустился в камеру для культуры, заполненную средой.
2. Препарированные линзы культивируют в специальных камерах с основанием, адаптированным для системы лазерного сканирования, с 21 мл стерильно отфильтрованной среды при 37 °C и 5%_CO2. Используйте питательную среду с добавлением 3% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с 1% пенициллин-стрептомицина, 9,4 г/л M-199, 0,1 г/л L-глютамина, 5,96 г/л HEPES, 2,2 г/л бикарбоната натрия и 7 мл/л NaOH. Неиспользованную питательную среду хранить в холодильнике до 7 дней.
3. Заменяйте питательную среду каждые 1-2 дня. Перед использованием питательную среду прогрейте в течение часа при температуре 37 °C. С помощью стерильной пастеровской пипетки, подключенной к всасыванию, отсасывайте среду из индивидуальной камеры для культивирования и немедленно пополняйте ее с помощью добавленной среды.
4. Культивируйте хрусталики в течение 48 часов после вскрытия, чтобы дать время для проявления физического повреждения. Осмотрите и отсканируйте линзы на предмет оптического качества в соответствии с разделом 4 перед включением в эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы ориентированы лицевой стороной вниз при подготовке к лазерному сканированию.

2. Порядок действий

1. Приготовьте раствор с нужной концентрацией солюбилизирующего агента, совместимого с химическим соединением и питательной средой.
2. Приготовьте раствор для управления транспортным средством, добавив солюбилизирующий агент в добавку. Перед экспериментом нагрейте контрольный раствор в течение часа до 37 °C.
3. Используйте пастеровский пипетку, подключенную к отсасыванию, для аспирации питательной среды из камер контрольных линз. Пополните камеры раствором для контроля. При необходимости выполните этот шаг с образцами в трех экземплярах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем 7 мл необходим для полного покрытия линзы в переднем положении лицевой стороной вверх. Условия для контроля в данном исследовании составляли 21 мл необработанной среды контроля, 21 мл контрольной среды для транспортного средства и 7 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
4. Заквашивайте линзы в контрольной среде в течение 2 дней, затем замените новой контрольной средой в соответствии с разделом 1. При кратковременном воздействии отсасывайте контрольный раствор из камер и промывайте его не менее трех раз питательной средой без добавок, прежде чем возобновить протокол культивирования хрусталика, как описано в разделе 1.0.
5. Дайте линзам акклиматизироваться в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение не менее 3,5 часов до оценки оптического качества.

3. Процедура воздействия

1. Приготовьте раствор с нужной концентрацией солюбилизирующего агента, совместимого с химическим соединением и питательной средой. Смешайте химическое вещество с солюбилизирующим агентом, при необходимости предоставив соответствующее время для взаимодействия.
   Примечание: 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин был использован в настоящем исследовании для повышения растворимости ланостерола (0,033 г/л) в среде. Раствор бензалкония хлорида (БАК 0,0075%) готовили с использованием ПБС.
2. Добавьте солюбилизированное химическое вещество в питательную среду. Подготовьте общий объем, достаточный для обеспечения 21 мл среды для всех образцов объективов. Перед экспериментом нагрейте испытуемую среду в течение часа при температуре 37 °C.
3. Используйте пипетку Пастера, подключенную к отсасыванию, для аспирации питательной среды из камер линз. Немедленно пополните камеры тестовым раствором. По истечении интервала воздействия замените на добавленную питательную среду, предварительно выполнив полоскание при необходимости. При необходимости выполните этот шаг с образцами в трех экземплярах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании условия тестирования составляли 21 мл среды, обогащенной ланостерином, и 7 мл 0,0075% раствора BAK. Минимальный объем 7 мл необходим для полного покрытия объектива. В этом случае линзы в первую очередь должны быть ориентированы передней лицевой стороной вверх. Пипетка Пастера может быть использована для создания тока в камере для культивирования с некоторой частью окружающей питательной среды для изменения положения хрусталика.
4. Верните линзы в инкубатор не менее чем на 3,5 ч для акклиматизации перед оценкой оптического качества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы ориентированы лицевой стороной вниз при подготовке к лазерному сканированию.

4. Оптический контроль качества (линзовый лазер-сканер)

1. Убедитесь, что линзы ориентированы передней стороной вниз и визуально выровнены в камере для культивирования, используя технику из шага 3.3 для корректировки положения хрусталика, если это необходимо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такое положение гарантирует, что падающий луч будет отражаться вверх через дно камеры и проходить через линзу от передней поверхности к задней.
2. Поместите камеру для культивирования линз в лазерный сканер таким образом, чтобы штифт каретки камеры вошел в паз в основании камеры.
3. Выберите объектив и точку сканирования , для которых необходимо выполнить сканирование, щелкните правой кнопкой мыши по объективу сканирования и дождитесь, пока сканер предложит найти и выровнять луч. Выберите начало и конечные точки на достаточном расстоянии для луча за объективом. Убедитесь, что центральный луч выровнен с помощью кнопок грубой и точной регулировки в программном обеспечении сканера и ручки регулировки на сканере. Когда луч будет выровнен, нажмите кнопку «Калибровка» и введите соответствующий выбор радиальных ступеней и разделения луча.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для данного исследования с использованием бычьего хрусталика настройки радиальных ступеней и разделения луча были установлены на 10 ступеней и 0,5 мм соответственно. Первое сканирование, которое выполняет сканер, служит для калибровки лазерного сканера. Это требуется один раз, и все дополнительные сканирования линз могут быть выполнены сразу после юстировки.
4. После калибровки сканера нажмите кнопку «Сканировать». Подождите, пока будут сгенерированы значения среднего значения BVD, стандартного отклонения и ошибки по одной оси после завершения сканирования объектива, а также установки области луча. Установите осциллограф с места, откуда лучи выходят из объектива, в нужную конечную точку, выбрав максимальное расстояние за линзой, исключив при этом любые видимые помехи.
5. Используйте созданную диаграмму для просмотра отдельных обратных вершинных расстояний для каждого луча.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите прохождение лучей через шовные материалы линз. Чтобы исключить балку, используйте условные обозначения на экране, щелкните правой кнопкой мыши отдельную балку и выберите «Исключить».
6. Вручную поверните положение основания камеры для культивирования внутри сканера на 90° таким образом, чтобы второе сканирование вдоль передней поверхности хрусталика было перпендикулярно предыдущему сканированию. Убедитесь, что центральный луч выровнен, как описано в шаге 4.3, а затем отсканируйте линзу.

5. Анализ метаболической активности (резазурин)

1. Приготовьте среду без FBS. Прогрейте среду в течение часа при температуре 37 °C. Приготовьте 50 мл 8% реагента резазурина в необогащенной среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно подготовить 50 мл для заполнения всех лунок в 12-луночной пластине. Раствор следует готовить стерильно при тусклых условиях в непрозрачной емкости, так как резазурин светочувствительный.
2. Добавьте 3,8 мл 8% раствора резазурина в каждую лунку в стерильном 12-луночном планшете с прозрачным дном, чтобы покрыть линзу.
3. С помощью стерильных металлических совков осторожно приподнимайте линзы из-под задней поверхности и промывайте линзу с помощью пипетки Пастера небольшим объемом питательной среды без добавок. Поместите линзы по отдельности в каждую лунку.
4. Инкубируйте лунку при 37 °C и 5%_CO2 в течение 5 часов. После инкубации извлеките из лунок линзы с металлическими совками и поместите их в контейнер для утилизации отходов животного происхождения. Перелейте образец объемом 100 мкл из каждой лунки в стерильный 96-луночный планшет с прозрачным дном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы могут быть оценены несколько раз с помощью анализа метаболической активности. В этом случае верните линзы в камеры культуры со свежей средой для инкубации. Анализ метаболической активности лучше всего проводить после завершения всех сканирований, так как краситель может повлиять на измерения BVD.
5. Измерьте конечную флуоресценцию образцов объемом 100 мкл с помощью считывателя флуоресцентных пластин с длинами волн возбуждения и излучения 560 нм и 590 нм соответственно.

6. Анализ данных

1. Для анализа оптического качества рассчитайте среднее арифметическое значений, рассчитанных программным обеспечением для ошибки BVD²⁴ на основе двух сканирований, выполненных в каждой временной точке. Выполните этот расчет для всех объективов и всех точек сканирования.
2. Для анализа метаболической активности соберите конечные значения относительной флуоресценции, полученные с помощью планшетного ридера. Нормализуйте данные, установив среднее значение всех контрольных значений на scanpoint на 100%. Рассчитайте активность каждой линзы в процентах от среднего контрольного значения для этой точки сканирования.
3. Проведите тест на нормальность для всех экспериментальных групп. Предполагая, что данные в норме, проанализируйте разницу в ошибках BVD между контрольными и экспериментальными объективами с помощью двустороннего ANOVA. Кроме того, выполните тест множественных сравнений Тьюки post-hoc. Выполните однофакторный ANOVA и апостериорный тест Даннетта для получения данных о метаболической активности.

На рисунках 2 и 3 (n = 6) представлены результаты исследования, в котором изучалось влияние химической обработки (ланостерола) на бычий хрусталик. Ланостерол – это природный стерол в хрусталике, который когда-то показал многообещающие результаты в качестве потенциального фармацевтического вмешательства при катаракте²⁵, хотя это еще предстоит доказать²⁶. Дизайн исследования включал в себя управление средой и транспортным средством для соединения. Не было выявлено существенной разницы между носителем (2-гидроксипропил-β-циклодекстрин) и средой контроля (p > 0,05), что указывает на то, что какой-либо потенциальный эффект в опытной группе вряд ли будет связан с носителем. Достоверной разницы в вариабельности БВД между группой лечения и контрольной группой не выявлено (p > 0,05). Эти результаты согласуются с анализом метаболической активности (Рисунок 3). Таким образом, лечение не привнесло существенной токсичности в клетки и не оказало существенного влияния на рефракционные характеристики хрусталика (p > 0,05).

На рисунках 4 и 5 (n = 3) показаны результаты лечения БАК на хрусталике. BAK является поверхностно-активным веществом и наиболее часто используемым консервантом в офтальмологических препаратах²⁷. 10-минутная экспозиция привела к значительно большей вариабельности БВД в обработанных линзах по сравнению с контролем через 4 дня после экспозиции (p < 0,05). Лечение также привело к достоверной разнице в метаболической активности хрусталика (p < 0,05).

Рисунок 1: Определение расстояния до задней вершины в качестве меры оптического качества с помощью лазерного сканера. (A) Серия лучей пропускается через линзу, когда она находится в камере для культуры вдоль одной оси. (B) Лучи проходят через линзу через определенные промежутки времени. Расстояние до задней вершины определяется для каждого луча, а средние значения BVD (в мм) и BVD погрешности генерируются как количественные измерения преломляющей функции линзы. Эта информация отображается графически, при этом BVD отображается по оси x, а положение луча — по оси y. Чем резче фокусируются лучи в постоянной точке позади объектива (C), тем меньше рассчитанное значение ошибки BVD по сравнению с объективами с более низким оптическим качеством (D). Аббревиатура: BVD = расстояние до задней вершины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Влияние суспензии ланостерола на оптическое качество бычьих линз. Изменчивость расстояния до задней вершины отражает способность линзы преломлять свет в одну точку. Оптическое качество линз, обработанных ланостерином, было аналогично таковому у необработанных объективов для контроля среды и транспортных средств (p > 0,05) (n = 6). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Аббревиатура: BVD = расстояние до задней вершины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Влияние суспензии ланостерола на метаболическую активность бычьего хрусталика. Средняя метаболическая активность бычьих хрусталиков, количественно определяемая по относительной флуоресценции метаболизованного показателя после воздействия ланостерола с суспензией на носитель (n = 6). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Иллюстрация 4: Влияние хлорида бензалкония на оптическое качество бычьих линз. Воздействие BAK 0,0075% в течение 10 мин приводило к постепенному увеличению вариабельности расстояния до задней вершины в пределах линз лечения (n = 3). Различия были достоверными между обработанными и средними контрольными линзами через 4 дня после экспозиции, а также для обработанных линз между их предэкспозиционными и постэкспозиционными точками сканирования (p < 0,05). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Сокращения: BVD = расстояние до задней вершины; BAK = хлорид бензалкония. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Влияние бензалкония хлорида на метаболическую активность бычьего хрусталика. Конечная точка метаболической активности определялась через 4 дня после 10-минутного воздействия BAK 0,0075% (n = 3). Изменения метаболической активности достоверно отличались от контрольной группы (p > 0,05). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Сокращение: BAK = бензалкония хлорид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Целью данного протокола является непосредственная оценка воздействия химических веществ или окружающей среды на хрусталик в первичной культуре тканей. Сначала линзы препарируются и сканируются на оптическое качество. Предотвращение загрязнения и обеспечение качества вскрытия имеют решающее значение. Линзы сканируются через периодические промежутки времени для непрерывного мониторинга изменений рефракционной функции по отношению к контрольной группе или предконтактным условиям. Анализ метаболической активности представляет собой конечную точку для определения того, повлияли ли воздействия на клеточный метаболизм. Это важнейшие шаги для определения того, вызывает ли ксенобиотик или состояние окружающей среды значительную токсичность, потенциально приводящую к катаракте, и может ли хрусталик восстановиться после этой обработки.

Линзы сканируются на оптическое качество в соответствующих камерах для культивирования. Хотя линзы также могут подвергаться воздействию исследуемого вещества в своих камерах, одним из ограничений этого протокола является то, что линзы чувствительны к изменениям осмолярности и должны постоянно питаться сывороткой и поддерживаться в соответствующей среде. Это представляет проблему для лечения с длительными интервалами экспозиции или плохой растворимостью в питательной среде²⁸. Поскольку в анализе используется видеосъемка, суспензии с большим количеством нерастворимых частиц могут приводить к рассеянию, что не является показателем эффективности линзы. Условия, в которых были получены репрезентативные данные с использованием суспензии ланостерола, указывают на то, что протокол может допускать определенные суспензии с низкой концентрацией. Несмотря на то, что ранее было высказано предположение, что культивируемый бычий хрусталик может коррелировать с реакциями в хрусталике ^{человека21}, ключевые различия, включая, но не ограничиваясь УФ-фильтрацией, возрастным уплотнением и содержанием фосфолипидов, ограничивают диапазон веществ, для которых этот протокол надлежащим образом используется в доклинических^{испытаниях}.

Тестирование на глазную токсичность обязательно включает в себя большую батарею тестов для определения широкой картины безопасности и переносимости соединения, начиная с испытаний in vitro и на животных, прежде чем перейти к клиническим испытаниям. Анализ бычьего хрусталика имеет высокую пропускную способность по количеству сканирований хрусталика, поскольку метод является неразрушающим и может быть легко выполнен в течение нескольких минут. Тем не менее, тестирование большого количества линз может иметь низкую пропускную способность, так как препарирование хрусталика от глаза может занять много времени. Использование лазерного сканера было более широко использовано для изучения линз морских свинок, рыб, свиней, крыс и цыплят 31,32,33,34,35. В идеале, результаты доклинических испытаний дают представление о безопасности и потенциальном риске для человека. В то время как человеческие линзы были бы наиболее полезны в этом отношении, поскольку в^{некоторых случаях} линзы человека и животных неизбежно будут различаться, линзы, предоставляемые на скотобойне, полезны для баланса между имеющимися ресурсами и этикой. Этот протокол представляет собой чувствительный, воспроизводимый, нетоксичный и объективный метод in vitro для тестирования как клеточных, так и функциональных состояний хрусталика в ответ на лечение.

По сравнению с действующим стандартом in vivo для тестирования глазной токсичности, лазерный сканер линз обеспечивает прямую оценку воздействия потенциально токсичных воздействий на хрусталик. Благодаря общему эмбриологическому тканевому происхождению хрусталика и роговицы, а также функциональному сходству, такому как прозрачность и рефракция, первичная культура хрусталика представляет собой подходящую модель для глазной раздражительности. Предварительные валидационные исследования лазерного сканера линз показали сопоставимые результаты по сравнению с тестом Дрейза и даже показали, что он более чувствителен, не причиняя никакого дискомфорта живому^{животному18}. Эти результаты дополнительно собираются объективно, без интерпретации наблюдателя.

Измерения с помощью лазерного сканера линз имеют непосредственное отношение к естественной функции линзы in vivo. Более того, в отличие от анализов, которые культивируют роговицу или клеточные линии, бычий хрусталик сохраняет свою преломляющую функцию с помощью разработанного метода долговременного культивирования клеток, а анализ оптического качества может быть выполнен при сохранении хрусталика в окружающей среде. В результате, в отличие от других анализов, которые дают одну конечную точку в результате повреждения хрусталика самим тестом, анализ оптического качества может быть выполнен многократно при успешном культивировании хрусталика в течение 1000 ч²⁴ часов.

Поскольку хрусталик в значительной степени лишен органелл, за исключением переднего эпителия и поверхностных клеток корковых волокон, эти клетки выполняют функции органелл для^всего хрусталика. Таким образом, легко понять связь между клеточными изменениями и индукцией катаракты хрусталика, наблюдаемой in vitro и in vivo^15,19. Метаболическая активность хрусталика по существу представляет собой активность переднего эпителиального монослоя. Несмотря на то, что доступны анализы, сходные с резазурином, например, соли тетразолия, включая MTT, XTT, MTS и WST, резазурин обеспечивает нетоксичный и чувствительный анализ, хорошо совместимый с первичной культурой хрусталика. В отличие от МТТ, которая требует солюбилизации осажденных кристаллов, протокол резазурина не включает растворы, которые могут вызвать лизис. Кроме того, исследования на клеточных культурах показали, что конечная точка резазурина более чувствительна, чем анализы на соль тетразолия³⁸.

Этот метод предназначен для моделирования реакции хрусталика как глазной ткани и оптического устройства на различные химические воздействия и воздействия окружающей среды. Двумя репрезентативными соединениями, выбранными для этого исследования, являются хлорид бензалкония, консервант в офтальмологических растворах, и ланостерол, стерол, ранее изученный в рамках усилий по поиску фармацевтических вмешательств для лечения катаракты. Результаты демонстрируют стресс хрусталика в ответ на консервант и отсутствие значительной реакции на ланостерол. Этот метод может быть использован для дальнейшего изучения токсичности потенциальных фармацевтических методов лечения катаракты.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарим Совет по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) и Канадский целевой фонд оптометрического образования (COETF) за средства для этого проекта.